全 文 ：Role of PI3K /Akt in protective effect of hydrogen sulfide against PC12
cells injuries induced by chemical hypoxia
MENG Jin-lan1，CHEN Ya-jia2，CHEN Hong3，DONG Yan-fen1，XING De-gang1，LIANG Yan-ling1，
LAN Ai-pin4，FENG Jian-qiang4
(1． Dept of Physiology，Guangdong Pharmaceutical University，Guangzhou 510006，China;2． Dept of Physical Examination，
Liwan Hospital of Guangzhou Medical College，Guangzhou 510170，China;3． Dept of Pharmacy，Community
Health Center of Six Banyan Street，Yuexiu District，Guangzhou 510410 China;4． Dept of Physiology，
Zhongshan Medical College，Sun Yat-sen University，Guangzhou 510080，China)
Abstract:Aim To explore the role of PI3K /Akt
pathway in hydrogen sulfide-induced neuroprotection of
PC12 cells． Methods The level of p-Akt of PC12
cells induced by H2S donor(NaHS)was evaluated by
Western blot． Cell viability was tested by cell counter
kit-8． Apoptotic rate was evaluated by propidium io-
dide (PI)staining and flow cytometry (FCM)． Re-
sults At the concentrations from 50 to 400 μmol·
L －1 NaHS for 30 min，p-Akt level was upregulated in a
dose-dependent manner，peaking at 400 mol · L －1
NaHS treatment． As the dose of NaHS increased，p-
Akt expression decreased． H2S preconditioning
markedly protected PC12 cells against injuries induced
by CoCl2，increasing the viability of cells and decrea-
sing the percentage of apoptotic cells． Ly294002，an
inhibitor of PI3K，not only decreased p-Akt level but
also obviously lowered the neuroprotection of H2S．
Conclusion H2S can protect PC12 cells against
chemical hypoxia injuries by activiating PI3K /Akt
pathway．
Key words: hydrogen sulfide; chemical hypoxia;
PI3K /Akt pathway;neuroprotection;cell signal;PC12
cells
网络出版时间:2013 － 1 － 28 8:40 网络出版地址:http:/ /www． cnki． net /kcms /detail /34． 1086． R． 20130128． 0840． 026． html
毛茛有效部位 D1 对人胃癌细胞 MGC803 血管
生成拟态的作用及其机制
虞 迪1，朱峰妍2，曹志飞1，王薇丹2，鲍美美1，顾振纶2，周泉生1
(1． 苏州大学医学部 江苏 苏州 215123;2． 苏州中药研究所 江苏 苏州 215007)
doi:10． 3969 / j． issn． 1001 － 1978． 2013． 02． 26
文献标志码:A 文章编号:1001 － 1978(2013)02 － 0261 － 05
中国图书分类号:R284． 1;R329． 2;R364． 3;R394. 2;
R735. 202. 2;R979. 1
摘要:目的 以毛茛有效部位 D1 为研究对象，研究其对人
胃癌细胞 MGC803 血管生成拟态的作用。方法 采用细胞
粘附实验检测毛茛有效部位 D1 对人胃癌细胞 MGC803 粘附
作用的影响;采用细胞划痕实验观察 D1 对 MGC803 细胞迁
移能力的影响;采用 Matrigel肿瘤细胞类血管生成模型观察
收稿日期:2012 － 10 － 26，修回日期:2012 － 11 － 21
基金项目:苏州市科技支撑计划项目(No SS201004)。
作者简介:虞迪(1988 －) ，女，硕士，研究方向:抗肿瘤血管生成药物
研发。E-mail:yuer19880915@ yahoo． cn;
顾振纶(1936 －) ，男，教授，博士生导师，研究方向:心血
管和肿瘤药理学，通讯作者，Tel:0512-65190599，E-mail:
zhenlungu． 2003@ 163． com
D1 对 MGC803 体外类血管生成的影响;采用半定量 RT-PCR
方法检测 D1 对 MGC803 血管生成拟态相关基因的作用。结
果 毛茛有效部位 D1 可有效地抑制人胃癌细胞 MGC803 细
胞粘附、细胞迁移和人胃癌细胞 MGC803 介导的血管生成拟
态并呈剂量依赖性。半定量 RT-PCR 实验结果显示，D1 能
明显抑制 MGC803 血管生成拟态相关基因 Sema 4D、VE-
Cadherin、MMP2 和 Integrin β5 的表达。结论 毛茛有效部
位 D1 通过抑制血管生成拟态相关基因 Sema 4D、VE-Cadher-
in、MMP2 和 Integrin β5 的表达来抑制人胃癌细胞 MGC803
细胞粘附、细胞迁移和血管生成拟态，提示毛茛有效部位 D1
是一个抗胃癌血管生成拟态的候选药物。
关键词:毛茛;胃癌;血管生成拟态;MGC803;细胞粘附;细胞
迁移
实体肿瘤需要血液供应才能持续生长和发生血
行转移，长期以来，人们一直认为肿瘤血管生成是
·162·中国药理学通报 Chinese Pharmacological Bulletin 2013 Feb;29(2) :261 ～ 5
其获得血液供应的唯一途径。1999 年，Maniotis 等
发现了一种与经典的肿瘤血管生成途径完全不同
的、不依赖内皮细胞的全新的肿瘤血管生成模式，即
肿瘤细胞可以通过自身变形和与血管外基质作用，
形成可以输送血液的管道，并与宿主血管相连接，使
肿瘤获得血液供应，将其命名为血管生成拟态(Vas-
culogenic mimicry，VM)［1］。它的发现为肿瘤的治疗
方向提供了新的思路，成为近年来肿瘤学研究新的
热点。
最近，我们建立了多种体内外肿瘤干细胞和肿
瘤血管生成为主体的肿瘤形成模型，并应用这些新
模型对 100 余种中草药进行筛选工作，在体外实验
中发现多种常用中药的组分具有显著的抗血管生成
作用［2，3］。其中，中草药毛茛科的毛茛具有较好的
抗体外血管生成的作用，经过一系列的提取纯化，得
到了毛茛中抗癌有效部位 D1。本研究将在此基础
上进一步研究毛茛有效部位 D1 对人胃癌细胞
MGC803 血管生成拟态的影响，并初步探讨其作用
机制。
1 材料
1． 1 细胞系 人胃癌细胞 MGC803，为本实验室保
存，培养于 DMEM(高糖)培养基。置培养箱内 5%
CO2、37℃常规培养，2 d 换液 1 次，3 ～ 4 d 传代 1
次。
1． 2 主要实验药品 毛茛有效部位 D1，用二甲基
亚砜(DMSO)溶解，用 DMEM(高糖)培养基稀释成
所需浓度。
1． 3 主要试剂 DMEM(高糖)培养基，购自 Hy-
Clone公司;胎牛血清(GIBCO 公司) ;RNase A:美
国 Biomiga 公司;二甲基亚枫(DMSO) ，购自美国
Sigma公司;Alamarblue 试剂、Trizol 试剂:购自美国
Invitrogen公司;逆转录试剂盒:Fermentas，美国;PCR
试剂盒:大连宝生物工程有限公司;引物由上海生工
生物工程技术服务有限公司;Matrigel，BD公司。
2 方法
2． 1 毛茛有效部位 D1 的提取 取干燥的毛茛全
草剪碎，分别用 10 倍、8 倍和 6 倍重量的 85%乙醇
回流提取 3 次，抽滤合并提取液，减压浓缩至无醇
味，分别用等体积的石油醚、氯仿、乙酸乙酯萃取若
干次至有机溶剂层为浅绿色。毛茛氯仿部位上样于
200 ～ 300 目的硅胶柱，乙酸乙酯 －甲醇系统(9∶ 1→
1 ∶ 1)梯度洗脱，收集乙酸乙酯 －甲醇(9 ∶ 1)流分，
蒸干得膏状物即毛茛 D1 组分。
2． 2 细胞粘附实验 将不同浓度 D1 处理人胃癌
细胞 MGC803 24 h，用无血清培养基重悬后用台盼
蓝计数活细胞，调整细胞密度接种于 0. 1%明胶包
被的 96 孔板中。待细胞贴壁后吸弃培养基，PBS 洗
3 次，加入新鲜培养基，以 10 μl /孔加入 Alamarblue
试剂。2 h 后用酶标仪测 OD560 /590 值，计算细胞
粘附率。实验独立重复 3 次。
2． 3 细胞迁移实验 将处于对数生长期的
MGC803 细胞以合适密度接种于 6 孔板中，24 h 后
进行划痕，吸弃培养基后用 PBS 洗 3 次，重新加入
含不同浓度 D1 的 5% FBS培养基，分别于不同时间
拍照。实验独立重复 3 次。
2． 4 Matrigel 实验 实验前一天将 Matrigel 置于
冰上过夜，实验时取融化的 Matrigel，加入到 48 孔板
中，37℃孵育 0. 5 h。将事先给予 D1 作用 24 h 的
MGC803 活细胞接种在 Matrigel 上，于 37℃、5%
CO2 培养箱培养 4 h后染色拍照。
2． 5 RT-PCR法检测血管新生相关 mRNA的表达
采用 Trizol 提取细胞总 RNA，逆转录合成 cDNA
(引物序列详见 Tab 1)。PCR条件为 94℃预变性 3
min;94℃变性 30 s，55℃退火 30 s，72℃延伸 1 min，
22 － 35 个循环，72℃延伸 8 min。PCR产物经 1. 5%
琼脂糖凝胶电泳并拍照，实验独立重复 3 次。
2． 6 统计学分析 实验数据以 珋x ± s 表示，采用
SPSS 16. 0 统计软件中 Oneway ANOVA 进行分析，
组间差异采用 LSD检验。
3 结果
3． 1 毛茛有效部位 D1 对人胃癌细胞 MGC803 细
胞粘附的作用 通过设定不同的药物浓度，在细胞
培养 30 min后可以发现高浓度的 D1 能明显抑制细
胞粘附。当浓度大于或等于 40 mg·L －1时几乎没
有细胞粘附，而在低浓度时细胞能粘附。结果表明
高浓度的 D1 对人胃癌细胞 MGC803 具有明显的粘
附抑制作用，见 Fig 1。
Fig 1 Effect of D1 on MGC803 cell adhesion
* P ＜ 0. 05，＊＊P ＜ 0. 01 vs control
·262· 中国药理学通报 Chinese Pharmacological Bulletin 2013 Feb;29(2)
3． 2 毛茛有效部位 D1 对人胃癌细胞 MGC803 细
胞迁移的作用 通过比较对照组和给药组细胞伤口
愈合程度来判断迁移能力，以 0 h作为对照，在 12 h
和 24 h时分别观察其迁移情况，如 Fig 2所示，
10 mg·L －1和 20 mg·L －1的毛茛有效部位 D1 能明
显抑制细胞 MGC803 的迁移。
Tab 1 Primer sequence table of target gene
Gene /mRNA ID Primer Sequence(5-3) PCR production size /bp
β-actin Upstream primer AAGAGCTACGAGCTGCCTGACG 420
(NM_001101． 3) Downstream primer CGCCTAGAAGCATTTGCGGTGG
VE-Cadherin Upstream primer CTGTCTACTCCTTATCCCTTGGTTT 372
(NM_001795． 3) Downstream primer GTCAGTGTTATCTACAATCCCTTGC
Sema4D Upstream primer TGTCTGTGGAGTATGAGTTTGTGTT 552
(NM_006378． 3) Downstream primer GGGTGTAGTTCACATCTTTCTTGAT
VEGFA Upstream primer AGAAGAGACACATTGTTGGAAGAAG 439
(NM_003376． 4) Downstream primer CGGTACAAATAAGAGAGCAAGAGAG
MMP2 Upstream primer TTCCGCTTCCAGGGCACATCCT 274
(BC002576． 2) Downstream primer TGCGGTCGTCATCGTAGTTGGC
MMP9 Upstream primer GTTTGGAAACGCAGATGGCG 315
(NM_004994) Downstream primer AAGAGCTTGTCCCGGTCGTA
Intergrin α5 Upstream primer AGGCTAATACCAGCCAGCCA 423
(NM_002205) Downstream primer CACCTAAAACCACACGGCCA
Intergrin β3 Upstream primer AAGGACAGCCTGATCGTCCA 413
(NM_000212) Downstream primer TTGCAGTAGTAGCCGGTCCA
hintergrin β5 Upstream primer TGCCATGCAGGTTACATCGG 353
(NM_002213) Downstream primer ATCATGACGCAGTCCTTGGC
PHD2 Upstream primer AACAAGCACGGCATCTGTGT 324
(NM_022051) Downstream primer ATAACCCGTTCCATTGCCCG
Ephrin B2 Upstream primer TTACCCAGATTGTGTACATAGAGCA 344
(NM_004093． 2) Downstream primer GGCTAACTGCAATGTGAAACTAAAG
Eph B4 Upstream primer GTCACTGCATTGAACGGGGT 372
(NM_004444) Downstream primer ATCCAGTTGGGTCTGGCTGT
Fig 2 Effect of D1 on MGC803 cell migration
Represemative images of wound healing assay with 5% FBS，show that MGC803 was treated by 0，5，10，20 μg·ml －1 D1，12 h and 24 h after scrap-
ing the wounds (Magnification × 200)
·362·中国药理学通报 Chinese Pharmacological Bulletin 2013 Feb;29(2)
3． 3 毛茛有效部位 D1 对人胃癌细胞 MGC803 体
外类血管生成的影响 实验结果显示，当毛茛有效
部位 D1 浓度分别为 0、5、10、20 mg· L －1 时，
MGC803 细胞形成完整管腔的能力逐渐减弱，当浓
度为 20 mg·L －1时，无法形成血管。与空白组比
较，D1 能使 MGC803 管腔形成数及管腔长度明显减
少 ，结果表明 D1 可以抑制 MGC803 体外类血管结
构的形成，见 Fig 3。
Fig 3 Effect of D1 on MGC803 cube formation
Represemative images of Matrigel at 4 h in the absence or the pres-
ence of D1 (0，5，10，20 μg·ml －1) ，staining with Wright-Giemsa Mag-
nification × 40
3． 4 毛茛有效部位 D1 对人胃癌细胞 MGC803 血
管相关基因表达的影响 为进一步验证 D1 对胃癌
细胞 MGC803血管生成拟态相关基因表达的影响，我
们采用 RT-PCR的方法检测了一系列血管生成拟态
相关基因的表达情况。如 Fig 4所示，VE-Cadherin、
Fig 4 Effect of D1 on MGC803 vasculogenesis related genes
MGC803 incubated with D1 (0. 25 μg·ml －1)for 48 h were sub-
jected to RT-PCR．
Sema 4D、MMP2 和 Integrin β5 的表达受到了不
同程度的抑制，而VEGFA和PHD2并无明显变化。
说明 D1 选择性下调了 MGC803 细胞血管生成拟态
VE-Cadherin，Sema 4D，MMP2 和 Integrin β5 基因的
表达，从而抑制了血管生成拟态。
4 讨论
VM在肿瘤生物学中可能具有十分重要的意
义。理论上，肿瘤的生长需要足够的血液供应，尤其
是生长迅速的恶性肿瘤，单靠血管生成不能满足生
长的需求。而 VM 由于没有内皮细胞的屏障作用，
可以为肿瘤的生长提供良好的血液灌注且有利于肿
瘤细胞的转移。因此，抑制 VM的形成，可切断肿瘤
细胞的营养来源，抑制其生长与转移［3］。毛茛(Ra-
nunculus japonicus Thumb)是多年生草本毛茛科毛
茛属植物，具有镇痛、消炎、抗菌和增强记忆力等多
种活性［4 － 5］。但是，关于毛茛的抗肿瘤作用目前尚
未见报道。在本研究中我们发现，毛茛有效部位 D1
可有效地抑制人胃癌细胞 MGC803 细胞粘附、细胞
迁移和胃癌细胞介导的体外肿瘤血管生成拟态并呈
剂量依赖性。
目前，VM 分子机制还不十分清楚，可能涉及肿
瘤细胞基因型的转变、肿瘤细胞与细胞外基质的相
互作用、肿瘤细胞分子信号改变等，其中血管内皮细
胞相关基因的异常表达，以及肿瘤细胞与细胞外基
质发生相互作用起着主要的作用［6，7］。研究发现，
一些分子信号的传递，如 VE-钙黏蛋白(VE-Cadher-
in)、EphA2、磷酯酰肌醇-3 激酶(PI3K)及基质金属
蛋白酶家族(MMPs)等可能参与 VM 的形成。VE-
钙黏蛋白是一种介导细胞与细胞间互相粘附的
Ca2 +依赖性跨膜蛋白，属于钙黏素家族成员，其主要
作用是介导同型细胞之间的相互粘附，当 VE-钙黏
蛋白下调时，生成 VM的能力丧失，这表明 VE-钙黏
蛋白与 VM 的形成有着密切的关系［8 － 10］。Sood 等
对袭性卵巢癌的研究发现，基质金属蛋白酶(MMP-
1、MMP-2、MMP-9、MMP-14)在 VM 周围大量分泌，
加入金属蛋白酶抑制剂则抑制 VM 的形成［11］。In-
tegrin β5 是细胞表面二聚体整合蛋白其中的一个亚
基，主要有 Integrin α5-Integrin β3 和 Integrin α5-In-
tegrin β5 两种蛋白。这类蛋白主要介导细胞的粘
附［12］。本研究发现，毛茛有效部位 D1 能抑制血管
生成拟态相关基因 Sema 4D、VE-Cadherin、MMP2 和
Integrin β5 的表达并呈剂量依赖性，提示毛茛有效
部位 D1 可能通过多条 VM 相关的信号通路来抑制
肿瘤血管生成拟态。
综上所述，毛茛有效部位 D1 可能通过抑制 VE-
·462· 中国药理学通报 Chinese Pharmacological Bulletin 2013 Feb;29(2)
Cadherin、Sema 4D、MMP2 和 Integrin β5 的表达从而
抑制人胃癌细胞 MGC803 细胞粘附、细胞迁移和血
管生成拟态。在此基础上，我们将进一步对毛茛有
效部位 D1 进行活性分离，以期得到具有抗胃癌作
用的有效单体。
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Effect of ranunculus japonicus components D1 on
vasculogenic mimicry of human gastric cancer cell MGC803
YU Di1，ZHU Feng-yan2，CAO Zhi-fei1，WANG Wei-dan2，BAO Mei-mei1，GU Zhen-lun1，2，ZHOU Quan-sheng1
(1． Medical College，Soochow University Medica，Suzhou Jiangsu 215123，China;
2． Suzhou Institute of Chinese Meteria Medica，Suzhou Jiangsu 215007，China)
Abstract:Aim To study the effect of ranunculus ja-
ponicus components D1 on vasculogenic mimicry of hu-
man gastric cancer cell MGC803 in vitro and its possi-
ble mechanisms． Methods The effect of D1 on the
cell adhesion of human gastric cancer cell MGC803 was
observed by cell attachment assay． The effect of D1 on
the cell migration of MGC803 was observed by cell
wound healing assay． The function of D1 on the tube-
like structures formation in human gastric cancer cell
MGC803 in vitro were observed by tube formation as-
say． The effect of D1 on the expression of vasculogenic
mimicry related genes was assessed by semi-quantita-
tive RT-PCR assay． Results Ranunculus japonicus
components D1 effectively inhibited human gastric
cancer cell MGC803 cell adhesion，cell migration and
cancer cell mediated vasculogenic mimicry in vitro in a
dosage-dependent manner． Furthermore， the semi-
quantitative RT-PCR showed that D1 markedly inhibi-
ted the expression of vasculogenic mimicry related
genes VE-Cadherin，Sema 4D，MMP2 and Integrin
β5． Conclusion Ranunculus japonicus components
D1 can effectively inhibit human gastric cancer cell
MGC803 cell attachment，cell migration and cancer
cell mediated vasculogenic mimicry by down regulating
vasculogenic mimicry related genes VE-Cadherin，Se-
ma 4D，MMP2 and Integrin β5． The study suggests
that D1 is a promising candidate of anti-gastric cancer
mediated vasculogenic mimicry．
Key words:ranunculus japonicus;gastric cancer;vas-
culogenic mimicry;MGC803;cell attachment;cell
migration
·562·中国药理学通报 Chinese Pharmacological Bulletin 2013 Feb;29(2)