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生物技术通报
B IO TECHNOLOGY　BULL ETIN 2009年第 10期
抑制 Rent1表达对 HeLa细胞黏附能力的影响
宋关斌 唐开福
(重庆大学生物工程学院 生物力学及组织工程教育部重点实验室 ,重庆 400044)
　　摘 　要 : 　Rent1是无义介导的 mRNA降解 (NMD)通路中的关键因子之一 ,通过引导含有提前出现的终止密码子 ( PTC)
的 mRNA至 P2body,从而引发 mRNA降解。为了进一步研究 Rent1的生理功能 ,应用 RNA干扰 (RNA i)技术抑制 Rent1的表
达。试验发现 ,抑制 Rent1的表达能够增强 HeLa细胞对纤维粘连蛋白的黏附能力 ,另外 ,抑制 Rent1的表达能够增加整合素
基因 ITGA2、ITGA3、ITGA6、ITGB 5的表达。
关键词 : 　Rent1　细胞粘附 　整合素
Effect on Adhesion Capability Induced by Rent1
Knockdown in HeLa Cells
Song Guanbin　Tang Kaifu
( Key Laboratory for B iom echanics and Tissue Engineering of the S tate M inistry of Education,
College of B ioengineering, Chongqing University, Chongqing 400044)
　　Abs trac t: 　Nonsense2mediated mRNA decay (NMD) is a quality controlmechanism used by cells to elim inate mRNA s that p rema2
turely term inate translation. Rent1 is one of the key components of the NMD machanism. To elucidate the physiological functions of
NMD, Rent1 exp ression was inhibited using small interfering RNA in HeLa cells. Result indicated that knockdown of Rent1 enhanced
the adhesion capability of HeLa cells to fibronectin. In addition, Real time PCR indicated that four integrin genes, including ITGA2, IT2
GA3, ITGA6 and ITGB 5, were up regulated in Rent1 knockdown cells.
Key wo rds: 　Rnt1　Cell adhesion　 Integrin
收稿日期 : 2009206207
基金项目 :国家自然科学基金青年项目 (30700708)
作者简介 :宋关斌 (19682) ,博士后 ,教授 ,博士生导师 ,研究方向 :生物力学及生物流变学 ; Tel: 023265102507, E2mail: song@cqu. edu. cn　　无义介导的 mRNA降解 ( nonsense2mediated mR2NA decay,NMD)能够选择性降解含有提前出现的终止密码子 ( p remature translation term ination condon,PTC)的 mRNA,从而防止产生对机体有害的截短蛋白 ( truncated p roteins) [ 1 ]。NMD是真核生物中广泛存在的一种高度保守的监督机制 ,能够调节遗传性疾病的表型 [ 2 ]。Rent1是 NMD通路中的关键因子之一 ,通过引导含有 PTC的 mRNA至 P body从而引发 mR2NA降解 [3 ] ; Rent1蛋白在 DNA复制完成时附着到组蛋白 mRNA上引发组蛋白 mRNA降解 ,阻止组蛋白的进一步产生 ,从而促进 DNA和组蛋白合成的同步化 [ 4 ] ;除了参与 mRNA降解外 , Rent1还参与 DNA复制 ,维持基因组的完整性 [5 ]。为了进一步研究 Rent1的生理功 能 ,应用 RNA干扰 (RNAi)技术抑制 Rent1的表达。1 材料与方法111 主要试剂合成 siRNA s的试剂盒 Silencer siRNA Construc2tion Kit及转染 siRNA s的试剂盒 siPORT NeoFX均购自 Ambion公司 ;定量 PCR 试剂购自 TaKaRa公司 ; Rent1抗体购自 Santa Cruz公司 ;β2actin抗体购自碧云天公司 , Fibronectin购自 Invitrogen公司。112 DDB12siRNA和 HBX2siRNA的构建用 Silencer siRNA Construction Kit来合成 siR2NA s。寡核苷酸模板与 T7 启动子引物退火后用Klenow DNA 多聚酶补平。以补平的 dsDNA作为模板 ,经 T7 RNA聚合酶转录获得正义及反义 RNA s。
生物技术通报 B iotechnology　B u lle tin 2009年第 10期
将正义和反义 RNA s退火并用特异的单链核糖核酸
酶消化 dsRNA来除去单链 leader序列。
Rent12siRNA 的靶序列 : 5′2AAGATGCAGTTCCG2
CTCCATTTT23′
对照 siRNA的靶序列 : 5′2AAUUCUCCGAACGU2
GUCACGU23′
113 细胞培养和 siRNA转染
HeLa细胞培养条件 : 10%胎牛血清、200μg/m l
G418的 RPM I21640,在 37℃ 5% CO2培养箱中培养。
转染按照 siPORT NeoFX的使用说明进行。转染前
30 m in,细胞经胰酶消化后分到六孔板内 ,每孔细胞
数为 4 ×105。在无血清培养基 Op ti2MEM中加入 5
μl siPORT NeoFX转染试剂和 10 nmol/L siRNA混
合构成转染复合物加入到各孔。
114 W estern印迹分析
将细胞用胰酶消化收集 , PBS洗 3次 ,加入裂解
液 ( 115 mol/L Tris2HCl pH 810, 1 mol/L NaCl, 015
mol/L EDTA, 10% SDS)和 PMSF (二者比例按 10∶1)
吹打数次 , 4℃ 12 000 g离心 15 m in后收集获得蛋
白 ,用 BCA法测蛋白浓度 ,将蛋白加入到 3 ×蛋白上
样缓冲液 (150 mmol/L Tris2HCl pH618, 300 mmol/L
DTT, 6% SDS, 30%甘油 , 013%溴酚兰 )中 , 100°C变性
5 m in,蛋白上样到 6% SDS2聚丙稀酰胺凝胶中 ,转膜
后将膜加入抗 Rent1抗体中孵育 5 h, PBS2tween洗 3
次 ,再放入二抗中 2 h后 DAB显色 ,内参为 GAPDH。
115　细胞黏附试验
方法一 :加 1滴 20μg/m l的 FN1于 96孔板中 ,
37℃孵育 1 h,然后用含 011% BSA的 RPM I21640洗
2次。加入含 015% BSA的 RPM I21640在 37℃孵育
1 h,再用含 011% BSA的 RPM I21640洗 2次。将细
胞用胰酶消化收集 , PBS洗 3次 ,细胞记数后用培养
基稀释为 4 ×105 /m l,每孔加入 100 μl, 37℃培养
115 h。然后用 2 000 r/m in摇 15 m in后 ,用含 011%
BSA的 RPM I21640洗 2次。每孔加 200μl无血清
培养基及 5 mg/m lMTT 20μl,继续培养 4 h后去上
清 ,每孔加DMSO 200 U ,震荡 15 m in,用酶标仪检测
490 nm处的吸光值。
方法二 :加 1滴 20μg/m l的 FN1于 96孔板中 ,
37℃孵育 1 h,然后用含 011% BSA的 RPM I21640洗 2
次。加入含 015% BSA 的 RPM I21640在 37℃孵育
1 h,再用含 011% BSA的 RPM I21640洗 2次。将细胞
用 0102% EDTA消化消化收集 , PBS洗 3次 ,细胞记数
后用培养基稀释为 4 ×105 /m l,每孔加入 100μl, 37℃
培养 115 h。然后弃上清 ,用含 011% BSA的 RPM I2
1640洗 2次 ,每孔加 200μl无血清培养基及 5 mg/m l
MTT 20μl,继续培养 4 h后去上清 ,每孔加 DMSO 200
U,震荡 15 m in,用酶标仪检测 490 nm处的吸光值。
116 实时荧光定量 RT2PCR分析
Trizol一步法提取总 RNA ,总 RNA在 MMLV逆
转录酶作用下经逆转录获得 cDNA第一链。再用合
成的 cDNA为摸板扩增 ,扩增产物由 SYBRGreen检
测。不同基因的相对表达水平由公式 22△Ct计算 ,
△Ct =不同基因的 Ct值 2GAPDH的 Ct值。引物序
列 (正向 ,反向 )如表 1。
表 1 引物序列
引物 正向序列 (5′→3′) 　　 反向序列 (5′→3′) 　　
RENT1 　CCATTGCTCTAGGGCTTTCG 　TACCCGGTGCATGCCTCTA
ITGA1 　TGCCAGTGAGATTTCAGAGACC 　GTGATTTCCTGTGTTTTCGTCG
ITGA2 　GCAGATGGACCACACTTTGA 　TGTCTGTGCCCTTTTCCTCT
ITGA3 　GGGATCCTGCCTAAGGTTGTCT 　CCTTCTTTCTAGTTCCTTTGCTGTTG
ITGA4 　AGAGAGACAATCAGTGGTTGG 　TCAGTTCTGTTCGTAAATCAGG
ITGA5 　TGCCTCCCTCACCATCTTC 　TGCTTCTGCCAGTCCAGC
ITGA6 　GCTGGTTATAATCCTTCAATATCAATTGT 　TTGGGCTCAGAACCTTGGTTT
ITGB1 　CAAAGGAACAGCAGAGAAGC 　ATTGAGTAAGACAGGTCCATAAGG
ITGB2 　ACCAGCCCAGAGGTGACTGT 　CTGCTCCTGGATGCACTCTGT
ITGB3 　GTGACCTGAAGGAGAATCTGC 　TTCTTCGAATCATCTGGCC
ITGB4 　CTGTGTGCACGAGGGACATT 　AAGGCTGACTCGGTGGAGAA
ITGB5 　CTGTCCATGAAGGATGACTT 　TGTCCACTCTGTCTGTGAGA
GAPDH 　ATGACATCAAGAAGGTGGTG 　CATACCAGGAAATGAGCTTG
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2009年第 10期 宋关斌等 :抑制 Rent1表达对 HeLa细胞黏附能力的影响
117 统计学处理
统计学处理采用 SPSS1210软件进行分析 ,两样
本均数间比较采用 t检验 , P < 0105为差异有统计
学意义。结果用 x　— ±s表示。
2　结果
211　应用 RNA干扰 (RNA i)技术抑制 Rent1的表达
为了抑制 Rent1的表达 ,用 Rent1特异的 siRNA
转染 HeLa细胞。48 h后收集细胞 ,定量 RT2PCR显
示 Rent1 mRNA 降低约 3倍 (图 1 ) , W estern证实
Rent1蛋白表达也受抑制 (图 2)。
212　抑制 Rent1表达增加对 HeLa细胞的黏附能力
的影响
细胞黏附试验结果发现 :用胰酶消化细胞 ,干扰
Rent1的表达 ,并不显著增加 HeLa细胞对表衬有纤
维粘连蛋白 ( FN)的塑料培养板的黏附力 (图 3) ;用
EDTA消化细胞 ,干扰 Rent1的表达 ,能够增加 HeLa
细胞对表衬有纤维粘连蛋白 ( FN )的塑料培养板的
黏附力 (图 4)。
2. 3　抑制 Rent1表达对整合素基因表达情况的影响
整合素 ( integrin)是由α、β两条链经非共价键
连接组成的异源双体 ( heterodimer) ,α、β链均为 I
型膜蛋白。整合素是介导细胞与细胞外基质相结合
的主要膜蛋白 ,整合素的表达水平决定了细胞与细
胞外基质的黏附能力。抑制 Rent1表达增加 HeLa
细胞的黏附能力 ,由此推测 ,抑制 Rent1表达可能增
加整合素的表达。运用定量 RT2PCR技术 ,发现正
常的 HeLa细胞表达 ITGA5、ITGB4、ITGB5而不表达
ITGA1、ITGA2、ITGA3、ITGA4、ITGA6、ITGB1、IT2
GB2、ITGB3。抑制 Rent1表达后 , HeLa细胞表达的
ITGB5增高约 5倍 ;正常状态下不表达的 ITGA2、IT2
GA3和 ITGA6也有高水平的表达 ;而 ITGA5和 IT2
GB4的表达没有显著变化 (图 5)。
3　讨论
尽管 NMD在真核生物中广泛存在 ,但是其生
理功能目前还不清楚。除了调节因无义突变导致
的遗传性疾病的表型外 , NMD还能调节基因的表
达 [ 6 ] 。本试验证实 ,抑制 Rent1表达增加整合素基
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生物技术通报 B iotechnology　B u lle tin 2009年第 10期
1. ITGA1; 2. ITGA2; 3. ITGA3; 4. ITGA4; 5. ITGA5;
6. ITGA6; 7. ITGB1; 8. ITGB2; 9. ITGB3; 10. ITGB4; 11. ITGB5
图 5 不同 m RNA相对于 GAPD H的表达水平
因 ITGA2、ITGA3、ITGA6和 ITGB 5的表达。整合素
是由α、β两条链经非共价键连接组成的异源双体
( heterodimer) ,α、β链均为 I型膜蛋白。整合素是
介导细胞与细胞外基质相结合的主要膜蛋白 ,能够
介导细胞的黏附和迁移 ,在组织损伤修复、个体发育
以及肿瘤的发生和转移过程中起重要作用。敲除
Rent1的小鼠死于胚胎早期 [ 7 ] ,整合素参与胚胎发
育 , Rent1缺失的小鼠死于胚胎早期是否与整合素
的高表达有关 ,值得进一步研究。
Rent1是通过引导含有 PTC的 mRNA至 P2body
从而引发 mRNA 降解 [ 3 ] ,含有 PTC 的 mRNA 在
NMD缺失的细胞中稳定性增加 [ 8 ]。整合素在 Rent1
缺失的细胞中高表达是否因为这些整合素基因含有
PTC,答案可能是否定的 ,因为同时在多个整合素中
出现 PTC的可能性非常小。Perlick等 [ 6 ]报道 , Upf1
(Rent1的同源基因 )能够调节约 8%的酵母基因的
表达。Upf1主要不是通过调节这些 mRNA的稳定
性所致 ,而是通过调节转录因子的表达 ,后者再调节
其他 mRNA的转录。因此 ,本试验观察到的整合素
基因表达上调很可能是因为这些基因的转录增
加所致。
用两种不同的细胞粘附试验方法得出了不同的
结果 :用胰酶消化细胞 ,干扰 Rent1的表达 ,并不显
著增加 HeLa细胞对表衬有纤维粘连蛋白 ( FN)的塑
料培养板的黏附力 ;用 EDTA消化细胞 ,干扰 Rent1
的表达 ,能够显著增加 HeLa细胞对表衬有纤维粘
连蛋白 ( FN )的塑料培养板的黏附力。EDTA 是一
种螯合剂 ,因为细胞表面很多和培养皿结合的蛋白
都是带有 Ca2 +或者 Mg2 +的蛋白 ,而 EDTA就是螯合
Ca2 +或者 Mg2 +的 ,从而加速细胞和培养皿的脱离。
而胰酶是一种蛋白酶 ,在特定的位置降解蛋白 ,可以
将细胞膜上和培养皿壁结合的细胞粘附蛋白降解 ,
从而使细胞和培养皿壁脱离。本试验中 ,即使抑制
Rent1表达后整合素表达有所增加 ,用胰酶消化可
能破坏细胞表面的整合素蛋白 ,因此 , HeLa细胞的
粘附能力增加并不明显。由此认为 ,胰酶消化程度
的深浅难控制 ,对细胞粘附试验的影响较大 ,做细胞
粘附试验 ,最好避免用胰酶消化细胞。
参 考 文 献
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(上接第 164页 )
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