全 文 ：生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN·研究报告· 2008年第5期
收稿日期:2008-03-24
作者简介:胡雪(1982-),女,硕士研究生,研究方向:医学信息学、医学免疫学
通讯作者:曾照芳,教授,E-mail:zeng000@126.com
为预防及治疗某些疾病(如流行性传染病和肿瘤),需要有一种能引起强烈 T细胞免疫应答的疫苗,以
诱导机体分泌 IFN-γ的 CD4+Th或 CD8+CTL。DCs是惟一能启动初始型 T细胞免疫应答的专职抗原提呈细
胞(APC),可高效处理各种抗原并将其结合在 MHCⅠ和 MHCⅡ 复合物上,分别诱导产生 CD8+和 CD4+T细
DEC-205单抗耦联长循环免疫脂质体的制备及其体外靶向
胡雪 1 曾照芳 1 陈里里 2
(1重庆医科大学检验系 临床检验诊断学省部共建教育部重点实验室,重庆 400016;
2重庆医科大学生物医学工程研究室,重庆 400016)
摘 要: 为使脂质体将所包封的药物或抗原高效地递呈给树突状细胞(dendriticcels,DCs),诱导产生强烈的T细
胞免疫应答或特异性免疫耐受,采用薄膜分散法制备了包裹FITC-dextran的纳米脂质体;用DSPE-PEG(2000)对脂质体膜进
行修饰使之具有长循环功能;用异型双功能交联剂SPDP将抗小鼠DEC-205单克隆抗体耦联于脂质体表面使之具有主
动靶向DCs的能力。稳定性实验表明脂质体在4℃贮存7d后粒径分布变化较小,FITC-dextran累积泄漏率小于7%;体外
结合实验证明耦联抗DEC-205的免疫脂质体(anti-DEC-205iLPSM)可特异性地识别DCs,并作为良好载体将FITC-
dextran带入DCs浆内。成熟树突状细胞(mDC)与未成熟树突状细胞(iDC)均可高效摄取 anti-DEC-205iLPSM,iDC摄
取能力更强。anti-DEC-205iLPSM有望成为一种新型DC疫苗应用于临床。
关键词: 免疫脂质体 树突状细胞 DEC-205 靶向 稳定性
ReparationofModifiedImmunoliposomewithDSPE-PEG2000
RespondingtoDEC-205MonoclonalAntibodyandTrgeting
Capacityinvitro
HuXue1 ZengZhaofang1 ChenLili2
(1MinistryofEducationandChongqingKeyLaboratoryofLaboratoryMedicine,DepartmentofLaboratoryMedicine,
Chongqing400016;2BiomedicalEngineeringResearchCenter,ChongqingMedicalUniversity,Chongqing400016)
Abstract: Inordertopresentliposome-encapsulatedantigensordrugstoDCswithhigheficiency,thusthe
productionofintensiveT-celimmuneresponseorspecificimmunetolerancetobeinduced,liposomescontainingFITC-
dextranwerepreparedbyfilm dispersion.DSPE-PEG2000 wasusedtomodifytheliposomemembranesothatthe
circulationtimeofitwasprolonged.SPDP,heterotypicdual-functionalcroslinker,wasusedtoconjugateDEC-205
antibodieswhichcanbeabletotargetDCs.Thepreparedliposomesshowedstablephysicochemicalpropertieswhen
storedat4℃ for7days.Underthiscondition,therewasnoanychangedon1iposomesizeandsizedistribution.
CumulativeleakagerateofFITC-dextranfrom liposomeswasles than7%.Anti-DEC-205-immunoliposomescould
recognizeDCsspecificalyanddeliverFITC-dextranintoitscytoplasm.ItwasshownthatbothiDC andmDC could
takeanti-DEC-205iLPSM intocytoplasm,butthelateronehasstrongeruptakecapacity.Theconstructionofananti-
DEC-205iLPSM layssolidfoundationsforfurtherresearchonimmuneresponseinwhichantigencouldtargettoDEC-
205receptorsinvivo.Anti-DEC-205iLPSM couldbecomeanewtypeofDCvaccine.
Keywords: Immunoliposome DendriticcelsDEC-205 TargetStability
2008年第5期
胞免疫应答,在机体免疫系统中处于中心地位。DCs是非均质的,不同解剖部位、亚群、成熟状态甚至处于
不同微环境中的 DCs具有不同的免疫学特性及功能,既可能诱导免疫应答,也可能诱导免疫耐受。这种多
样性、可塑性及其在免疫应答过程中的特殊地位,使得近年来 DCs介导免疫治疗策略在体外试验和动物模
型中得到广泛应用,有的甚至已进入人类临床观察阶段。但 DCs在体内含量甚微,外源性药物或抗原进入
体内后只有小部分被 DCs摄取。因此提高药物或外源性抗原对树突状细胞的靶向性,对于提高生物有效
度、降低抗原蛋白或药物的使用剂量、降低疫苗成本、增强免疫应答效应等都具有重要意义。
DEC-205是 C型凝集素巨噬细胞甘露糖受体家族成员,在淋巴结 T细胞区 DCs上特异性高表达[1]。其
胞浆区含有介导内吞和靶向晚期内涵体/MHCⅡ室的蛋白基序,使得 DEC-205能更高效地将抗原加载到
MHCⅡ分子上并提呈给 T淋巴细胞,提呈效率可高于甘露糖受体 100倍[2]。目前国外研究较多的是将抗原
(如 HIVp24gag、OVA、HEL)与 DEC-205单抗交联后实现抗原靶向[3~5],但交联物在体内易与蛋白酶和免疫
系统相互作用,模型的试验结果很理想,但体内效果较差、药物生物有效度较低。
近年来脂质体(liposomes)已作为一种新型药物载体应用于临床,具有携带量大、缓释、促进 APC摄取
抗原、保护被包封药物免遭降解、减少用药剂量等优点[6]。可同时包裹药物及 DC成熟调节物于同一脂质体
中,实现对免疫应答方向的控制。此外,普通多肽类疫苗一般不能诱导 CTL应答,但被包裹入脂质体后即
可进入 MHC-I类分子抗原递呈路径,从而同时诱导体液免疫和细胞免疫。结合 DEC-205及长循环免疫脂
质体的优点,设计了以 DEC-205单抗为导向、以脂质体为载体、以 DCs为靶点的策略,制备了经 DEC-205
单抗靶向 DCs的免疫脂质体,并对其粒径分布、包封率、存储稳定性、免疫学活性、体外寻靶能力等物理稳
定性及免疫学活性进行考察,为进一步研究抗原靶向DEC-205受体后的体内免疫应答情况奠定了工作基础。
1 材料与方法
1.1 试剂与仪器
FITC-dextran(4.4kD,Sigma公司);DSPC、胆固醇、DSPE-PEG (2000)PDP、DSPE-PEG (2000)Amine(均购于
Avanti公司);大鼠抗小鼠 DEC-205单抗及同型对照(MiltenyiBiotec公司);旋转蒸发仪(RE-52C,上海青浦
沪西仪器厂);超声振荡仪(KQ2200B,昆山市超声仪器有限公司);激光粒径测定仪(MasterSizer2000,英国
马尔文仪器公司);荧光分光光度计(U-1800,日本 HITACHI公司);流式细胞仪(FACScaliber,美国 BD公
司)。
1.2 DCs的体外诱导及扩增
无菌操作提取雄性 Balb/c小鼠骨髓细胞,以含 10%胎牛血清(FCS)的 1640培养液配制成浓度为 1×
106cel/ml的细胞悬液接种于 6孔板中(0.5ml/孔),再于每孔中加入 2ml含 10%胎牛血清的 1640培养基及
GM-CSF(使其终浓度为 0.02mg/ml)。37℃、5%CO2条件下培养。在 DCs诱导过程中,每 3d换液一次并补充
细胞因子,至 8d可得未成熟 DCs(iDCs)。于 9d时在每孔中加入 LPS(使其终浓度为 10μg/ml),继续培养至
第 10d可得成熟 DCs(mDCs)。
1.3 长循环免疫脂质体制备
将 DSPC、胆固醇、DSPE-PEG(2000)Amine、DSPE-PEG(2000)PDP(摩尔比为 50:40:2.5:0.5)混合溶于氯仿,减
压旋转蒸干形成均匀脂膜。加入 Hepes缓冲液(pH6.6)常压旋转 45min使薄膜溶胀水合,将所得混悬液漩
涡震荡、超声处理并依次过 0.45μm、0.22μm微孔滤膜,即得空白长循环脂质体(cLPSM)。若在水化过程中
加入浓度为 45mg/ml的 FITC-dextran(4.4kD)PBS溶液可制备荧光标记脂质体[7],反应液过 SephadexG-100
柱(1.5cm×26cm),以 Hepes缓冲液(pH7.5)洗脱除去未包封的 FITC-dextran,收集脂质体部分。采用异型双
功能试剂 SPDP交联抗体与脂质体。将 5mg/ml抗小鼠 DEC-205抗体或同型对照 IgG与 6.25mg/mlSPDP溶
液混合,23℃～25℃反应 30min以生成 PDP-IgG。反应液过 SephadexG-25柱除去多余的 SPDP及副产物(平
衡及洗脱液均为 100mmol/L醋酸缓冲液,pH4.5)。收集 PDP-IgG部分加入二硫苏糖醇(DTT)使其终浓度为
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生物技术通报Biotechnology Buletin 2008年第5期
表 1 不同存储温度下脂质体粒径分布
50mmol/L,搅拌条件下 23℃～25℃反应 25min。过 SephadexG-25柱去除过量 DTT(平衡及洗脱缓冲液为
100mmol/LPBS,pH7.5)。收集IgG-SH部份,立即与脂质体混合 (摩尔比为1∶1000),暗处室温搅拌过夜。过
SepharoseCL-4B柱去除未结合IgG-SH,可得与DEC-205单抗结合的长循环免疫脂质体(anti-DEC-205iLPSM)。
1.4 FITC-dextran脂质体包封率的测定
将水合好的脂质体混悬液于 15000r/min离心 60min,收集上清液定容,以荧光分光光度计在激发波长
485nm,发射波长 515nm处测定荧光值。利用标准曲线方程计算混悬液中游离 FITC-dextran的量(Cf)。吸取
等量水合好的脂质体混悬液于容量瓶中,加入 TritonX-100使终浓度为 0.1%(W/V),PBS稀释至刻度后测
定荧光值,计算混悬液中总 FITC-dextran量 Co。
脂质体包封率=(1-Cf/Co)×100%
1.5 透析膜法检测脂质体体外泄漏情况
将制备的免疫脂质体放入透析袋内,扎紧后分别置于 4℃及 25℃PBS缓冲液内,持续搅拌,在各指定时
间点取 1ml透析液,同时补充 1mlPBS。透析完成后将透析袋剪破,加入 TritonX-100搅拌均匀,以荧光分
光光度计在激发波长 485nm,发射波长 515nm处测定荧光值,记为 A∞(时间为无穷大时的药物泄漏量)。将
各时间点所取样品测定荧光值,记为 At(t时间时样品 FITC-dextran泄漏量)。
泄漏率(%)=At/A∞。
1.6 脂质体膜表面 DEC-205抗体免疫活性检测
将诱导至第 10d的 mDCs以含 10%FCS的 1640培养液调整细胞浓度后定量加入 96孔板培养过夜(1×
106cel/孔)。加入 0.05%戊二醛 4℃固定细胞 20min,PBS洗涤后加入 1%BSA37℃孵育 1h以封闭细胞及 96
孔板上的非特异性结合位点。再加入序列稀释的 anti-DEC-205iLPSM(或 cLPSM),37℃孵育 2h后以 PBS洗
涤,加入羊抗大鼠 IgG-HRP37℃反应 1.5h,PBS洗涤后加入 100μl邻苯二胺暗处室温显色 10min,2mol/L硫
酸终止反应后于 492nm波长处测各孔吸光度值。
1.7 anti-DEC-205iLPSM体外寻靶能力检测
于培养至第 9d的 iDCs中加入 LPS,12h后收集细胞定量加入 24孔板 (105/孔),加入包封有 FITC-
dextran的 anti-DEC-205iLPSM或 PBS,37℃孵育 24h后收集细胞,PBS洗涤、4%多聚甲醛固定,以流式细胞
仪测定 CD11c-、CD11c+CD83+及 CD11c+CD83-三种细胞[8]FITC阳性百分率。比较 anti-DEC-205iLPSM组与
PBS组 DCs增殖情况。
2 结果与讨论
现有的 DC疫苗制备方法仍存在一些不足,如体外肿瘤抗原冲击 DC后回输法存在自身肿瘤材料获取
困难、操作繁琐等问题;DNA疫苗存在只有一小部分 DNA分子被 DC摄取,导致免疫强度差等问题。若能
使抗原在体内直接靶向 DCs并诱导产生强烈的细胞免疫应答,将会使 DCs免疫治疗策略具有更为广阔的
应用空间。以容易检测的 FITC-dextran作为模型抗原,将包封 FITC-dextran的脂质体与针对 DEC-205的单
抗连接,制成具有树突状细胞靶向性的长循环免疫脂质体,并对其理化性质和生物学活性进行考察。
2.1 脂质体稳定性评价
为考察免疫脂质体在不同存储温度下脂质
体粒径分布同温度下的存储稳定性,将 anti-
DEC-205iLPSM分别于 4℃及 25℃静置 7d后测
定样品粒径分布变化(表 1)。累积泄漏百分率曲
线如图 1所示。
在脂质体膜上加亲水 性长链聚乙二醇
(PEG2000)后可形成一水化层,减少脂膜与血浆
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2008年第5期
蛋白的接触,降低血浆蛋白的调理作用,屏蔽 RES对脂质体的识别、清除作用,减少脂质体聚集,延长脂质
体在血液循环中滞留的时间,有利于实现脂质体的主动靶向。本研究选用相变温度约为 58℃的 DSPC作为
膜材。高相变温度的磷脂可减少脂质体膜流动性,增加脂质体在体内外的稳定性。根据 Stokes定律,分散微
粒的沉降速度与其半径 r的平方成正比,减小 r可增加脂质体这一特殊多相分散体系的动力稳定性,延长
脂质体存贮时间。一般认为粒径较大的脂质体(>300nm)缺乏血管通透性,不能通过肝血管的细胞间隙,易
被 RES吞噬,故在体内半衰期较短。粒径小于 150nm的脂质体可以减少肝、脾的摄取,却易被淋巴系统吸
收,载有抗原的脂质体可由此进入淋巴循环系统,直接将抗原传递至 DCs富集的淋巴结。因此本研究应用
超声分散及过膜挤压法将脂质体粒径控制在 150nm左右,使之能更高效地靶向引流淋巴结。经上述优化制
备的脂质体在 4℃放置 7d粒径分布变化不显著,2d累积泄漏率小于 2%,7d内小于 7%。但在 25℃保存时
泄漏率显著增高(P<0.05),这与温度增高时膜流动性增大、脂质体聚结稳定性降低有关。免疫脂质体表面
的抗体也可增加脂质体间的相互作用,降低脂质体膜稳定性[6]。因此,宜在低温(4℃)保存脂质体。
图 2 anti-DEC-205iLPSM 及 cLPSM与
DCs体外结合能力比较
图 1 不同存储温度下脂质体累积泄
漏率比较
2.2 脂质体表面抗体免疫活性检测
以 ELISA法考察交联反应对 DEC-205抗体活性的影响(图 2)。anti-DEC-205iLPSM表面的 DEC-205抗
体仍保持良好的免疫活性,可结合到经固定的 mDCs表面,
而作为对照的 cLPSM则结合很弱。
2.3 anti-DEC-205iLPSM体外寻靶能力检测
与其它甘露糖受体家族成员不同,DEC-205在 DCs成
熟过程中表达上调,但内吞功能受抑制[9]。本研究以 LPS诱
导 DC成熟;以 CD83、CD11c等标志分子精确区分 iDC及
mDC[8];以 FITC阳性率代表内吞 anti-DEC-205iLPSM的细胞
百分率。41%的 mDC仍能摄 取 anti-DEC-205iLPSM,为
CD11c-细胞 FITC阳性率(7%)的 6倍,但摄取水平低于 iDC
(图 3)。这一结果与 Badiee等[2]的报道一致。可见 DEC-205
能高效介导内吞并且在 DCs上高表达,可增强脂质体特异
性靶向 DCs的能力。anti-DEC-205iLPSM既可靶向 mDC,又
可靶向 iDC,有望成为一种新型的 DC疫苗。例如,可将肿瘤相关抗原包封入 anti-DEC-205iLPSM,用于加载
DC使之成为肿瘤疫苗;或是将 NF-κB抑制剂或自身免疫性疾病相关抗原包封入 anti-DEC-205iLPSM而诱
导免疫耐受。为考察 anti-DEC-205iLPSM的生物安全性,还比较了 anti-DEC-205iLPSM组与 PBS空白对照
组中 DCs细胞的增殖情况,发现最高剂量的 anti-DEC-205iLPSM对 DCs细胞增殖无显著影响。可认为该脂
图 3 3种细胞摄取荧光标记 anti-DEC-205
iLPSM能力比较
胡雪等:DEC-205单抗耦联长循环免疫脂质体的制备及其体外靶向
(下转第162页)
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生物技术通报Biotechnology Buletin 2008年第5期
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(上接第157页)
质体对 DCs细胞无毒性。
本研究构建了稳定的 anti-DEC-205iLPSM,并证明其在体外可被 DCs高效摄取,为进一步研究将抗原
或药物靶向 DEC-205受体后的免疫应答效应奠定了基础。
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NP质粒的 E2菌时,e-SOC-NP-denV基因易于同源整合进噬菌体基因组,重组噬菌体重新获得完整的 e
基因和 denV基因(包括溶菌酶基因),同时将外源基因导入噬菌体基因组(SOC基因下游)。而且,重新获得
溶菌酶基因的重组噬菌体可在无溶菌酶的 SC培养基上生长,易于进行初步的筛选。
AIVNP是较为保守的群特异性抗原。针对 NP的抗体不能给动物提供被动保护,但 NP却是细胞毒性
淋巴细胞识别的主要抗原,在抗异源亚型流感病毒感染中起重要作用[11~14]。因此,核蛋白的免疫功能对于
解决禽流感病毒感染的交叉保护具有现实意义。构建了表达流感病毒核蛋白的重组噬菌体,使流感病毒的
核蛋白成功地展示于噬菌体表面,并通过 SDS-PAGE、免疫印迹、免疫电镜以及 ELISA检测证实其表达的融
合蛋白具有特异的免疫学反应性(图 5,6,7;表 1),进一步证实 T4噬菌体展示系统可以用于生产检测流感
的诊断试剂、研究新型流感重组亚单位疫苗。利用此重组噬菌体作为诊断试剂,生物安全性高,生产方便。
但尚需建立适当的检测方法,进一步研究其实际诊断价值;另外,表达核蛋白的的重组噬菌体可以进一步
研究其刺激动物机体产生的细胞免疫,深入研究新功能,筛选新的抗原表位,为生产新型流感基因工程疫
苗奠定基础。
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