全 文 ：收稿日期:2014-04-25 优先出版时间:2015-07-27
优先出版网址:http:/ /www． cnki． net /kcms /detail /44． 1110． s． 20150727． 1431． 013． html
作者简介:赵 芹(1982—)，女，副研究员，博士，E-mail:zhaoqin0802@ 126． com
基金项目:国家自然科学青年基金(31311643);广州市珠江科技新星项目(2013086)
赵 芹，谢大森，何晓明，等．基于 NBS-LＲＲ类 Ｒ基因保守结构域克隆瓠瓜抗病基因同源序列［J］．华南农业大学学报，2015，36(5):92-98．
基于 NBS-LＲＲ类 Ｒ基因保守结构域克隆
瓠瓜抗病基因同源序列
赵 芹，谢大森，何晓明，罗少波，彭庆务
(广东省农业科学院 蔬菜研究所，广东 广州 510640)
摘要:【目的】分离鉴定瓠瓜 Lagenaria siceraria抗病种质的抗病基因同源序列(Ｒesistance gene analogs，ＲGAs)，为瓠
瓜功能性抗病基因的克隆及分子标记辅助育种奠定基础．【方法】根据已知核苷酸结合位点和富亮氨酸重复
(Nucleotide binding site and leucine rich repeat，NBS-LＲＲ)类抗病基因保守区设计简并引物，从“大籽瓠”抗性材料
基因组 DNA中分离抗病基因同源序列，并利用生物信息学软件进行长度变异、保守结构域、同源比对与系统进化
分析．【结果和结论】基于同源克隆策略，获得 23 条瓠瓜 NBS抗病同源序列，命名为 HNB1 ～ HNB23，GenBank 登录
号为 KJ908192 ～ KJ908214．序列分析及同源比对结果表明，这些 ＲGAs 长度变异在 242 ～ 261 nt 之间，18 条序列具
有连续开放阅读框(Open reading frame，OＲF)，推导氨基酸序列具有 P-loop、Kinase-2a典型 NBS类 Ｒ基因保守结构
域;核苷酸序列相似性为 41． 5% ～ 98. 8%，氨基酸序列相似性为 21． 5% ～ 100． 0%;利用 NCBI Blast同源搜索发现，
与其他植物尤其是冬瓜、黄瓜、葫芦及丝瓜的已知 Ｒ基因具有 40% ～100%相似性;氨基酸序列聚类分析将其分为
5 个组;同源进化分析表明，23 条瓠瓜 ＲGAs均为 non-TIＲ-NBS-LＲＲ类 Ｒ基因，与推导氨基酸序列多重比较结果一
致．
关键词:瓠瓜;NBS-LＲＲ类;抗病基因同源序列;简并引物;序列分析
中图分类号:S642． 9 文献标志码:A 文章编号:1001-411X(2015)05-0092-07
Cloning of resistance gene analogs from Lagenaria siceraria based on
conserved domains of NBS -LＲＲ type Ｒ gene
ZHAO Qin，XIE Dasen，HE Xiaoming，LUO Shaobo，PENG Qingwu
(Vegetable Ｒesearch Institute，Guangdong Academy of Agricultural Sciences，Guangzhou 510640，China)
Abstract:【Objective】Isolation and identification of resistance gene analogs (ＲGAs) of Lagenaria
siceraria would lay the foundation for a further cloning of disease resistance genes and marker-assisted se-
lection (MAS)of resistance breeding． 【Method】According to the conserved domains of nucleotide bind-
ing site and leucine rich repeat (NBS-LＲＲ)type of disease-resistance genes in most known plants，de-
generate primers were designed and synthesized to isolate resistance gene analogs from genomic DNA of
bottle gourd resistant variety“Dazihu”，with length variation，conservative domain，homology alignment
and phylogenetics analyzed by various bioinformatics softwares． 【Ｒesult and conclusion】Twenty three
ＲGAs were obtained and named as HNB1 － HNB23，and the GenBank accession numbers were
KJ908192 － KJ908214． Sequences analyses and alignment results indicated that the full-length of ＲGAs
varied from 242 nt to 261 nt，and the deduced amino acids sequences contained typical conserved do-
mains of NBS Ｒ genes，such as P-loop and Kinase-2a． Eighteen sequences had continuous open reading
frames (OＲFs)． These ＲGAs showed a great homologous differences with the similarity ranging from 41．
5% to 98． 8%，and the amino acid sequence similarity varied from 21． 5% to 100． 0% ． At the nucleo-
tide level，the sequence identity of 23 ＲGAs ranged from 40% to 100% with the cloned NBS Ｒ genes
from other plants，especially cucumber，wax gourd，luffa and calabash． The result of clustering analyses
showed that all ＲGAs were divided into 5 groups． These ＲGAs were ranked into non-TIＲ-NBS-LＲＲ type
by homology and evolution analyses，which was consistent with the classification result based on multiple
alignment of deduced amino acid sequences．
Key words:Lagenaria siceraria;NBS-LＲＲ type;resistance gene analogs;degenerate primer;sequence
analysis
瓠瓜 Lagenaria siceraria，别名瓠子、蒲瓜，为葫芦
科(Cucurbitaceae)一年生攀缘草本植物，原产于印度
与热带非洲［1］．瓠瓜在我国栽培种植历史悠久，类型
品种十分丰富，主要分布于长江流域与长江以南地
区．瓠瓜易栽培，产量高，嫩瓜柔软多汁，风味可口，
老瓜供制容器与工艺品［2］，是华南地区度淡的重要
蔬菜，年种植面积 6 666． 7 hm2 以上，除满足本地市
场外，还销往港澳及冬季北运［3］．目前对瓠瓜种质资
源研究较少，仅在种质遗传多样性分析［3-7］方面有一
些报道．
随着蔬菜产业结构的调整，瓠瓜的种植面积不
断扩大．白粉病与病毒病是瓠瓜生产上的两大主要
病害．病毒病复合侵染导致产量与品质急剧下降，商
业价值降低［8］，但目前生产上病毒病难以防治．白粉
病在瓠瓜整个生育期均可侵染发生，连作田块发病
更盛［9］，几乎所有瓠瓜品种不抗白粉病，药剂防治与
栽培改良效果不佳． 另有一些瓠瓜种质对西瓜枯萎
病免疫，可用作砧木嫁接栽培［10］．因此挖掘新的抗性
基因资源是研究病原物与寄主植物之间互作的分子
机制、实施抗病分子设计育种的基础性工作，也是病
害控制最安全有效的途径［11-12］． 广东省农业科学院
蔬菜研究所瓜类育种一室通过多年种质资源引进、
收集和创新，保存了丰富的瓠瓜资源，并育成了一些
优良品种，因此利用我们的资源优势，克隆分析与研
究瓠瓜抗病基因，对提高瓠瓜抗病性及阐明瓠瓜抗
病分子机制具有重要意义．
抗病基因克隆是植物分子生物学研究领域的热
点之一．迄今已分离克隆了 70 多个抗病基因［13］，但
主要是通过遗传表型分析如转座子标签技术和以遗
传图谱为基础的图位克隆技术获得的［14］．这些 Ｒ 基
因编码产物存在许多高度保守区域，以此为基础将
抗病基因分为 8 类［15］，其中核苷酸结合位点和富亮
氨酸重复(Nucleotide binding site and leucine rich re-
peat，NBS-LＲＲ)类抗病基因在基因组中含量最为丰
富［16-17］．抗病基因同源序列(Ｒesistance gene analogs，
ＲGAs)是一类呈簇分布于植物基因组中，在一定程
度上反映抗病基因特点的大基因家族［18］，它们本身
可能为 Ｒ 基因或假基因一部分或与 Ｒ 基因紧密连
锁，扩增抗病同源序列已成为标记、定位和克隆植物
Ｒ 基因的有效手段［18-19］． 因此根据这些抗病基因的
保守序列设计引物，PCＲ扩增同源序列，成为克隆该
类抗病基因的有效途径，已在大豆、香蕉、白菜和黄
瓜等多种作物中广泛应用［20-23］． 本研究以瓠瓜抗性
材料“大籽瓠”为试材，同源扩增 NBS 类抗病基因序
列，为进一步克隆瓠瓜的功能性抗病基因以及开发
分子标记辅助育种提供研究基础，对阐明瓠瓜抗病
分子机制及培育抗病品种具有重要的指导意义．
1 材料与方法
1． 1 植物材料
瓠瓜抗性种质“大籽瓠”，采自山西平遥，由广东
省农业科学院蔬菜研究所保存． 2013 年 8 月播种于
温室营养盘内，待幼苗长至 2 ～ 3 片真叶，采集叶片
保存于 － 70 ℃冰箱备用．
1． 2 主要试剂
Ex Taq DNA聚合酶与 pMD 19-T 载体试剂盒为
大连宝生物(TaKaＲa 公司)有限公司产品;琼脂糖、
DNA回收试剂盒、Amp 抗生素、dNTPs、DNA marker、
大肠埃希菌 DH5α感受态均为广州鼎国生物技术有
限公司产品;其余试剂为国产分析纯．
1． 3 瓠瓜基因组 DNA提取与引物设计合成
瓠瓜叶片基因组总 DNA 提取采用改良 CTAB
法［24］，质量浓度为 10 g·L －1的琼脂糖凝胶电泳及纳
米紫外分光光度计(GENEQUANT，Eppendorf，Germa-
ny)检测 DNA 浓度及纯度． 参考斑茅、黄瓜、芒果及
辣椒等［19，25-27］NBS 类抗病基因保守结构域，设计合
成简并引物． 引物序列为 NBS-F:5-GGYATGGGNG-
GYMTHGGNAAＲAC-3，NBS-Ｒ:5-CCANACATCATC-
MAG SACAA-3，其中 Y = C /T，N = A /G /C /T，Ｒ =
A /G，M = A /C，S = C /G，H = A /T /C，引物由广州英
骏生物技术有限公司合成．
1． 4 PCＲ扩增与克隆
以提取的瓠瓜基因组总 DNA 为模板进行 PCＲ
扩增，PCＲ反应在 ABI Applied 公司 GeneAmp system
9700 型扩增仪上进行．反应体系总体积为 25 μL，包
括:2. 5 μL 10 × Ex buffer (含 MgCl2)、1 U Ex Taq
DNA聚合酶、0． 2 mmol·L －1 dNTPs、0． 4 μmol·L －1
39第 4 期 赵 芹，等:基于 NBS-LＲＲ类 Ｒ基因保守结构域克隆瓠瓜抗病基因同源序列
引物和 50 ng模板 DNA．反应程序为:94 ℃预变性 3
min;94 ℃变性 30 s，50 ℃退火 30 s，72 ℃延伸 30 s，
反应 35 个循环;最后 72 ℃延伸 10 min． PCＲ 产物用
质量浓度为 10 g·L －1琼脂糖凝胶进行电泳，检测结
果在 GeneGeniusBio Imaging System (Bio-Ｒad)凝胶
成像系统下观察和拍照．
1． 5 PCＲ产物的纯化、克隆与测序
PCＲ产物回收纯化，克隆至 pMD19-T Vector，转
化至 DH5α感受态细胞，涂布在固体 LB(含 Amp 100
μg·mL －1)培养基上，37 ℃条件下倒置培养过夜，挑
取白斑，利用 M13 通用引物进行菌落 PCＲ 检测，阳
性克隆菌液送至广州英骏生物技术有限公司测序．
1． 6 目的片段序列测定及序列同源性分析
测得序列利用 NCBI Vecscreen 程序搜索并去除
两端载体序列，然后在 GenBank 中用 BLASTX 和
BLASTN工具进行核苷酸序列和氨基酸序列间的同
源比对搜索，结合 GenBank 公布的其他物种 NBS-
LＲＲ类抗病基因蛋白序列，利用 DNAstar 软件进行
多重序列比对，分析各序列长度、G + C 含量、变异位
点、相似性、遗传分歧及序列比对;利用 NCBI OＲF
finder程序进行开放阅读框搜索;最后用 MegAlign构
建系统发育树研究其进化关系． 用于参比的 Ｒ 基因
有:番茄 Solanum lycopersicum Mi-1． 1(AF039681)、烟
草 Nicotiana tabacum N(BAD12594)、亚麻 Linum us-
itatissimum M(U73916)、拟南芥 Arabidopsis thaliana
ＲPS2 (U14158 )、甜 瓜 Cucumis melo FOM- 2
(AY583855)、番茄 I2C-1 (AF004878)、亚麻 L11
(AF093641) ，其中 Mi-1． 1、ＲPS2、FOM-2 和 I2C-1 属
于 non-TIＲ-NBS-LＲＲ 类的抗病基因，而 N、M 与 L11
属于 TIＲ-NBS-LＲＲ类抗病基因［28-29］．
2 结果与分析
2． 1 瓠瓜 NBS类 ＲGAs的克隆与鉴定
利用 NBS-F1 /Ｒ1 简并引物扩增瓠瓜基因组
DNA，获得 250 bp左右的明亮特异条带(图 1) ，回收
产物克隆至 T 载体，挑取 25 个阳性克隆进行测序，
去除空载体序列与合并相同序列，获得 23 个特异片
段，命名为 HNB1 ～ HNB23，GenBank 登录号为
KJ908192 ～ KJ908214．测序结果表明，这些片段序列
长度在 242 ～ 261 nt之间;NCBI blastp 同源比对分析
发现，这 23 条 ＲGAs 与其他植物 Ｒ 基因均具有较高
相似性．氨基酸序列推导发现，23 条序列均包含 NBS
类 Ｒ基因特有的保守结构域，因此推测均为瓠瓜
ＲGAs． OＲFfinder 分 析 发 现，除 HNB1、HNB7、
HNB20、HNB22 和 HNB23 存在移码突变外，其他 18
个序列均具备连续 OＲF． MegAlign 程序同源比对发
现，这 23 条 ＲGAs 核苷酸序列相似性在 41． 5% ～
98． 8%之间，遗传分歧为 1． 2 ～ 109． 1，存在 1 020 个
图 1 瓠瓜 NBS类 ＲGAs PCＲ产物电泳分析
Fig． 1 Electrophoreses analyses of PCＲ products of NBS ＲGAs
from bottle gourd
变异位点，在 130 ～ 210 nt 区间变异最为丰富;其中
HNB14 与 HNB5、HNB15 与 HNB5、HNB14 与
HNB15、HNB14 与 HNB19 相似性最高，为 98． 8%，
HNB10 与 HNB11 相似性最低，为 41． 5%，由此可见
各序列间相似性变化较大，说明瓠瓜 ＲGAs存在丰富
的变异位点，可能分属于瓠瓜中不同抗病基因或具
有 NBS结构域的不同基因(具体结果未列出)．
利用 MegAlign 程序对 23 条 ＲGAs 推导的氨基
酸序列进行比对，发现氨基酸序列相似性为
21． 5% ～100． 0%，遗传分歧为 0 ～ 223，其中 HNB7
与 HNB9 氨基酸相似性最低，为 21． 5%，HNB2 与
HNB4、HNB2 与 HNB5、HNB2 与 HNB14、HNB2 与
HNB15 等 14 对基因片段氨基酸序列相似性为
100. 0% ．经氨基酸序列聚类分析，将 23 条 ＲGAs 分
为 4 组，其中 HNB16、HNB20 与其他片段遗传距离最
远，为第 1 组，分为 2 个亚组，HNB16 与 HNB20 单独
为一亚组;HNB8、HNB9 和 HNB11 组成第 2 组，
HNB10、HNB17 和 HNB13 组成第 3 组，剩余 ＲGAs形
成第 4 组，包括 3 个亚组(图 2)．由此看出，瓠瓜 NBS
类 ＲGAs在进化过程中表现出较大的遗传差异和多
样性．
2． 2 瓠瓜 NBS类 ＲGAs保守结构域分析
前人研究报道 NBS 类 Ｒ 基因 P-loop 结构域为
GMGGI /LGKTT，Kinase-2 区域为(L /F) (L /V)VLD
(D /N) (V /M)W［30］． 23 条 ＲGAs 序列同源比对结果
表明，瓠瓜中 NBS 类 ＲGAs 结构域相当保守，除
HNB7 不包含 Kinase-2 结构外，其他序列均存在典型
的 P-loop(GMGGI /LGKTT)、Kinase-2 (L /FLVLDD-
VW)功能域 (图 3) ，少数序列保守结构域中发生单
个氨基酸突变，HNB9 P-loop 功能域 GMGGIGKTT 变
为 GMGGIＲＲGKTM，HNB23 则变为 GTGGLGKTT，基
本骨架未改变． 上述分析表明，本试验获得的 23 条
序列(HNB1 ～ HNB23)为潜在候选 Ｒ 基因片段． 另
49 华 南 农 业 大 学 学 报 第 36 卷
外，前人研究报道，TIＲ-NBS-LＲＲ类抗病基因 Kinase-
2 共有序列可总结为(V /L / I) (L /I /V) (L /I / V)V
(L /I /V)DD(V /I)X，最后一个氨基酸为任意氨基
酸，通常为色氨酸(D) ，而 non-TIＲ-NBS- LＲＲ 的 Ki-
nase-2 共有序列为(Y /V) (L /V) (L /I /V)V(L /V)
DD(I /V)W，最后一个氨基酸为天冬氨酸(W)［18］．由
此可以看出，瓠瓜所有 ＲGAs序列 Kinase-2 基序最后
一个氨基酸均为 W，所以属于 non-TIＲ-NBS-LＲＲ类．
图 2 瓠瓜 NBS类 ＲGAs编码氨基酸序列的聚类分析
Fig． 2 Clustering analyses of amino acid sequences encodcd by NBS type ＲGAs in bottle gourd
“-”用于优化联配的缺口;下划线标注为 NBS Ｒ基因保守功能域“P-loop”与“Kinase-2”．
图 3 瓠瓜 NBS类 ＲGAs编码氨基酸序列比对
Fig． 3 Amino acid sequence alignments of NBS type resistance ＲGAs in bottle gourd
2． 3 瓠瓜 NBS类 ＲGAs氨基酸序列的相似性检索
通过 NCBI Blastp程序对瓠瓜各 ＲGAs 进行同源
搜索，发现所有 ＲGAs氨基酸序列均含有 AAA超级家
族功能域，20 条序列表现 NB-AＲC 保守结构域特征，
与其他物种相似性在 40% ～ 100%之间，其中 HNB1、
HNB16、HNB22 和 HNB23 与葫芦 Lagenaria siceraria
ＲGA(AEV46102)相似性高达 99% ～ 100%，HNB4、
HNB5、HNB14、HNB15及 HNB19与丝瓜 Luffa aegypti-
aca ＲGA(AFC97124)相似性高达 96%，HNB18与黄瓜
Cucumis sativus ＲGA(XP_0 04161606)相似性高达 97%，
HNB11与西瓜 Citrullus lanatus ＲGA(AEV46173)相似
性高达 90%，HNB3 与冬瓜 Benincasa hispida ＲGA
(AHB60507)相似性高达 84%，而 HNB8、HNB9 则与
印度芒果 Mangifera indica ＲGA(AEH49854)相似性
最高仅为 48%～49%，说明克隆的瓠瓜 ＲGAs可能是
相关抗病基因的一部分或与抗病基因属于同一个基
因家族．其他抗病基因的物种名称和 GenBank 登录
号以及构建的系统发育进化树见图 4．所有抗病同源
59第 4 期 赵 芹，等:基于 NBS-LＲＲ类 Ｒ基因保守结构域克隆瓠瓜抗病基因同源序列
序列分为 5 个组，瓠瓜 ＲGAs 全部聚集在第 5 组中，
包括 23 条瓠瓜 ＲGAs 和 38 条其他植物 ＲGAs，又被
分为 7 个亚组，瓠瓜 ＲGAs 主要分布于第 7 亚组中;
第 4 组 包 括 L11、M 和 Pyrus × bretschneideri
(ACN76569) ，Nicotiana tabacum(ACF22039)和 Hu-
mulus lupulus(ABS70863)分别组成第 3 组和第 2 组，
第 1 组仅包括 N(BAD12594) ，与其他 ＲGAs 遗传距
离最远(图 4)．
图 4 瓠瓜与其他植物 NBS类 ＲGAs编码氨基酸序列聚类分析
Fig． 4 Clustering analyses of amino acid sequences encoded by NBS type ＲGAs in known other plants and bottle gourd
69 华 南 农 业 大 学 学 报 第 36 卷
对瓠瓜 NBS 类 ＲGAs 进行同源进化分析，non-
TIＲ-NBS-LＲＲ类基因 FOM-2、Mi-1． 1、ＲPS2、I2C-1 编
码氨基酸序列与所有瓠瓜 ＲGAs 聚集在第 5 组内，而
TIＲ-NBS-LＲＲ类基因 L11、M 与 N 编码氨基酸序列和
Pyrus × bretschneideri (ACN76569)、Nicotiana tabacum
(ACF22039)、Humulus lupulus(ABS70863)则分布在第 5
组之外的其他组，形成 TIＲ-NBS-LＲＲ类(图 4)．同源进
化分析结果与前面的推导氨基酸序列多重比较结果是
一致的．
3 讨论
植物抗病性一直是国内外研究热点，挖掘和利
用抗病基因对提高植物抗病性、阐明抗性机制及培
育抗性品种具有重要意义．瓠瓜经济价值巨大，抗性
资源丰富，具有许多极有价值的研究 Ｒ 基因的材料，
但其全基因组较大，且尚未完成全基因组测序，可开
发利用的相关分子标记也较少，因而通过经典的图
位克隆或转座子标签技术获得 Ｒ 基因难度很大． 利
用已报道的植物 Ｒ 基因保守结构域，设计特异简并
引物分离 ＲGAs，成为克隆 Ｒ 基因的有效途径之一．
利用 ＲGAs方法克隆 NBS-LＲＲ 类基因已在辣椒、甜
瓜等多种蔬菜中广泛应用［27，31］． 本研究根据已知
NBS类 Ｒ基因保守结构设计简并引物，从瓠瓜中分
离了 23 条抗病同源序列，其中 18 条序列具有开放
阅读框，5 条序列存在移码突变，说明从植物中分离
NBS类同源基因具有很大的随机性;这些序列与已
克隆的黄瓜、冬瓜、丝瓜及葫芦 Ｒ 基因蛋白有较高的
相似性，表明这些序列属于 ＲGAs序列，其中的 18 条
序列可能为功能性 Ｒ 基因，另外也表明瓠瓜与黄瓜、
丝瓜及葫芦等作物的近缘关系．
研究表明，点突变、重组、不等交换和基因转变
是 Ｒ基因进化的主要动力［32］． NBS 类基因以基因簇
多拷贝形式与其他 Ｒ 基因序列排列在染色体上，使
得基因内和基因间错配、重组、重复的频率大大提
高，促进无义基因与新 Ｒ 基因的产生［33-34］． 瓠瓜 23
条 ＲGAs 核苷酸序列相似性在 41. 5% ～ 98. 8% 之
间，存在 1 020 个变异位点，在 130 ～ 210 nt区间变异
幅度较高，说明瓠瓜 NBS 类基因存在一个较大的基
因家族，这些基因可能是来自同一基因的不同拷贝，
且基因变异程度较高．瓠瓜 ＲGAs氨基酸序列多重比
对与系统进化树分析一致，认为所有序列均属于
non-TIＲ-NBS-LＲＲ类，进一步支持了前人的研究结
论［18］．瓠瓜 ＲGAs保守结构域也存在突变，但未影响
到整个保守域性质;保守域外的氨基酸序列变异程
度较大，序列整体的相似性变化范围较广(21. 5% ～
100. 0%) ，与其他物种相似性在 40% ～ 100%之间．
这些点突变、插入和缺失可能是引起瓠瓜 ＲGAs多样
性的原因．上述研究结果为进化趋异假说提供了间
接证据．
NBS结构域是最重要的抗病基因保守结构域之
一，但具有 NBS 结构域的基因不一定就是抗病基
因［19］，还需其他可能与抗病更直接相关的重要结构
域如 TIＲ(Toll or interluken-1 receptor)、LＲＲ(Leucine
rich repeats)或 LZ(Leucine zipper)等［35］． 因此，本
研究分离得到的 18 条 NBS 类 ＲGAs，仅作为具有潜
在功能的抗病基因片段，分离鉴定真正具有抗病功
能的基因还需更深入的研究．
利用基于同源候选基因的克隆策略分离 Ｒ 基因
是一种简便快捷并且有效的手段，但也具有自身局
限性，如分离基因具有很大随机性，获得片段有的不
具连续 OＲF，有的含有保守结构域，但与植物抗性无
关，病原菌诱导不能表达等．因此可通过用不同碱基
组合简并引物扩增，或从不同部位、时期 cDNA 分离
ＲGAs，可提高获得不同 Ｒ序列机会．本研究以“大籽
瓠”为试材，同源扩增 NBS 类抗病基因同源序列，为
进一步克隆瓠瓜的功能性抗病基因以及分子标记辅
助选择育种奠定基础，也为研究瓠瓜 Ｒ 基因的起源
和遗传进化提供借鉴．
参考文献:
［1］ HEISEＲ C B． Variation in the bottle gourd［M］/ /MEG-
GEＲS B J，AYENSU E S，DUCKWOＲTH W D． Tropical
forest ecosystems in Africa and South America:A compar-
ative review． Washington D C:Smithsonian Institution
Press，1973:121-128．
［2］ 彭庆务，何晓明，谢大森，等． 瓠瓜的特征特性及育种
对策［J］． 广东农业科学，2003，30(1) :18-19．
［3］ 陈孟强，牛玉，林鉴荣，等． 瓠瓜部分种质资源主要性
状的初步评价［J］． 广东农业科学，2012，39(23) :22-
24．
［4］ 李开银，石伟平，胡宇舟，等． 湖北部分瓠瓜种质资源
初步研究及利用［J］． 中国蔬菜，2003(3) :33-34．
［5］ 高山，许端祥，林碧英，等． 38 份瓠瓜种质资源遗传
多样性的 ISSＲ分析［J］． 植物遗传资源学报，2007，8
(4) :396-400．
［6］ 高山，许端祥，林碧英，等． 瓠瓜种质资源遗传多样性
的 ＲAPD分析［J］． 分子植物育种，2007，5(4) :502-
506．
79第 4 期 赵 芹，等:基于 NBS-LＲＲ类 Ｒ基因保守结构域克隆瓠瓜抗病基因同源序列
［7］ 周先治，陈阳，陈最，等． 基于 5． 8S rDNA和 ITS序列
探讨亚洲瓠瓜的地理分化［J］． 中国蔬菜，2011(6) :
49-53．
［8］ 谷昊，陈绍宁，竺锡武，等． 复合侵染瓠瓜的两种病毒
的互作研究［J］． 科技通报，2009，25(4) :419-422．
［9］ 王玲平，吴晓花，汪宝根，等． 与瓠瓜品系 J083 白粉
病抗性基因连锁的 SCAＲ 分子标记［J］． 浙江大学学
报:农业与生命科学版，2011，37(2) :119-124．
［10］肖光辉． 瓠瓜 DNA直接导入西瓜抗枯萎病育种研究进
展［J］． 中国西瓜甜瓜，2002(2) :41-44．
［11］阙友雄，许莉萍，林剑伟，等． 斑茅 NBS-LＲＲ 类抗病
基因同源序列的克隆与分析［J］． 热带作物学报，
2009，30(2) :192-197．
［12］ KANAZIN V，MAＲEK L F，SHOEMAKEＲ Ｒ C． Ｒesist-
ance gene analogs are conserved and clustered in soybean
［J］． PNAS，1996，93(21) :11746-11750．
［13］李峰，张颖，樊秀彩，等． 植物 NBS-LＲＲ 类抗病基因
的研究进展［J］． 分子植物育种，2011，9(108) :1784-
1780．
［14］贺超英，张志永，陈受宜． 大豆中 NBS 类抗病基因同
源序列的分离与鉴定［J］． 科学通报，2001，46(12) :
1017-1021．
［15］ GUＲUＲANI M A，VENKATESH J，UPADHYAYA C P，
et al． Plant disease resistance genes:Current status and
future directions［J］． Physiol Mol Plant Pathol，2012，
78:51-65．
［16］ SHI A，KANTAＲTZI S K，MMBAGA M，et al． Isolation
of resistance gene analogues from flowering dogwood (Cor-
nus florida L．) ［J］． J Phytopathol，2008，156(11 /12) :
742-746．
［17］ XU Q，WEN X，DENG X． Isolation of TIＲ and nonTIＲ
NBS-LＲＲ resistance gene analogues and identification of
molecular markers linked to a powdery mildew resistance
locus in chestnut rose (Ｒosa roxburghii Tratt) ［J］． Theor
Appl Genet，2005，111(5) :819-830．
［18］ MEYEＲS B C，DICKEＲMAN A W，MICHELMOＲE Ｒ
W，et al． Plant disease resistance genes encode members
of an ancient and diverse protein family within the nucleo-
tide binding superfamily［J］． Plant J，1999，20(3) :
317-332．
［19］阙友雄，许莉萍，林剑伟，等． 甘蔗 NBS-LＲＲ 类抗病
基因同源序列的分离与鉴定［J］． 作物学报，2009，35
(4) :631-639．
［20］丁国华，池春玉，周秀艳，等． 黄瓜抗病基因类似序列
(ＲGA)的同源性分析和 Southern 鉴定［J］． 园艺学报，
2007，34(2) :355-360．
［21］ SUN D Q，HU Y L，ZHANG L B，et al． Cloning and a-
nalysis of fusarium wilt resistance gene analogs in“Gold-
finger”banana［J］． Mol Plant Breed，2009，7(6) :1215-
1222．
［22］王彦华，侯喜林，申书兴，等． 不结球白菜抗病基因同
源序列的克隆及分析［J］． 中国农业科学，2006，39
(12) :2621-2626．
［23］丁海，宛煜嵩，朱美霞，等． 大豆抗病基因同源序列的
克隆与分析［J］． 分子植物育种，2003，1(2) :217-
223．
［24］ DOYLE J J，DOYLE J L． A rapid DNA isolation proce-
dure for small quantities of fresh leaf material［J］． Phyto-
chem Bull，1987，19(1) :11-15．
［25］丁国华，秦智伟，刘宏宇，等． 黄瓜 NBS 类型抗病基
因同源序列的克隆与分析［J］． 园艺学报，2005，32
(4) :638-642．
［26］刘洋，姚全胜，苏俊波，等． 芒果 NBS 类抗病基因同
源序列克隆与分析［J］． 植物遗传资源学报，2013，14
(3) :571-576．
［27］王铎，刘长远，赵奎华，等． 辣椒 NBS-LＲＲ 类抗病基
因同源序列的克隆与分析［J］． 沈阳农业大学学报，
2011，2 (42) :98-101．
［28］高丽华，周以飞，郑伟文，等． 南瓜 NBS 类抗病基因
同源序列的克隆与分析［J］． 长江蔬菜，2007(8) :40-
43．
［29］ 陈玲，张颢，邱显钦，等． 云南悬钩子蔷薇 NBS-LＲＲ
类抗病基因同源克隆与分析［J］． 植物分类与资源学
报，2012，34 (1) :56-62．
［30］ QILIN P，JONATHAN W，KOBEＲT F． Divergent evolu-
tion of plant NBS-LＲＲ resistance gene homologous in dicot
and cereal genomes［J］． J Mol Evol，2000，50:203-
213．
［31］王贤磊，高兴旺，张铁钢，等． 甜瓜抗病基因同源序列
的克隆与分析［J］． 新疆大学学报:自然科学版，
2011，28(2) :136-144．
［32］ ELLIS J，DODDS P，PＲYOＲT． Structure，function and
evolution of plant disease resistance genes ［J］． Current
Opinion in Plant Biology，2000，3(4) :278-284．
［33］ BELKHADIＲ Y Ｒ，SUBＲ A M，DANGL L J． Plant dis-
ease resistance protein signaling:NBS-LＲＲ protein and
their partners［J］． Curr Opin Plant Biol，2004，7(4) :
391-399．
［34］ GOFF S A，ＲICKE D，LAN T H，et al． A draft sequence
of the rice genome (Oryza sativa L． ssp． Japonica) ［J］．
Science，2002，296(5565) :92-100．
［35］ TＲAUL F W． The functions and consensus motifs of nine
types of peptide segments that form different types of nu-
cleotide binding sites［J］． Eur J Biochem，1994，222
(1) :9-19．
【责任编辑 李晓卉】
89 华 南 农 业 大 学 学 报 第 36 卷