全 文 ：黄芪卫矛合剂对糖尿病肾病大鼠肾小球内皮细胞 VACM-1 表达的影响*
张丽芬，吕仁和1，黄文政2，李 伟，刘文毅，郭 力，王 蕊，姚 燕，刘兰英
(北京中医药大学第三附属医院肾内科，北京 100029;1 北京中医药大学附属东直门医院肾病科，北京 100700;
2天津中医药大学第一附属医院肾病科，天津 300192)
摘 要 目的:从影响糖尿病肾病内皮细胞血管细胞粘附分子-1( VACM-1) 的角度，探讨黄芪卫矛合剂对糖尿病肾病的治疗
作用和机制。方法:采用单侧肾切除并链脲佐菌素尾静脉注射建立大鼠糖尿病肾病模型，随机分为假手术组、糖尿病肾病组、糖尿
病肾病 +黄芪卫矛合剂组和糖尿病肾病 +氯沙坦钾组。观察 12 周末各组大鼠体重、尿量、饮水量、尿蛋白排泄率、血糖、糖化血蛋
白、血肌酐、尿素氮、Ⅳ型胶原蛋白、层粘连蛋白的变化。用免疫组织化学染色法检测肾小球 VACM-1 和 α-SMA的表达。结果:黄芪
卫矛合剂按 40g( 生药) /kg给药和氯沙坦钾按 16mg /kg给药可减少模型组大鼠饮水量、尿蛋白排泄率和层粘连蛋白，降低 VACM-1
和 α-SMA在肾小球内表达。黄芪卫矛合剂还可减少模型组大鼠尿量，降低血糖、糖化血红蛋白、血脂，在减少尿量和降低糖化血红
蛋白方面优于氯沙坦钾组。结论:黄芪卫矛合剂可减少糖尿病肾病大鼠肾组织中 VACM-1 表达，抑制内皮细胞的表型转化，保护肾
脏内皮细胞，从而对糖尿病肾病大鼠肾组织有保护作用。
关键词 黄芪卫矛合剂 糖尿病肾病 内皮细胞 血管细胞粘附分子-1
细胞粘附分子(cell adhesion molecule，CAM)是一组介导细
胞与细胞、细胞与基质间相互结合和作用的分子，它包括整合
素、选择素、钙粘素、免疫球蛋白(Ig)超基因家族和高分子碳水
化合物。CAM可引发肾内炎症细胞浸润、细胞外基质增多、肾
小球硬化和间质纤维化;可介导自身免疫反应性肾组织损伤，
因而在多种原发或继发性肾小球疾病、异体肾移植以及肾缺血
再灌注等方面发挥着重要致病作用。目前的研究提示，抗
CAM治疗可望成为肾脏疾病的一个具有广泛应用前景的治疗
方法［1，2］。VCAM-1 是 CAM家族主要成员之一，是内皮细胞结
构和功能改变的标志蛋白［3］，与细胞粘附分子 ICAM 相比，
VCAM-1 与肾脏微小血管病变更为密切。本研究观察糖尿病肾
病大鼠肾组织中 VACM-1 表达，探讨黄芪卫矛合剂对糖尿病肾
病大鼠的肾脏保护作用。
1 材料与方法
1． 1 试验药物 黄芪(Astragalus membranaceus (Fisch．)
Bunge)按中国 2000 年版药典鉴定，卫矛(Euonymus alatus
(Thunb．)Sieb)按北京市药品标准鉴定，购自北京同仁堂饮片有
限责任公司。黄芪和卫矛各取等量，黄芪用 50%乙醇提取 2
次，第 1 次 8 倍量、2h，第 2 次 6 倍量、2h，滤过。卫矛提取按最
优水平组合以 12 倍量水，提取 3 次，每次 1． 5h，滤过。合并二
药提取液，水浴浓缩成稠膏状，无菌装瓶密封备用。使用时以蒸
馏水配成含生药 2g /ml汁液。
氯沙坦钾片，默沙东制药有限公司，批号 H20000371，使用
时以生理盐水配成 0． 2%的溶液。
1． 2 动物 SD 大鼠 SSPF /VAF 级 60 只，雄性，体重 180 ～
220g，动物合格证号:SCXK(京)2002-0003，由北京维通利华实
验动物公司提供。
1． 3 试剂 链脲佐菌素(Streptozotocin，STZ，Sigma 公司，批
号:B69776)。Ⅳ型胶原和 LN的 ELISA试剂盒(上海贝西公司，
批号:20060322)，鼠抗 VCAM-1 单克隆抗体(MS-1101;Neomark-
ers;Lab Vision Corp．)。抗人 α-SMA 单克隆抗体(MAB-0003;
Maxim Biotech Inc，San Francisco，CA，USA;1:50)。ChemMa-
teTMEnVision二步法抗兔 /鼠通用型免疫组化检测试剂盒
(GK500705;ChemMateTMEnVision Detection Kit， Peroxidase /
DAB，Ｒabbit /Mouse，DakoCy-． tomation，Denmark)。
1． 4 仪器 OLYMPUS AU640 全自动生化测试仪(日本 OLYM-
PUS公司产品)。BN Prospec 型全自动蛋白检测仪(德国 Dade
Behring公司)。大鼠代谢笼，北京中医药大学东直门医院药理
基地提供。LEICA Qwin 图像分析仪(Leica 公司，德国)。
1． 5 方法 大鼠经普通饲料适应性饲养 1 周后，随机抽取 10 只
作为假手术组，大鼠在腹腔麻醉状态下，打开腹腔，剥离左肾脂肪
包膜，关闭腹腔，缝合切口。余 55 只大鼠行左肾摘除术，术后 1
周尾静脉注射 STZ 35mg /kg(用 0． 1mmol /L枸橼酸缓冲液，pH =
4． 2，4℃，配制成 2% STZ溶液 )，72h 后，测空腹血糖(FPG)及尿
糖，以 FPG≥16． 65mmol /L、尿糖强阳性、尿量大于假手术组 50%
者为模型制备成功。按 Mogens 分期法，符合糖尿病肾病模型Ⅲ
期［4］，选取造模成功大鼠 45只入选实验，随机分为模型组 15 只，
给予蒸馏水每日 10ml /kg灌胃;黄芪卫矛合剂组 15 只，黄芪卫
矛合剂每日 20ml /kg灌胃(按成人临床剂量的 20倍计算);氯沙
坦组 15只，氯沙坦 16mg /kg 灌胃(按成人临床剂量的 20 倍计
算)。假手术组术后 1周尾静脉注射等体积的缓冲液，给予蒸馏
水每日 10ml /kg灌胃。均给药 12 周，给药期间每组大鼠分笼饲
养，随意饮水，食用标准动物饲料。实验 12 周末各组随机取 8
只大鼠，称体重，计饮水量;代谢笼收集尿液，送检尿微量白蛋白;
大鼠禁食不禁水 12h，1． 5%戊巴比妥钠 50mg /kg 腹腔注射麻醉
后，心脏取血，并迅速剖腹取出右肾，剥离肾包膜，肾组织自肾门
切成两片，放入 10%中性福尔马林固定。
采用双抗体夹心酶联免疫吸附(ELISA)法定量测定大鼠血
清中 ColⅣ和 LN的含量(敏感性可达 1ng /ml)。
免疫组化检测采用 envision system 二步法:4μm 厚肾组织
石蜡切片粘附于多聚赖氨粘片剂处理后的载玻片上。切片脱蜡
至水。置于 0． 01M枸橼酸盐缓冲液 (pH值为 6． 0)或 1mM ED-
TA(PH值为 8． 0)中热抗原修复 15min。0． 01MPBS 浸泡 5min
洗 2 次，分别滴加特异性第一抗体工作液，4℃过夜。0． 05PBS
99中药药理与临床 2014;30(1)
* 国家自然科学基金青年基金项目( 30500671)
DOI:10.13412/j.cnki.zyyl.2014.01.032
洗 5min 洗 2 次。滴加二抗，湿盒内孵育 20 分钟，0． 05PBS 洗
5min洗 2 次。滴加 DAB工作液，镜下控制显色 1-5 分钟。自来
水冲洗，苏木精复染细胞核，脱水，松节油透明，中性树胶封片，
镜下观察结果。VCAM-1、α-SMA阳性物显深棕色。
计算机图象半定量扫描分析:采用 LEICA Qwin 图像分析仪
进行病理图像分析。每组选 8 个样本，每份样本均在 40 倍显微
镜下，视野上、下、左、右、中各取 2个肾小球(共 10个)，数码摄像
头采集肾小球图像。免疫组化染色中采集阳性区(不计色深)，
画定肾小球毛细血管襻区域，进行肾小球分析，分别得出肾小球
中 VCAM-1、α-SMA阳性区 /肾小球毛细血管襻的面积比。
2 结果
2． 1 黄芪卫矛合剂对糖尿病肾病大鼠体重、饮水量、尿量、尿蛋
白的影响 模型组大鼠体重增长缓慢，饮水量、尿量显著增多，
尿中蛋白排泄增多，黄芪卫矛合剂可明显减少糖尿病肾病大鼠
饮水量、尿量和尿蛋白排泄率，对体重无明显变化;氯沙坦钾可
明显增加大鼠体重，降低饮水量和尿蛋白排泄率，对尿量无明
显影响，黄芪卫矛合剂组在减少尿量方面优于氯沙坦钾组，见
表 1。
表 1 各组大鼠体重、饮水量、尿量、微量白蛋白的变化(珋x ± s，n = 8)
组别
剂量
(mg /kg)
体重
(g)
饮水量
(ml /24h)
尿量
(ml /24h)
尿微量白蛋白
(mg /L)
假手术对照 562 ± 37 35 ± 6 14． 19 ± 3． 98 ＜ 11． 3
模型对照 392 ± 75 350 ± 56 141． 57 ± 43． 80 88． 44 ± 32． 49
黄芪卫矛 20 399 ± 75 263 ± 30＊＊ 94． 57 ± 19． 86＊＊# 37． 63 ± 33． 09＊＊
氯沙坦钾 16 442 ± 63* 284 ± 58* 127． 75 ± 30． 80 46． 69 ± 27． 2*
与模型组比较 * P ＜ 0． 05，＊＊ P ＜ 0． 01;与氯沙坦钾组比较 # P ＜ 0． 05(下同)
2． 2 黄芪卫矛合剂对糖尿病肾病大鼠血糖、糖化血红蛋白、血
脂、肾功能、血清Ⅳ型胶原和层粘连蛋白的影响 糖尿病肾病
大鼠血糖、糖化血红蛋白、血脂、尿素氮、血清Ⅳ型胶原和层粘连
蛋白较假手术组明显升高，各造模组血肌酐无明显升高，提示
本实验的糖尿病肾病模型符合糖尿病肾病Ⅲ期，尚未出现肌酐
的异常。血尿素氮增高与糖尿病肾病大鼠高糖高渗有关。黄芪
卫矛合剂可显著降低糖尿病肾病大鼠血糖、糖化血红蛋白、血
脂、层粘连蛋白，对血尿素氮、肌酐、Ⅳ型胶原无明显影响。氯沙
坦钾可明显降低模型组大鼠层粘连蛋白，对血糖、糖化血红蛋
白、血脂、血尿素氮、肌酐、Ⅳ型胶原无明显影响。黄芪卫矛合剂
在降低糖化血红蛋白方面优于氯沙坦钾组，见表 2、表 3。
表 2 各组大鼠血糖、糖化血红蛋白、血脂的变化(珋x ± s，n = 8)
组别
剂量
(mg/kg)
血糖
(mmol /L)
糖化血红蛋白
(%)
甘油三酯
(mmol /L)
胆固醇
(mmol /L)
低密度脂蛋白
(mmol /L)
假手术对照 7． 66 ± 1． 24 4． 02 ± 0． 23 0． 47 ± 0． 27 1． 46 ± 0． 19 0． 21 ± 0． 08
模型对照 25． 91 ± 4． 51 12． 97 ± 1． 01 0． 78 ± 0． 29 2． 01 ± 0． 51 0． 31 ± 0． 05
黄芪卫矛 20 14． 53 ± 6． 59＊＊ 11． 76 ± 0． 73＊＊# 0． 63 ± 0． 39 1． 36 ± 0． 24＊＊ 0． 23 ± 0． 04*
氯沙坦钾 16 19． 40 ± 7． 08 12． 47 ± 0． 57 0． 74 ± 0． 59 1． 65 ± 0． 36 0． 25 ± 0． 04
表 3 各组大鼠肾功能、Ⅳ型胶原和层粘连蛋白的变化(珋x ± s，n = 8)
组别
剂量
(mg /kg)
尿素氮
(mmol /L)
肌酐
(μmol /L)
Ⅳ型胶原
(ng /ml)
层粘连蛋白
(ng /ml)
假手术对照 5． 57 ± 0． 81 46． 44 ± 6． 62 64． 94 ± 21． 22 108． 77 ± 72． 21
模型对照 14． 61 ± 7． 74 46． 58 ± 5． 62 133． 26 ± 38． 50 249． 26 ± 31． 39
黄芪卫矛 20 14． 30 ± 3． 67 46． 28 ± 12． 68 113． 21 ± 52． 84 107． 88 ± 46． 41＊＊
氯沙坦钾 16 16． 03 ± 6． 27 51． 32 ± 11． 26 112． 31 ± 31． 88 161． 56 ± 38． 67＊＊
2． 3 各组肾小球 VCAM-1、α-SMA的变化 VCAM-1主要表达在
肾小球毛细血管内皮细胞、肾小血管内皮细胞和肾间质细胞、病
变的肾小管周围。假手术组肾小球 VEAM-1极少量表达，各造模
组肾小球内 VCAM-1表达明显增多，两治疗组 VCAM-1 表达较模
型组明显减少，两治疗组之间比较差异显著性(P ＞0． 05)。
α-SMA主要表达于肾组织小血管、肾小球内皮细胞和系膜
细胞上，在肾小囊壁层上皮细胞上也有表达;假手术组肾组织内
小血管和出入球小动脉强表达，肾小球 α-SMA 极少量表达，各
造模组除小血管强表达外，肾小球内皮细胞和系膜细胞上、肾间
质和小管上皮细胞周围可见 α-SMA强表达，两治疗组肾小球内
α-SMA表达较模型组明显减弱，两用药组之间比较无差异显著
性(P ＞ 0． 05)，见表 4。
表 4 实验各组肾小球中血管细胞粘附分子-1、α-平滑肌肌动蛋白
的变化(珋x ± s)
组别
剂量
(mg /kg)
鼠数
(只)
血管细胞粘附分子-1
(%)
α-平滑肌肌动蛋白
(%)
假手术对照 8 0． 88 ± 0． 52 0． 00 ± 0． 00
模型对照 8 13． 41 ± 6． 13 7． 02 ± 3． 27
黄芪卫矛 20 8 4． 83 ± 2． 95＊＊ 4． 57 ± 2． 21＊＊
氯沙坦钾 16 8 6． 04 ± 2． 34＊＊ 3． 78 ± 2． 85＊＊
图 1 免疫组化染色
假手术组血管细胞粘附分子-1 在肾小球极少表达; 模型组血管细胞粘附
分子-1 表达大量增多，两治疗组血管细胞粘附分子-1 表达较模型组明
显减少
图 2 免疫组化染色
假手术组 α-平滑肌肌动蛋白只在小血管表达; 模型组 α-平滑肌肌动蛋
白在肾小球内表达大量增多，两治疗组 α-平滑肌肌动蛋白表达较模型
组明显减少
001 中药药理与临床 2014;30(1)
3 讨论
蛋白免疫球蛋白血管细胞粘附分子-1(VCAM-1)又名
CD106 和 INCAM-110，属于 Ig 基因家族。VCAM-1 是内皮细胞
损伤或表型转化的标志蛋白。VACM-1 在细胞因子刺激下的内
皮细胞表达明显上调，高于未受到刺激的内皮细胞。还可以表
达于淋巴腺的囊细胞和内囊细胞、成肌细胞和一些巨噬细胞。
与细胞粘附分子 ICAM 相比，VCAM-1 与肾小血管的病变更为
密切。Julie Lin［5］发现 VCAM与肾小球滤过率(GFＲ)呈现很强
的反比关系。ICAM 与 GFＲ 无关。Myron I［6］等研究比较了
VCAM-1 和 ICAM-1 在动脉硬化初期形成中的作用，数据资料表
明减少 VCAM-1 的表达明显地减轻了 Ldlr-/-小鼠的动脉损伤，
而减少 ICAM-1 的表达对 Ldlr-/-小鼠的动脉损伤没有明显影
响，提示了 VCAM-1 在动脉硬化形成中起的关键作用。
正常情况下，VCAM-1 很少表达或不表达，当受到炎性细胞
因子、内毒素等刺激后，其表达增加。大量研究显示，糖尿病时
VCAM-1 表达水平增加，活性增强，引起炎症因子的释放及细胞
间粘附性的变化，增加尿蛋白，促进细胞外基质沉积，参与了
DN的发生发展［7，8］。本研究结果显示黄芪卫矛合剂能显著减
少 VACM-1 在糖尿病肾病大鼠肾组织主要是在内皮细胞上的表
达，说明黄芪卫矛合剂对糖尿病肾病肾小球内皮细胞有很好的
保护作用，可保护内皮细胞免受高血糖的损伤和抑制再生的内
皮细胞发生表形转化。
α-平滑肌肌动蛋白是系膜细胞损伤的标志。在糖尿病肾病
状态下系 α-平滑肌肌动蛋白在肾组织表达增多，说明糖尿病肾
病时由于内皮细胞损伤，通过细胞间通迅引起了肾小球系膜细
胞的损伤和表形转化。黄芪卫矛合剂同样可以减少 α-平滑肌
肌动蛋白在系膜细胞的表达，说明黄芪卫矛合剂可以减轻系膜
细胞的损伤，其作用机制可能与促进内皮细胞生长和小血管再
生有关，也可能直接作用于系膜细胞而产生保护作用。
黄芪和卫矛是在临床常用的治疗肾脏病的有效药物，并且
在前期临床研究和实验研究中也取得了数据资料支持［9 ～ 12］。
参考文献
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12 张丽芬，吕仁和，赵进喜，等． 中医辨证治疗方案对糖尿病肾病肾功
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Effect of Huangqi-Weimao mixture on the expression of glomerular endothelial cells of
VACM-1 in rats with diabetic nephropathy
Zhang Lifen，Lv Ｒenhe1，Hang Wenzheng2，Li Wei1，Liu Wenyi1，Guo Li1，Wang Ｒi1，Yao Yan1，Liu Lanying1
(The Third Affiliated Hospital of Beijing University of Chinese Medicine，Beijing 100029，1Donzhimen Hospital of Beijing University
of Chinese Medicine，Beijing 100700，2 The First Hospital Affiliated to Tiajin University of Chinese Medicine，Tianjin 300192)
Objective:The mechanism of Huangqi-Weimao mixture in the treatment of diabetic nephropathy from the effect of endothelial cell
VACM-1． Methods:Diabetic nephropathy model in rats was established by the unilateral kidney and streptozotocin intravenously． after the
success of modeling，the rats were randomly divided into sham operation group，diabetic nephropathy group，diabetic + hqwm mixture group
and diabetic nephropathy + losartan potassium group，continued for 12 weeks． The weight，urine volume，water intake，urine protein excre-
tion，blood glucose，glycosylated serum protein，serum creatinine，urea nitrogen，collagen IV and laminin changes were observed． and so the
immunohistochemical staining of glomerular VACM-1 and α -SMA expression． Ｒesults:The Huangqi-Weimao mixture which was given as
40mg(Crude drug )/kg and losartan which was given as 16mg /kg can reduce the amount of water，urinary protein excretion rate and laminin
in the model the rats (P ＜ 0． 05，P ＜ 0． 01)，hqwm mixture group can also reduce the model group rats urine volume，decrease blood glu-
cose，glycosylated hemoglobin，blood lipids (P ＜ 0． 05，P ＜ 0． 01) ，in reducing the urine volume and reduce glycated hemoglobin is better
than that of losartan potassium group (P ＜ 0． 05)． VACM-1 and α -SMA expression in model rats were significantly higher than those in the
sham operation group (P ＜ 0． 01) ，the two treatment group can significantly reduce the expression of VACM-1 and α -SMA in glomeruli (P ＜
0． 01)． Conclusion:Huangqi-Weimao mixture can reduce the expression of VACM-1 in renal tissue of diabetic rats，which has a protective
effect on renal tissue of diabetic nephropathy rats．
Key words Huangqi-Weimao mixture(黄芪卫矛合剂);diabetic nephropathy;endothelial cell;vascular endothelial cell adhesion molecule -1
101中药药理与临床 2014;30(1)