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生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2015, 31(3):165-170
华根霉脂肪酶（Rhizopus chinensis lipase，RCL）
是丝状真菌华根霉（R. chinensis）产生的脂肪酶，其
全长 ORF 由 389 个氨基酸残基构成，包含 26 个氨
基酸的信号肽，94 个氨基酸的前导肽和 269 个氨基
酸的成熟肽［1］。研究表明，RCL 在食品加工领域
有重要应用价值，它能够显著增加面包的比容、改
善面包结构、延缓面包老化，与国内同类产品相
比，RCL 在改善面包和馒头的硬度、弹性、胶着性
和咀嚼性方面效果更佳，能够替代传统的化学改良
剂［2，3］。但是，在食品安全方面，华根霉不是一般
认为安全（general recognized as safe，GRAS）菌株，
因此，它所分泌的脂肪酶不能直接作为食品添加剂。
随着分子生物学的发展，RCL 的基因被克隆，
研究人员在毕赤酵母中实现了 RCL 的重组表达［1，4］，
但是毕赤酵母发酵过程需要添加甲醇，甲醇是一种
剧毒化学物质，微量的甲醇就会导致中枢神经损害、
眼部损害及代谢性酸中毒［5］，因此以甲醇作为诱导
剂生产的 RCL 仍然不能作为食品添加剂。为了实现
收稿日期 ：2014-08-27
基金项目 ：深圳市科技创新委员会技术创新计划项目（CXZZ20130425111508558）
作者简介 ：张谦，男，高级工程师，硕士，研究方向 ：工业微生物及发酵工程 ；E-mail ：qianz50@hotmail.com
华根霉脂肪酶在黑曲霉中的重组表达研究
张谦1  王剑英2  林智2  贾佳2  郭宏涛2
（1. 深圳技师学院，深圳 518116 ；2. 深圳市绿微康生物工程有限公司，深圳 518055）
摘 要 ： 将华根霉脂肪酶基因 RCL 在黑曲霉中进行了重组表达。通过 PCR 技术分别获得黑曲霉 Pgpd 启动子和 RCL-TtrpC
融合片段并克隆至质粒 pCHAMBIA230，构建出 RCL 超表达载体 pCHAMBIA2302∷Pgpd-RCL-TtrpC。将该载体通过冻融法转化农
杆菌 EHA105，进而通过农杆菌介导转化法转化黑曲霉，随机挑选 7 株转化子，进行 PCR 和 Southern 杂交鉴定，均为阳性。对这
7 株转化子进行发酵和脂肪酶活力测定，结果显示，所有转化子均能表达 RCL，其中 T6 转化子的脂肪酶活力最高，达到 71 U/mL。
SDS-PAGE 分析表明，重组表达的 RCL 的分子量约为 37 kD。
关键词 ： 重组表达 ；华根霉 ；脂肪酶 ；黑曲霉 ；根癌农杆菌
DOI ：10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2015.04.024
Recombinant Expression of Rhizopus chinensis Lipase in
Aspergillus niger
Zhang Qian1 Wang Jianying2 Lin Zhi2 Jia Jia2 Guo Hongtao2
（1.Shenzhen Institute Technology，Shenzhen 518116 ；2 .Shenzhen Leveking Bio-engineening Co.，Ltd，Shenzhen 518055）
Abstract: This article carried out the recombinant expression of Rhizopus chinensis lipase（RCL）gene in Aspergillus niger. Promoter
of Pgpd from A. niger and RCL-TtrpC fusing fragment were respectively obtained by PCR and further cloned to plasmid pCHAMBIA2302
to generate the RCL over-expression vector pCHAMBIA2302∷Pgpd-RCL-TtrpC. The resulting vector was introduced into Agrobacterium
tumefaciens EHA105, and then transformed into A. niger through the mediation of A. tumefaciens. Seven randomly selected transformants were
analyzed by PCR and Southern blot. As a result, all the transformants were found to be positive. Then, the seven transformants were subjected
to fermentation and lipase assay, and the results showed that all the transformants secreted recombinant RCL, among which transformant T6
produced the highest lipase specific activity, reaching up to approximately 71 U/mL. The fermentation broth was further analyzed by SDS-PAGE,
which revealed the molecular weight of the recombinant RCL was 37 kD.
Key words: recombinant expression ；Rhizopus chinensis ；lipase ；Aspergillus niger ；Agrobacterium tumefaciens
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2015,Vol.31,No.3166
RCL 在食品加工领域中的广泛应用，必须选用食品
安全菌株来表达 RCL。
黑曲霉（Aspergillus niger）是一种重要的工业微
生物，在工业酶制剂方面应用广泛，可以产生脂肪
酶、淀粉酶、酸性蛋白酶、纤维素酶、果胶酶等 30
多种酶制剂［6］。此外，黑曲霉用于食品酿造和加工
方面已经有上百年的历史，因此被美国 FDA 认定为
GRAS 菌株，可以用于食品和药品级酶制剂的生产［7］。
由于黑曲霉具备出色的蛋白质分泌能力、高度的安
全性、成熟的发酵及后处理工艺，因此，常被作为
宿主菌用以表达异源酶基因［8-10］。然而，目前尚没
有黑曲霉表达 RCL 的研究报道。
本研究构建了黑曲霉甘油醛 -3-磷酸脱氢酶基因
启动子（Pgpd）驱动的 RCL 超表达载体，并利用农
杆菌介导转化法（Agrobacterium tumefaciens-mediated
transformation，ATMT）转化黑曲霉，探索了 RCL 在
黑曲霉中的重组表达方法，研究结果对促进 RCL 在
食品加工领域的应用有重要意义。
1 材料与方法
1.1 材料
黑曲霉（Aspergillus niger，CICC 2475）购至中
国菌种保藏中心 ；大肠杆菌（Escherichia coli）DH5α
和根癌农杆菌（Agrobacterium tumefaciens）EHA105
均为深圳市绿微康生物工程有限公司保存 ；载体
pCHAMBIA2302，由上海交通大学唐克轩教授惠赠 ；
华根霉基因已构建在 pMD18-T（simple）上，命名为
pMD18-T∷RCL 由 本 公 司 保 存 ；Hybond-N+ 尼 龙 膜
和 Southern 杂交试剂盒购至 GE 公司 ；限制性内切
酶、DNA 聚合酶、连接酶、pMD18-T 载体等均购自
TaKaRa 公司 ；其余所有化学试剂均为分析纯 ；所用
引物由 Invitrogen 公司合成。
PCR 仪购至 Bio-Rad 公司 ；5417R 型台式冷冻
离心机购至德国 Eppendorf 公司 ；Southern 杂交管和
杂交炉购至 Thermo Fisher 公司。
1.2 方法
1.2.1 载体构建 以黑曲霉基因组 DNA 为模板，利
用引物 Pgpd-F/ Pgpd-R 扩增黑曲霉的甘油醛三磷酸
脱氢酶启动子（Pgpd）；片段经 Sal I/Pme I 消化克隆
至二元表达载体 pCHAMBIA2302 的相应位点。
以质粒 pAN7-1 为模板，以 TtrpC-F/ TtrpC-R 为
引物扩增构巢曲霉色氨酸合成酶终止子 ；以 pMD18-
T∷RCL 为 模 板， 以 RCL-F/RCL-R 为 引 物 扩 增 华
根 霉 编 码 序 列 RCL ；然 后 以 RCL-F/TtrpC-R 为 引
物，利用重叠延伸 PCR，构建出 RCL-TtrpC 融合片
段 ；片段经 Spe I/Pme I 消化后克隆至二元表达载体
pCHAMBIA2302 的相应位点 ；构建出最终的 RCL 超
表 达 载 体 pCHAMBIA2302∷Pgpd-RCL-TtrpC， 并 经
测序确认正确。所有引物序列，见表 1。
表 1 PCR 引物序列
引物 用途 引物序列（5- 3）
RCL-F RCL 克隆 GAGAACTAGTATGGTTTCATTCAT-
TTCCATTTC
RCL-R RCL 克隆 TACAAACAGCTTCCTTCGTTAATAT-
GATTTCAGTAACGTTAAGTGGATCC
TtrpC-F TtrpC 克隆 GGATCCACTTAACGTTACTGAAAT-
CATC
TtrpC-R TtrpC 克隆 GAGAGTTTAAACTCGAGTGGAGAT-
GTGGAGTGGGCGC
Pgpd-F Pgpd 克隆 GAGAGTCGACAGCATCACCAACAT-
GGGTACCCT
Pgpd-R Pgpd 克隆 GAGAGTTTAAACGAGAACTAGTTGT-
TTAGATGTGTCTATGTGGCG
RCL-SouthF Southern 杂交 ATATTAACAAGAGCGTTCAATGG
RCL-SouthR Southern 杂交 AAAGGAAACCAGCGTGAACTTTG
1.2.2 根癌农杆菌介导的黑曲霉遗传转化 利用冻
融法将构建的 pCHAMBIA2302∷Pgpd-RCL-TtrpC 表
达载体转化根癌农杆菌 EHA105。黑曲霉的转化方
法参照 de Groot 等［11］报道的方法，有部分步骤改
进。首先，将含有 RCL 超表达载体的 EHA105 接种
于 MM 培养基（含卡拉霉素 100 μg/mL，链霉素 100
μg/mL）过夜培养 ；吸取适量的培养物离心去上清，
并用 IM 液体培养基稀释至 OD600=0.15 左右，然后
再培养至 OD600=0.5-0.6。制备新鲜的黑曲霉孢子悬
液，并稀释成 106 个 /mL。随后取上述孢子悬液与
EHA105 等体积混合，均匀涂布到铺有玻璃纸的 CM
平板上。共培养 60 h 后，转移到 PDA 筛选培养基
（含有潮霉素 100 μg/mL，头孢菌素 300 μg/mL）上，
等待转化子长出。将抗性转化子挑出，接种到新的
PDA 筛选培养基，如此连续传代 3 次 ；如稳定传代，
则初步认定为黑曲霉转化子。
2015,31(3) 167张谦等：华根霉脂肪酶在黑曲霉中的重组表达研究
1.2.3 转化子的鉴定 随机挑选 7 株黑曲霉转化子
进行扩大培养，抽提基因组 DNA，利用引物 RCL-
F/TtrpC-R 对转化子进行 PCR 鉴定 ；对 PCR 鉴定为
阳性的转化子，进行 Southern 杂交分析，Southern
杂交的具体步骤参见 GE 公司的 Southern 杂交试剂
盒说明书（RPN3680）。
1.2.4 转化子的发酵 使用 YPD 培养基，在 25℃、
250 r/min 条件下，分别对出发菌 CICC 2475 和鉴定
为阳性的黑曲霉转化子发酵 3 d。然后对发酵产物离
心收集上清，以橄榄油为底物，采用 NaOH 滴定法
测定脂肪酶活力［12］。酶活力定义为每分钟分解底物
生成 1 μmol 脂肪酸的酶量为一个活力单位。
1.2.5 SDS-PAGE 分析 样品的浓缩 ：取发酵液 200
μL，冰浴 10 min，加入三氯乙酸（TCA，50%）50
μL，冰浴 30 min，然后 10 000 r/min 离心 15 min，弃
上清液，沉淀加入 0.2 mL 预冷的丙酮洗涤，然后离
心，弃上清，并置于真空泵抽中干燥 10 min ；备用。
电泳 ：浓缩后的样品溶解于 25 μL 的 Tris 缓冲液中
（100 mmol/L，pH6.8），然后加入 6 μL Loading Buffer
（5×），进行 SDS-PAGE 电泳分析，电泳完毕后用考
马斯亮蓝 R250 染色过夜，然后脱色至获得清晰的
电泳条带为止。
2 结果
2.1 RCL超表达载体的构建
以黑曲霉基因组为模板，PCR 获得黑曲霉 Pgpd
启动子（图 1-A），克隆至 pCHAMBIA2302，构建出
中间载体 pCHAMBIA2302∷Pgpd。然后通过重叠延
伸 PCR 获得 RCL-TrpC 融合片段（图 1-B），克隆至
pCHAMBIA2302∷Pgpd，构建出 RCL 的超表达载体
pCHAMBIA2302∷Pgpd-RCL-TtrpC（ 图 1-C）。 表 达
载体经测序确认正确后转化农杆菌 EHA105，获得
了含 RCL 超表达载体的工程农杆菌 EHA105。
2.2 黑曲霉转化子的鉴定
用 含 有 载 体 pCHAMBIA2302∷Pgpd-RCL-TtrpC
的农杆菌 EHA105 侵染黑曲霉，获得了黑曲霉转化
子，对转化子进行鉴定。随机挑选 7 株转化子，进
行 DNA 的抽提，以转化子的基因组为模板以出发菌
CICC 2475（未转化的黑曲霉菌株）为对照，进行
PCR 鉴定。结果（图 2-B）显示，所有转化子均出
现大小为 1.9 kb 的扩增产物，与阳性对照一致 ；而
未转化的黑曲霉菌株没有出现任何条带，初步证实
所挑选转化子均为阳性转化子。对扩增产物进行测
序，测序结果与目标序列一致，进一步证实所得转
化子的为阳性克隆。
为了分析所得转化子中的目标基因拷贝数和整
合位点，利用 Southern 杂交技术对上述阳性转化子
进行进一步研究。Southern 杂交结果（图 2-C）显示，
所有转化子均为单拷贝，7 株转化子的杂交片段大
小各不相同，表明目标基因的插入位点是随机的。
2.3 黑曲霉转化子的发酵
将上述 7 株转化子进行发酵，发酵完毕后离心，
取上清液进行脂肪酶活力测定。脂肪酶活力测定采
用 NaOH 滴定法，测定结果如图 3。
测定结果显示，各转化子的发酵液中均检测到
了较强的脂肪酶活力，而对照菌（未转化的黑曲霉
菌株）的发酵液中却几乎检测不到脂肪酶活力，说
1.25
kb
1 M
1.25
kb
1 MA
C
B
RB
Pme I
TtrpC
RCL
Spe I
Pgpd
Sal I
PtrpC
Hyg B
TtrpC LB
pCHAMBIA2302-Pgpd::RCL::TtrpC
14.1 kb
A ：Pgpd 的 克 隆，1 ：Pgpd 扩 增 结 果，M ：DL-2000 Marker ；B ：融 合 片 段
RCL-TtrpC 的 扩 增，1 ：RCL-TtrpC 的 扩 增 结 果，M ：DL-2000 Marker ；C ：
RCL 超表达载体 pCHAMBIA2302∷Pgpd-RCL-TtrpC 的图谱
图 1 RCL 超表达载体的构建
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2015,Vol.31,No.3168
TtrpC Hyg B PtrpC Pgpd RCL
RCL-F
RCL-SouthF RCL-SouthR
486-bp probe
trpC-R
1.9-kb PCR product
TtrpC RBLB
+
1.9
kb
9.4
6.4
kb
T1 T2 T3 T4 T5 T6 T7 WT M
+ WT T2T1 T3 T4 T5 T6 T7
A
B
C
A ：PCR 检测和探针制备的方案设计 ；B ：转化子的 PCR 检测 ；C ：转化
子的 Southern 杂交分析 ；T1-T7 ：7 个独立的转化子 ；+ ：阳性对照质粒 ；
WT ：未转化的黑曲霉菌株 ；M ：DL-2000 marker
图 2 黑曲霉转化子的鉴定
80
70
60
50
40 **
**
**
**
**
**
**
30䞦⍫࣋U·mL-1  20
10
0
T1 T2 T3 T4 T5㧼Ṛ T6 T7 WT
T1-T7 ：7 个独立的转化子 ；WT ：未转化的黑曲霉菌株 ；误差线为
标准差（n=3），统计分析用 t 检验（**，P<0.01）
图 3 黑曲霉转化子的发酵酶活力测定
明 RCL 在黑曲霉中得以重组表达，其中产量最高的
T6 转化子可以达到 71 U/mL。
2.4 发酵液的电泳分析
以未转化的黑曲霉为对照，对产量最高的 T6
转化子的发酵液进行 SDS-PAGE 分析，结果（图 4）
显示在箭头所指位置出现了明显的蛋白条带，而未
转化的黑曲霉发酵液中没有，说明这一条带即为重
组表达的 RCL。根据软件 Gel-pro 3.0 计算，该条带
的分子量约为 37.5 kD。
3 讨论
RCL 虽然在食品加工中有重要应用价值，但是
37
kD
T6 WT M
170
kD
130
100
70
55
40
35
25
T6 ：T6 发酵液 ；WT ：未转化的黑曲霉发酵液 ；M ：蛋白质 Marker
图 4 T6 发酵液的 SDS-PAGE 分析
一直没有一种符合食品安全标准的 RCL 生产菌株，
严重限制了 RCL 在食品加工中的应用。针对这一问
题，本研究探索了 RCL 在黑曲霉中重组表达的可能
性，获得了表达 RCL 的黑曲霉基因工程菌，建立了
RCL 在黑曲霉中的重组表达方法，研究结果对构建
RCL 的黑曲霉工业生产菌，促进 RCL 在食品工业中
的应用有重要意义。
本研究选用了黑曲霉自身的强启动子 Pgpd 作为
RCL 的启动子，这有利于实现 RCL 的高效表达。甘
油醛 -3-磷酸脱氢酶基因（gpd）是很多生物的管家
基因，其表达水平较高，有的可以达到胞内可溶蛋
白的 5%［13］，因此其启动子（Pgpd）是较强的启动子，
经常用来启动各种基因的表达［14，15］。黑曲霉自身的
Pgpd 启动子相较于其它异源的 Pgpd 启动子更容易
与黑曲霉相关转录因子结合，实现 RCL 的高效表达。
黑曲霉的遗传转化可以采用 PEG-介导的原生
质体转化法（PMT）和农杆菌介导转化法（ATMT）。
PMT 需要制备原生质体，过程繁琐，转化效率低，
转化子多不稳定 ；而 ATMT 不用制备原生质体，过
程简便、高效，转化子稳定［16］。所以本研究采用
了 ATMT 法转化黑曲霉，并获得了转化子。对随机
挑选 7 株转化子进行鉴定，均为阳性，且为单拷贝，
这与农杆菌介导转化其它真菌的特征一致［11，17］，
单拷贝插入是转化子稳定传代的重要原因。转入的
RCL 表达盒随机插入到黑曲霉基因组中，这也与之
前的研究结果一致［18］。
转化子的发酵和酶活力分析结果证实了 RCL 的
重组表达，不同转化子的酶活力有差异，这可能是
表达盒插入的位点不同导致的［19］。T6 转化子的发
酵酶活力最高，达到 71 U/mL，这与毕赤酵母的表
达水平尚有一定差距［1］，还需要进一步提高黑曲霉
2015,31(3) 169张谦等：华根霉脂肪酶在黑曲霉中的重组表达研究
表达 RCL 的产量。进一步提高黑曲霉的 RCL 产量可
从以下 3 方面改进 ：（1）根据黑曲霉偏爱密码子重
新合成 RCL 基因并进行高效表达，偏好密码子对酶
的表达量影响显著［20，21］。（2）对转化子的发酵条件
进行优化，培养基配方对酶的发酵产量影响较大［22］，
可以采用 RSM 法、主成分分析法等优化培养基配方。
（3）可以将 RCL 表达盒定点整合到黑曲霉基因组中
的转录活跃区，整合位点对基因的表达量影响明显，
当目标基因整合到异染色质区域时，转录量低，甚
至不转录，因此重组酶产量低，甚至没有酶活力［23］，
可以利用同源重组技术将 RCL 整合到转录活跃区。
最后，对 T6 转化子的发酵液进行 SDS-PAGE 分析，
发现其重组表达的 RCL 分子量约为 37.5 kD，与酵
母重组表达的 RCL 分子量相近［1］。
4 结论
本 研 究 以 黑 曲 霉 内 源 的 Pgpd 为 启 动 子 构 建
了 RCL 的超表达载体 pCHAMBIA2300∷Pgpd-RCL-
TtrpC，并采用农杆菌介导转化法，将 RCL 表达盒插
入到黑曲霉基因组中，转化子中 RCL 拷贝数多为单
拷贝，整合方式为随机整合，转化子均能分泌 RCL，
其中 T6 转化子的脂肪酶活力最高，可以达到 71
U/mL，重组表达的 RCL 分子量为 37.5 kD。
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（责任编辑 李楠）