全 文 ：生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN·研究报告· 2008年第3期
收稿日期:2007-11-28
基金项目:国家自然科学基金资助项目(No30540067)
作者简介:贾岩龙(1977-),男,博士研究生,研究方向:藻类基因工程;电话:0371-66658328,E-mail:yanlongjia@126.com
杜氏盐藻(Dunalilasalina)是一种非常独特的单细胞真核绿藻[1]。它无细胞壁,含有一大的杯状叶绿
体,可在含 0.05～5MNaCl环境中生长。极其耐盐的能力、简单的细胞结构以及便利的培养条件使它成为研
究高盐适应分子机制的重要模式生物和遗传学研究的良好材料。利用蛋白质组学的技术方法,可以从整体
上了解盐胁迫下基因的激活表达情况,阐明耐盐基因的功能,系统地探索盐藻这一独特生物的耐盐机制。
这对于从中找出耐盐基因,转化高等植物,提高耐盐性有非常重要的意义和应用价值。
由于整个细胞或组织的蛋白组成极其复杂,直接对其进行蛋白质组学分析往往会丢掉很多生物学信
息,由此衍生出了亚细胞蛋白质组学[2~4](subcelularproteomics)。亚细胞蛋白质组学可以富集相应亚细胞结
构的低丰度蛋白,且能部分提示蛋白质的定位和功能信息。因此,将盐藻细胞分离为细胞膜、叶绿体和细胞
质 3部分,同时进行其耐盐机制的研究。叶绿体是藻类及高等植物进行光合作用的一类最为重要的细胞
杜氏盐藻完整叶绿体的分离及其蛋白提取
贾岩龙 1 柴玉荣 1,2 曲东京 1 刘红涛 1 薛乐勋 1
(1郑州大学细胞生物研究室 郑州大学第一附属医院,郑州 450052;2郑州大学基础医学院组胚教研室,郑州 450052)
摘 要: 应用高压破碎及蔗糖密度梯度离心的方法,分离出杜氏盐藻的完整叶绿体,随后用冻融法和研磨法分别
提取叶绿体蛋白,并通过蛋白定量和SDS-PAGE凝胶电泳对两种蛋白提取方法进行比较,确立了一套适用于杜氏盐藻叶
绿体分离和蛋白提取、定量以及电泳的方法。结果表明:用高压破碎结合蔗糖密度梯度离心的方法能够获得完整且较纯
的盐藻细胞叶绿体;SDS-PAGE凝胶电泳结果显示,冻融法提取叶绿体蛋白效率高,电泳条带清晰,蛋白数量较多,蛋白齐
全。为下一步在亚细胞水平进行杜氏盐藻耐盐机制的蛋白组学研究奠定了基础。
关键词: 杜氏盐藻 叶绿体 蛋白提取 SDS-PAGE
IsolationofIntactChloroplastsandComparisonofMethodsfor
ItsProteinExtractionfrom Dunalielasalina
JiaYanlong1 ChaiYurong1,2 QuDongjing1 LiuHongtao1 XueLexun1
(1LaboratoryforCelBiology,TheFirstAfiliatedHospital,ZhengzhouUniversity,Zhengzhou450052;
2DepartmentofHistologyandEmbryology,BasicMedicalColege,ZhengzhouUniversity,Zhengzhou450052)
Abstract: InordertoclarifythemolecularbasisforsalinitytoleranceinhalotolerantgreenalgaDunalielasalina,
isolationofintactchloroplastsandextractionoftheproteinfrom thealgaarecritical.Inthisstudy,celsofDunaliela
salinawerebrokenusingceldisruptionbyNitrogendecompresionandthechloroplastswereisolatedbycentrifugation
throughsucrosegradient.Then,twokindsofmethodsforproteinextraction,freezing-thawingcyclesandgrinding,were
comparedtodeterminetheireficiencyinseparatingchloroplastproteinsbyconcentrationdeterminationandSDS-PAGE
gelelectrophoresis.Theresultsindicatethatitwasaneficientmethodofisolatingintactchloroplastsusingceldisruption
byNitrogendecompresionandcentrifugationthroughsucrosegradient.Theseresultssuggestthatthemethodforisolating
intactchloroplastandproteinextractionareeficientandreliableforfurther2-Dgelelectrophoresisofchloroplastproteins
andidentificationbymasspectrometry,thuspavedthewayfordisectingmolecularmechanismsofsalinitytolerancein
Dunalielasalina.
Keywords: Dunalielasalina ChloroplastsProteinextraction SDS-PAGE
生物技术通报Biotechnology Buletin 2008年第3期
器,其蛋白含量占总蛋白的 10%~25%。因此,对杜氏盐藻叶绿体的分离方法进行了研究,随后用冻融法和
研磨法分别提取叶绿体蛋白,并通过蛋白定量和 SDS-PAGE电泳对两种提取方法进行比较,确立了一套适
用于杜氏盐藻完整叶绿体分离及蛋白提取、定量以及电泳的方法。研究结果将为从亚细胞水平进行杜氏盐
藻耐盐机制的蛋白质组学研究奠定基础。
1 材料和方法
1.1 材料
杜氏盐藻藻株:UTEX-LB-1644,购自美国德州大学;盐藻常规接种到适量培养液中进行培养,培养液
成分见参考文献[5],其中NaCl浓度为1.5mol/L。培养条件为:26℃,12h光照/12h暗培养,光照强度为4500lx。
1.2 仪器和试剂
1.2.1 主要仪器 高压破碎器 (美国 Par公司,型号 4635);垂直板电泳槽 (北京市六一仪器厂,型号
DYCZ-24D)
1.2.2 试剂 破碎缓冲液:Sorbitol0.33M,Hepes50mM,EDTA2mM,MnCl21mM,MgCl21mM,DTT2mM,BSA
0.5%,leupeptin1μg/ml,灭菌后用 KOH调 pH值至 7.5;叶绿体洗涤缓冲液:甘油 0.5M,Tris-MPOS10mM
(pH7.5),MgCl22mM,KCl50mM;冻融缓冲液:Tris-MPOS10mMpH7.5,MgCl22mM,KCl10mM;蛋白样品
缓冲液:Tris-HCl25ml(0.1mol.L-1)pH6.8,甘油 20ml(20%w/v),DTT3.1g,加去离子蒸馏水定容至 100ml。
4℃保存;叶绿体提取缓冲液:Sucrose700mM,KCl100mM,Tris-Cl50mM (pH8),EDTA5mM,DTT50mM,
PMSF0.5mM,plantproteaseinhibitorcocktail(SigmaP-9599);SDS-PAGE凝胶电泳所用试剂:30%丙烯酰胺:
丙烯酰胺 30g,甲叉丙烯酰胺 0.8g;5×上样缓冲液:DTT0.39g,SDS0.50g,溴酚蓝 0.025g,甘油 2.5ml。
1.3 方法
1.3.1 盐藻叶绿体的分离
1.3.1.1 高压法破碎盐藻细胞 取 500ml培养至对数生长期的盐藻细胞,离心(1000g,4℃,10min)。细胞
沉淀用新鲜培养液洗涤 2次,离心(条件同上)。细胞沉淀中加入冰上预冷的 15ml破碎缓冲液,小心吹打混
匀后转移至 50ml离心管中。用高压破碎器将盐藻细胞进行破碎,破碎条件为:压力 (250Pa),时间
(3.5min)。破碎后显微镜下观察细胞形态以判断破碎的程度。收集破碎后的细胞,短暂离心(1500g,4℃,
30s),弃掉上清。沉淀中加入 7ml破碎缓冲液充分混匀,作为叶绿体粗提液。
1.3.1.2 蔗糖密度梯度离心 将粗提液加在蔗糖密度梯度(30%、45%和 60%)上,水平转子离心(30000g,
4℃,50min),小心吸取收集 45%和 60%之间的绿色条带,用 3倍体积的破碎缓冲液洗涤收集物,离心
(3000g,4℃,10min),沉淀即为盐藻细胞的叶绿体部分。液氮中保存备用。
1.3.1.3 叶绿体完整性的检测 用 KI-I2溶液染色后在显微镜下观察叶绿体的形态和颜色变化以判断叶
绿体的完整性。
1.3.2 两种方法提取盐藻叶绿体蛋白
1.3.2.1 冻融法 取分离的完整叶绿体沉淀,称其湿重并用预冷叶绿体洗涤缓冲液洗涤后离心 (3000g,
4℃,5min)。弃上清,沉淀中加入适量(按 2ml/0.1g叶绿体湿重)预冷冻融缓冲液充分混匀。在液氮中经过 3
次反复冷冻(10min)/溶解循环以使叶绿体裂解。裂解后离心(1000g,4℃,30min),上清即为可溶叶绿体蛋
白。随后小心吸取上清,按 1:4体积加入预冷的丙酮,充分混合后-20℃保温过夜。离心收集蛋白沉淀
(20000g,4℃,20min)。晾干去除残留的丙酮。加入蛋白样品缓冲液溶解蛋白沉淀(缓冲液的用量为每 0.1g
叶绿体湿重加 500μl),4℃过夜。离心(20000g,4℃,5min),上清即为电泳蛋白样品溶液。-80℃保存备用。
1.3.2.2 研磨法 取分离的叶绿体沉淀,称其湿重后加入适量(按 2ml/0.1g叶绿体湿重)预冷叶绿体提取
缓冲液。混匀后加入到预冷的研钵中,加入少量的石英砂,冰上快速充分研磨。研磨后将其转移到 10ml离
心管中。离心(10000g,4℃,30min)。取上清并加入 5倍体积预冷的 0.1M醋酸铵甲醇溶液中,混匀后-20℃
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过夜沉淀蛋白。离心(20 000g,4℃,25min)。沉淀分别用预冷的乙醇和丙酮洗涤。蛋白沉淀处理同 1.3.2.1。
1.3.3蛋白定量 应用 Bradford方法进行蛋白定量。即根据已知浓度牛血清白蛋白(BSA)的 OD值作标准
曲线,然后对待测蛋白样品溶液的浓度进行定量。
1.3.4 SDS-PAGE凝胶电泳 采用 Laemmli变性不连续 SDS-PAGE凝胶电泳系统,12%的分离胶和 5%的
浓缩胶,具体方法和步骤见参考文献[6,7]。
2 结果与分析
2.1盐藻细胞叶绿体的分离
应用高压法即将盐藻细胞悬浮液放入预冷的高压破碎器的压力室中,通过小孔对细胞的压力破碎细
胞。破碎后的细胞经蔗糖密度梯度离心,获得的叶绿体在显微镜下观察均呈椭圆状小球。因为完整藻细胞
叶绿体的中部应包含有一大型的淀粉核,KI-I2溶液染色会呈现蓝色。本实验分离的叶绿体经 KI-I2溶液染
色后于镜下观察(10×40),大部分叶绿体的中间呈蓝黑色(图 1)。这表明所分离的叶绿体是比较完整的,适
用于后续研究。
2.2盐藻叶绿体蛋白提取方法的比较
利用两种不同的方法提取叶绿体蛋白,即冻融法裂解再丙酮沉淀蛋白和研磨法处理加醋酸铵沉淀蛋
白。蛋白定量后进行 SDS-PAGE电泳,结果见图 2和表 2。
图 1 杜氏盐藻叶绿体经 KI-I2染色后
形态观察(10×40)
M 1 2
116.0kD
66.2kD
45.0kD
35.0kD
图 2 两种方法提取的盐藻叶绿体蛋白 SDS-PAGE凝胶电泳图
M.蛋白 marker
1.冻融法
2.研磨法
表 2 盐藻叶绿体蛋白不同提取方法的比较从图 2和表 2中可以看出,用冻融
法提取的叶绿体蛋白进行 SDS-PAGE凝
胶电泳的效果较好,不但提取的蛋白量
较多,而且电泳的条带较多且较清晰,在
一定程度上更适宜进行盐藻叶绿体蛋白质组学的分析。相比之下,用研磨法提取叶绿体蛋白量较少,电泳
的条带较少。
3 讨论
亚细胞蛋白质组学的上游研究技术是亚细胞结构的提取和纯化即细胞的分级分离。由于叶绿体与其
他亚细胞结构密度相差较大,比较容易利用差速离心或密度梯度离心进行分离。为了获得完整的盐藻细胞
的叶绿体,首先必须对细胞进行有效地破碎。由于盐藻细胞没有坚硬的多糖细胞壁,细胞外只是被一层糖
蛋白和神经氨酸组成的薄而富有弹性的外膜包裹[8]。因此,先利用高压破碎的方法对盐藻细胞进行了破碎,
随后用蔗糖密度梯度离心获得了较完整且污染少的叶绿体。作者也尝试了用低渗裂解的方法来破碎盐藻
细胞,但效果不太理想。
提取的亚细胞结构一般都需要进行纯度评价。形态学观察主要是通过显微镜来直观的观察亚细胞结
构的特征,看是否有其他组分的存在。由于盐藻细胞叶绿体的中部有一较大的淀粉核,经 KI-I2溶液染色后
就会呈现蓝色。利用盐藻叶绿体的这一特性,研究中分离的叶绿体经 KI-I2溶液染色后,在显微镜下观察到
贾岩龙等:杜氏盐藻完整叶绿体的分离及其蛋白提取 137
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对于提取过程中添加的各类试剂的种类和浓度,经过了严格的筛选。这些试剂都是在体外对细胞无毒
害作用的无机物或酶制剂,细胞培养试验证明,适量添加这些试剂对细胞的生长没有明显影响,所得到的
酶制剂可以直接应用于体外细胞试验。
乳酸菌为兼性厌氧菌,是一种重要的食品级微生物,对基因克隆和表达调控的研究,将会利用乳酸菌
株/系产生多种有益的异源基因的产物。利用实验室现有的基因工程乳酸乳球菌,摸索出简便和高效的提
取表达产物的方法。为今后基因工程乳酸菌的研究和应用提供了重要的技术基础。
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大部分叶绿体的中间呈蓝黑色。因此,用此方法证明了所分离的叶绿体是较完整的。
蛋白样品的制备是蛋白质组学首要且关键的技术。为了对样品中的蛋白质作完全分析,必须对叶绿体
进行有效地破碎,以获得尽可能多的蛋白。作者尝试了不同的方法(包括冻融法、研磨法、高压法及超声波
法等)破碎叶绿体。实验中发现高压法和超声波法比较剧烈,在破碎叶绿体的过程中也伴随着色素等物质
的释放,对后面的沉淀蛋白造成了较大的干扰,结果不理想(数据未显示)。而冻融法和研磨法操作较温和。
但用这两种方法提取蛋白后进行 SDS-PAGE凝胶电泳结果证明:冻融法比研磨法提取的叶绿体蛋白电泳
条带较多且较清晰。因此,冻融法可以作为盐藻叶绿体蛋白提取的较适宜方法。
结果表明,高压破碎联合蔗糖密度梯度离心的方法能够获得较纯、且较完整的杜氏盐藻叶绿体;利用
冻融法提取的叶绿体蛋白效率高,蛋白数量较多。这为下一步在亚细胞水平利用叶绿体蛋白进行杜氏盐藻
蛋白组学分析奠定了基础。
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