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生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2011 年第 10 期
陆地棉抗病基因同源序列的克隆与分析
简桂良 赵磊 张文蔚 齐放军 王升正
(中国农业科学院植物保护研究所 植物病虫害生物学国家重点实验室，北京 100193 )
摘 要: 根据已知抗病基因 NBS保守区的 P-loop和 GLPL区设计一对简并引物 F1 /R1，以 7 个抗黄萎病陆地棉品种和 2
个感黄萎病品种的基因组 DNA为模板进行 PCR扩增。在 9 个品种中均扩增出 500 bp左右的条带。对目的条带进行回收，连
接、转化克隆得到 350 个阳性克隆，进行测序。在 8 个棉花品种中克隆到 74 条具有完整开放读码框的棉花 RGAs序列。这 74
条序列共有 64 种不同的基因型，有 10 条与其他品种中的 RGAs序列相同。用 MEGA软件对 8 个棉花品种的 74 条 RGA序列
以及 12 个已知的抗病基因的 NBS区域进行聚类分析，可分为 4 类;4 类 RGAs之间的相似性较低，各类之内的 RGAs虽然来自
不同品种，氨基酸序列的相似度却非常高。推测各大类中相似性较高的序列分别属于同一个基因家族，从位点上说可能处于
同一个基因簇。
关键词: 棉花 抗病基因同源序列 NBS
Cloning and Analysis of NBS Type Resistance Gene Analogs in
Upland Cotton(Gossypium hirsutum)
Jian Guiliang Zhao Lei Zhang Wenwei Qi Fangjun Wang Shengzheng
(The State Key Laboratory for Biology of Plant Diseases and Insects Pest，Institute of Plant Protection，CAAS，Beijing 100193)
Abstract: A specific fragment of about 500 bp was cloned from the genomic DNA of the nine identified upland cotton(Gossypium
hirsutum)by PCR degenerate primer designed according to the conserved domains P-loop and GLPL in the NBS region of reported R
genes． The fragments were recycled and inserted into pGM-T vector，and then transformed into E． coli DH5α． 350 recombinations were
obtained through colony RPC and restriction digestion identification． The clones are sequenced and 74 RGAs with complete open read-
ing frames(ORF)from eight varieties of cotton were obtained． Comparing with the reported R genes，the 74 RGAs all contain P-loop
(Kinase1a) ，Kinase2，Kinase3a，GLPL region and motif RNBS-A，B，C defined by Meyers． Cluster analysis of their putative amino acid
showed that the RGAs sorted into two distinct types，TIR-NBS type and nonTIR-NBS type． The TIR type RGAs all contain the RNBS-
A-TIR motif while the nonTIR type RGAs all contain RNBS-A-nonTIR motif． This result consists with the early report that NBS-LRR
gene has two major groups in dicotyledon． The deduced amino acid of the RGAs have high similarity with the reported R genes． Non-
TIR type RGAs have asimilarity of 32% － 50% with L6，M，Gro1-4，N，while TIR type RGAs have a similarity of 23. 2%% － 56. 5%
with I2C-1，Mi-1. 1，RPM1，RPP8，RPS2，RPS5，XA1，PRf． Analysis of molecular variance(AMOVA)indicated that the genetic varia-
tion mainly exist within varieties rather than among varieties．
Key words: Gossypium hirsutum Resistance gene analog NBS
收稿日期:2011-04-02
基金项目:国家转基因生物新品种培育科技重大专项子课题(2008ZX005-004) ，国家公益性农业科研专项(3-19)
作者简介:简桂良，男，研究员，研究方向:棉花病害;E-mail:jianguiliang@ yahoo． com． cn
黄萎病是一种土壤传播的维管束系统性全生育
期病害，可对棉花生产造成重大影响。陆地棉是我
国主要栽培的棉花品种，但对黄萎病的抗性一直不
理想［1，2］。根据植物抗病基因具有高度保守区域的
序列设计引物扩增抗病基因同源片段(RGA)的候
选基因法，克隆棉花中的 RGA 序列，作为分子标记
整合到植物分子连锁图谱中，或将其作为探针筛选
基因组文库，获得候选抗病基因不失为一条克隆抗
病基因的捷径［3 － 40］。近年来，我国陆续培育成功几
个抗黄萎病的陆地棉品种，以及对黄萎病达到高抗
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2011 年第 10 期
的新品系［41］。
为明确这些品种(系)抗黄萎病的分子机制，以
及这些抗性品种(系)与植物抗病基因保守区域的
相关性，以期从中克隆抗黄萎病基因，或获得相关分
子标记，以 9 个在北京田间黄萎病圃连续 3 年进行
黄萎病抗性鉴定表现出抗病性差异明显的陆地棉品
种为研究材料，其中 NJ0703、NJ0705 和宁 4-14 的发
病率均小于 20，病情指数和相对病情指数小于
10，为高抗(HR)黄萎病棉花品种;GK44-1、文 5
抗病性较高，相对病情指数在 10 － 20 之间，抗性
分级为抗病(R) ;33B 和 BD18 相对病指在 20 －
30 之间，为耐病(T) ;新陆早 7 号和万 217 相对
病指大于 70，其中新陆早 7 号三年的发病率甚至
达到 100，抗性分级为感病(S) (另文发表)。以
上述 9 个陆地棉品种基因组 DNA 为模板进行
PCR 扩增，对获得的抗病基因同源序列的生物信
息学进行深入分析。
1 材料与方法
1. 1 材料
1. 1. 1 供试品种 选择 7 个抗黄萎病性能比较好
的棉花品种:GK44-1，NJ0703，NJ0705，33B，BD18，
文 5，宁 G-14;两个感黄萎病品种:新陆早 7 号，
万 217。
1. 1. 2 菌种及质粒 大肠杆菌 E. coli DH5α 由本
实验室保存;载体使用天根生化科技有限公司的
pGM-T Vector。
1. 2 方法
1. 2. 1 棉花总 DNA 的提取 棉花总 DNA 的提取
使用天根新型植物基因组 DNA提取试剂盒。
1. 2. 2 PCR引物的设计与合成 根据已克隆的抗
病基因 NBS保守区域 P-loop(GGVGKTT)和“GLPL”
(GLPLAL)设计一对简并引物。正向引物 F1:5-
GGIGGIRTIGGIAAIACIAC-3，反向引物 R1:5-AGI-
GYIAGIGGIAGICC-3(I =次黄嘌呤)。引物由英骏
生物技术有限公司合成。
1. 2. 3 PCR扩增 反应体系:反应液体积 20 μL，
含 10 × PCR Buffer(Mg2 + Free)2 μL，25 mmol /L
MgCl2 2 μL ，2. 5 mmol /L的 dNTP 2 μL，50 ng /μL模
板 DNA 1 μL，5 μmol /L的正反向引物各1 μL，5 U/μL
Taq 酶 0. 2 μL，ddH2O 10. 8 μL。Taq 酶、dNTP 为
TaKaRa 产品。PCR 反应在 Eppendorf Mastercycler
Gradient PCR 仪(Eppendorf AG，22331 Hamburg)上
进行。扩增条件:94℃预变性 5 min;94℃ 30 s，45℃
30 s，72℃ 1 min，40 个循环;72℃延伸5 min;4℃
保存。
1. 2. 4 PCR 扩增产物回收与克隆 PCR 产物经
2%琼脂糖凝胶电泳检测，利用多功能 DNA 纯化回
收试剂盒(Bioteke)回收目的片段，连接至 pGEM-T
Vector(天根生化) ，16℃连接过夜。连接产物热激
法转化大肠杆菌 DH5α 感受态细胞，均匀涂布与含
有 IPTG 和 X-gal 的 Amp(100 mg /L)LB 平板上，
37℃培养过夜。挑选白斑，于含 Amp的 LB培养基，
37℃ 200 r /min震荡培养过夜，TIANprep Mini Plas-
mid Kit(天根生化)试剂盒提取质粒，EcoR I 单酶切
对插入片段进行酶切验证。
1. 2. 5 测序与序列分析 有插入片段的阳性克
隆送上海英骏生物技术有限公司测序。序列分
析首先使用 NCBI 的 VecScreen 程序去除测序片
段中的载体序列，在 GenBank中利用 BLAST程序进
行同源性搜索，利用 DNAMAN、DNAStar、MEGA 等软
件对编码的氨基酸序列进行 ORF 查找、R 基因保守
序列的比较以及 R 基因氨基酸序列同源性比较等
分析。
2 结果
2. 1 棉花基因组中 NBS-LRR 类 RGAs 的扩增与
鉴定
根据已知的 NBS-LRR 型 R 基因中 P-loop 与
GLPL区之间的距离约为 170 个氨基酸(510 bp)
(Deng，2000)。根据 NBS-LRR 型 R 基因保守结构
域 P-loop和 GLPL设计简并引物 F1 /F2，对 9 个棉花
品种的 DNA 进行 PCR 扩增。体系优化后，F1 /F2
在 9 个品种中均扩增出大小约 500 bp 的特异扩增
条带(图 1) ，与所用引物预期的扩增片段大小一致。
因此初步认为这些扩增产物是棉花抗病基因同源
序列。
使用百泰克多功能 DNA 纯化回收试剂盒对各
个棉花品种扩增到的 500 bp 左右的目的条带进行
切胶回收，琼脂糖凝胶电泳检测回收的目的片段。
201
2011 年第 10 期 简桂良等:陆地棉抗病基因同源序列的克隆与分析
1. 100 bp DNA ladder;2． GK44-1;3． NJ0703;4． NJ0705;5．
33B;6． BD18;7．文 5;8．宁 G-14;9．早 7;10．万 217
图 1 PCR 扩增产物电泳结果
回收的片段的浓度较高，大小为 500 bp 左右，回收
效果理想。将回收得到的 DNA 目的片段(500 bp
左右)分别与载体 pGM-T进行连接。将连接产物转
化大肠杆菌 DH5α感受态，每个品种涂布一个 X-gal
平板做蓝白斑筛选，经过 16 － 24 h的 37℃恒温培养
后，经 α-互补现象检查。含氨苄的 LB 琼脂平板上
产生了大量的白色的菌落，只有少数的蓝色的菌落
出现，说明对引物对各品种棉花中的 PCR扩增到的
DNA片段进行的克隆获得了成功，共获得了数百个
单克隆菌落。挑出每个平板的白斑重组子，摇菌
过夜后提质粒，对质粒 DNA 进行 Eco I 单酶切检
测，得到 500 bp 左右的酶切片段，说明插入 pGM-
T载体中的片段大小与目的片段大小相符。最后
共鉴定得到了 350 个阳性重组子，进行测序
分析。
2. 2 阳性克隆的测序结果分析
对 350 个阳性克隆进行测序，用 NCBI 的
VecScreen 程序去除载体序列，得到 350 个阳性
克隆的 DNA 序列结果(表 1)。利用 BLASTX 程
序鉴定得到 87 条具有完整开放阅读框(ORF)和
NBS 功能域的 DNA 序列，确认为棉花 RGAs。针
对具有完整 ORF 和 NBS 特征功能域的 DNA 序
列，编号见表 2，其他序列不再涉及。其中 7 个棉
花抗黄萎病品种和 1 个棉花感黄萎病品种中克
隆到了具有完整 ORF 和 NBS 功能域的 RGA 序
列，而感病品种万 217 中没有克隆出能够通读的
具有 NBS 功能域的 DNA 序列。
表 1 各棉花品种中阳性克隆序列分析
品种名 具有 ORF的序列数 移码突变的序列数 单引物扩增序列数 总数
GK44 － 1 17 9 19 45
NJ0703 16 3 0 19
NJ0705 6 3 20 29
33B 13 8 11 32
BD18 6 5 21 32
文 5 10 26 40 76
宁 G-14 7 6 24 37
早 7 12 8 26 46
万 217 0 8 26 34
总数 87 76 187 350
87 条具有完整 ORF和 NBS特征功能域的 DNA
序列中，有部分是相同的或重复序列。分析时去除
每个品种内的重复序列，但保留不同品种中扩增出
的相同的序列。因此得到 8 个棉花品种共 74 条
RGAs，共 64 种不同基因型，提交 GenBank，收录号
(FJ69805 － FJ69810，GQ227416 － GQ227473)。
其中品种间相同的序列为 GK81、A16、33B83、
BD29、WEN102、ZAO12 核苷酸序列相同;GK40、
NJ41、33B124、BD19 核苷酸序列相同;GK3、N16、
ZAO47 核苷酸序列相同;NJ4、BD9 核苷酸序列
相同。
2. 3 棉花抗病基因同源序列的聚类分析与相似性
比较
用 MEGA软件对 8 个棉花品种的 75 条 RGA序
列以及 12 个已知的抗病基因的 NBS 区域进行聚类
分析。用于序列比对的抗病基因及其类别见表 3。
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表 2 各棉花品种中克隆得到的 RGAs编号
品种 编号
GK44 － 1(15 种) GK3，GK6，GK9(GK102) ，GK11，GK22，GK40，GK71，GK74，GK75，GK81(GK99) ，GK83，GK87，
GK91，GK92，GK104
NJ0703(12 种) A2(A135，A139) ，A5(A6) ，A9，A11，A12，A16(A115) ，A19，A22，A101，A112，A114，A119
NJ0705(6 种) NJ4，NJ29，NJ35，NJ41，NJ48，NJ49
33B(11 种) 33B6，33B50，33B83 (33B127，33B129) ，33B102，33B103，33B101，33B102，33B105，33B114，
33B116，33B122，33B124，33B125
BD18(5 种) BD2，BD9，BD19，BD20，BD29(BD65)
文 5(9 种) WEN32，WEN38，WEN62，WEN67，WEN102(WEN103) ，WEN109，WEN115，WEN116，WEN117
宁 G-14(5 种) N1(N29，N30) ，N7，N8，N16，N32
早 7(11 种) ZAO2，ZAO12(ZAO26) ，ZAO13，ZAO21，ZAO23，ZAO24，ZAO29，ZAO34，ZAO38，ZAO39，ZAO47
编号列中的括号表示该序列与前面的一条序列重复
表 3 用于序列比对及聚类的已知抗病基因
NBS结构域类型 基因名称 基因功能 登录号
TIR类 Gro1 － 4 马铃薯抗线虫基因 AY196151
L6 亚麻抗锈病基因 U27081
M 亚麻抗锈病基因 U73916
N 烟草抗花叶病毒基因 AB453947
nonTIR类 I2C-1 番茄抗枯萎病基因 AF004878
Mi-1. 1 番茄抗根结线虫基因 AF039681
RPM1 拟南芥抗细菌性斑点病基因 X87851
RPP8 拟南芥抗霜霉病基因 AF089710
RPS2 拟南芥抗细菌性斑点病基因 U14158
RPS5 拟南芥抗霜霉病基因 AF074916
Xa1 水稻抗白叶枯病基因 AB002266
Prf 番茄抗青枯病基因 U65391
对棉花 RGAs 的氨基酸序列聚类分析可以看
出，克隆到的棉花 RGAs根据其氨基酸序列可分为 4
类(图 2)。所有 RGAs 的氨基酸序列相似性是
20. 0% －100%，各品种中 RGAs 的氨基酸序列相似
性见表 4。序列间的相似性变化幅度比较大，反映
出克隆的棉花 RGAs比较丰富。
在第Ⅰ类中包含 28 条 RGAs(来自 8 个棉花品
种)和两条已知抗病基因(I2C-1、Xa1)的 NBS 序列，
这 28 条 RGAs非常紧密地聚在一起，其氨基酸序列
相似性也较高，在 95. 3% － 100%之间。共有 11 条
氨基酸序列相似性达到 100%，它们来自 7 个棉花
品种，这 11 条 RGAs 分成 6 种基因型(基因型 1:
GK6;基因型 2:GK92;基因型 3:A16，GK81，33B83，
BD29，WEN102，ZAO12;基因型 4:A112;基因型 5，
A119;基因型 6:NJ35)。各基因型之间的核苷酸一
致性在 99. 4% － 99. 8%之间，由于密码子的简并性
翻译出相同的氨基酸序列。
第Ⅱ类中包含 10 条 RGAs(来自 8 个棉花品
种)和 3 条已知抗病基因(Prf、Mi-1. 1、RPM1)的
NBS序列，10 条 RGAs 的氨基酸序列之间相似性
在 94. 1% － 100%。有 4 条 RGAs 的氨基酸序列
相似性为 100%，来自 3个棉花品种，分为两种基因型
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Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ类为 nonTIR类，Ⅳ类为 TIR类
图 2 棉花 RGAs与已知植物抗病基因 NBS
区域氨基酸序列聚类分析
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生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2011 年第 10 期
(基因型 1:GK3，N16，ZAO47;基因型 2:ZAO29) ，不
同基因型之间的核苷酸一致性是 99. 8%，由于密码
子的简并性翻译出相同的氨基酸序列。
表 4 各棉花品种中氨基酸序列相似性
棉花品种 氨基酸相似性(%)
GK44 － 1 24. 1 － 100
NJ0703 23. 9 － 100
NJ0705 25. 5 － 99. 4
33B 20. 0 － 99. 4
BD18 23. 6 － 98. 2
文 5 22. 4 － 100
宁 G-14 23. 9 － 99. 4
早 7 22. 3 － 99. 4
第Ⅲ类中包含 18 条 RGAs(来自 8 个棉花品
种)和 3 条已知抗病基因(RPP8、RPS5、RPS2)的
NBS序列。其中 A5 和 A11 聚在一小类中，氨基酸
序列相似性是 79. 3%;33B101 和 GK71 聚为一小
类，氨基酸序列相似性是 82. 5%;其他 14 条 RGAs
聚为一小类(来自 7 个棉花品种中) ，氨基酸序列相
似性在 95. 2% － 100%，这一小类中有 5 条氨基酸
序列相似性达到 100%(来自 5 个棉花品种) ，分为 4
个基因型(基因型 1:A101;基因型 2:NJ4，BD9;基因
型 3:33B122;基因型 4:WEN38) ，各基因型之间的
核苷酸一致性在 99. 6% － 99. 8%范围内，由于密码
子的简并性翻译出相同的氨基酸序列。
第Ⅳ类中包含 18 条 RGAs(来自 8 个棉花品
种)和 4 条已知抗病基因(L6、M、Gro1-4、N)的 NBS
序列。其中 33b124、N1、ZAO2 和 33B50 聚为一小类
(来自 4 个棉花品种) ，它们之间的氨基酸相似性为
90. 5% － 94. 7%;A19、WEN115、GK87、33B125、
GK91 和 NJ29 聚为一小类(来自 5 个棉花品种) ，它
们之间的氨基酸相似性为 77. 6%－ 100%，这一小类
中 A19 和 WEN115 核苷酸一致性 99. 8%，由于密码
子的简并性翻译出相同的氨基酸序列;其他 8 条
RGAs 聚为一小类，它们之间的氨基酸相似性为
98. 2%－ 100%，其中有 4 条 RGAs 的 RGAs 的氨基
酸序 列 相 似 性 为 100% (GK40，NJ41，BD19，
33B124) ，它们的核苷酸序列相同，来自 4 个不同的
棉花品种。
3 讨论
NBS-LRR类抗病基因是抗病基因中最大的一
类，已知的 70 多种植物抗病基因中有 50 多种是
NBS-LRR 类［19，27，39，40，44］。也有从棉花中克隆 NBS
类型抗病基因类似物的报道［19，28］。本实验室曾从
一个抗黄萎病的品系中克隆出多个 RGA，并对其进
行了分析［35］，但由于陆地棉缺乏抗病品种，对多个
抗黄萎病品种克隆 RGA 的报道尚未见。本研究从
棉花中克隆到 74 条具有开放读码框的 NBS 型
RGAs，与已知的 NBS-LRR 类抗病基因有较高的同
源性，都具有 NBS-LRR类抗病基因所特有的保守结
构域，如 P-loop(Kinase1a)、Kinase2、Kinase3a 3 个模
体和 GLPL区。棉花是双子叶植物，克隆到的棉花
RGA也分为 TIR 和 nonTIR 两大类，与双子叶植物
中存在 TIR-NBS-LRR和 nonTIR-NBS-LRR两类抗病
基因的研究一致(Meyers，1999)。同时，两类 RGAs
都具有 Meyers 所定义的 RNBS-A、B、C 3 个模体，
TIR 类 RGAs 具有 RNBS-A-TIR 结构特点，nonTIR
类 RGAs具有 RNBS-A-nonTIR结构特点。
1996年 Kanazin［13，14］报道 RGA 以来，立即引起
各国学者的的注意，1998 年以来，每年都以几十篇以
上的研究报告发表［3 － 40，42 － 44］。被研究的植物已涉及
20多种，其中以水稻、大麦类为主。有些 RGA被定到
连锁图谱上，成为某些抗病基因的分子标记，有些
RGA通过 RACE技术得到了候选全长基因。我国张
丽英等［34］从辣椒中克隆到一条 RGA 与番茄抗线虫
基因 Mi-1. 2 的氨基酸和核苷酸序列相似性均达到
99%，已确认为辣椒抗根结线虫基因的一部分。
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265-277．
·书讯·
《Essentials of Nucleic Acid Analysis:A Robust Approach》
核酸分析精要:一种稳健的方法
核酸的序列、多样性和丰度分析是现代生物学的基础。鉴于核酸分析在法医鉴定和食品安全领域的常
规应用，稳健的分析方法是必不可少的。
《Essentials of Nucleic Acid Analysis:A Robust Approach》一书由英国皇家实验室(Laboratory of the Gov-
ernment Chemist，LGC)的 Keer JT，Birch L．等科学家组织编写，并于 2008 年由英国皇家化学学会出版发行。
主要论述了 20 年来，核酸分析在法医科学、病原体鉴定、食品检验和转基因生物检测、个性化医疗和诊断等
方面的广泛应用，共分为 10 章。
第 1 章介绍了工作在 ISO17025 和类似环境的有效分析方法。第 2 章讨论了分子生物学实验室的质控，
并且提供了与 ISO和其他标准相关的指南，强调了量值溯源的必要性。第 3 章介绍了方法确认的一般原则，
以及精确性、准确性、检测限、定量限和测量不确定度等概念，同时列举了荧光定量 PCR 方法确认的例子。
接下来的 4 章包括了 DNA提取、DNA定量、PCR可靠性和有效性的影响因素和荧光定量 PCR。DNA定量这
章是特别有帮助的，强调了在研究中方法材料相匹配的重要性。PCR这章为处理动物细胞中的抑制物做了
清晰的说明。荧光定量 PCR这章清楚的解释了现行的不同方法，并且对比了荧光定量 PCR仪器。第 8 章描
述了多重 PCR和全基因组 PCR。随后的一章是关于 RNA的，更多描述了实验过程，从提取、定量、定性检测
到 qPCR等。最后一章是基因芯片用于基因表达研究方面的论述。
与以往出版的核酸类图书相比，该书主要介绍了 DNA应用过程中的质量保证与确认问题，并且详细阐
述了 DNA提取、样品分析、DNA定性和定量检测等实验方法，并且增加了实时定量 PCR和芯片技术，提出了
确保实现结果正确性的潜在可能。
由此，将此书推荐给核酸分析实验室的科研人员，为实验室的建设，管理及高质量的 DNA测量提供一个
坚实的基础。
(李亮 中国计量科学研究院)
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