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生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2011 年第 9 期
玉米 AGPase基因启动子的克隆及鉴定
王帅 吴颖 苏胜忠 刘宏魁 李世鹏 单晓辉 原亚萍
(吉林大学植物科学学院，长春 130062)
摘 要: 以玉米基因组 DNA为模板，通过 PCR技术扩增得到了腺苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶 AGPase基因编码区上游
1 912 bp的启动子(AGPasep)序列。该序列包含 TATA-box，CAAT-box等一些高等植物特有的启动子基本核心序列，推断其为
一种新的启动子。为了验证该序列是否具有启动子功能，构建了含有此序列的植物表达载体 pCAM-AGPasep，通过农杆菌介
导法转化玉米愈伤组织进行瞬时表达。GUS染色结果表明，该序列可以驱动 GUS基因的表达，具有启动子功能。
关键词: 玉米 AGPase 启动子 GUS瞬时表达
Cloning and Identification of Maize AGPase Gene Promoter
Wang Shuai Wu Ying Su Shengzhong Liu Hongkui Li Shipeng Shan Xiaohui Yuan Yaping
(Plant Science College of Jilin University，Changchun 130062)
Abstract: Genetic DNA of maize was used as total template to amplify the 1 912 bp promoter upon adenosine diphosphorate glu-
cose pyrophosphorylase AGPase coding region using PCR in this research and named AGPasep． The higher plants basic cored promoter
sequences，such as TATA-box and CAAT-box were found among the AGPasep，which is supposed to be a new promoter． To indentify the
promoter function of the sequence，we constructed a plant expression vector(pCAM-AGPasep)that was transformed into the maize cal-
lus through Agrobacterium-mediated transformation for GUS transient expression． The GUS activity was detected in pCAM-AGPasep-
transformed maize callus that indicatd this sequence has the promoter function．
Key words: Maize AGPase promoter GUS transient expression
收稿日期:2011-03-21
基金项目:国家转基因生物新品种培育重大专项(2009ZX08003-024B)
作者简介:王帅，男，硕士研究生，研究方向:植物分子生物学与基因工程;E-mail:plantscience@ yahoo． cn
通讯作者:原亚萍，博士，教授，研究方向:植物分子生物学与基因工程;E-mail:yapingyuan@ hotmail． com
植物的生长发育受基因调控，启动子作为调控
基因表达的重要元件，控制着基因在特定组织、发育
阶段及环境条件下的表达［1］。目前，基因工程中存
在的首要问题是外源基因的表达水平、表达部位等，
而启动子在决定基因表达方面起关键作用。新启动
子的发现，无论对于基因表达机理的研究，还是在转
基因研究加以利用方面都具有重要的科学意义［2］。
近年来，人们相继分离和鉴定了多种种子特异性启
动子，如水稻谷蛋白启动子［3］、油菜 napin 蛋白启动
子［4］、豆球蛋白启动子［5］和玉米醇溶蛋白启动子［6］
等，都显示出了显著效果。淀粉是高等植物的主要
能量贮存物质［7］，腺苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶
(AGPase)是催化淀粉合成的第一个步骤的酶，它催
化 1-磷酸葡萄糖形成 ADPG作为合成淀粉的直接底
物［8 － 11］。AGPase是玉米籽粒淀粉生物合成的重要
调剂位点和枢纽，在籽粒淀粉积累过程中起着关键
作用，显著影响淀粉产量。因此，为了提高 AGPase
的表达水平，进一步提高淀粉含量，本研究对玉米
AGPase编码区上游的启动子序列进行分子克隆，并
对其功能进行验证，旨在为下一步提高玉米淀粉合
成相关酶的表达和转基因研究奠定基础。
1 材料与方法
1． 1 材料
1． 1． 1 试验材料 玉米自交系 B73，由吉林大学植
物科学院原亚萍玉米研究团队自交纯合保存。
1． 1． 2 菌种和试剂 大肠杆菌 DH5α、根癌农杆菌
EHA105 和 pCAMBIA3301 质粒为本实验室保存，克
隆载体 pGM-T easy vector 购于北京天根公司，T4
2011 年第 9 期 王帅等:玉米 AGPase基因启动子的克隆及鉴定
DNA连接酶、rTaq DNA聚合酶、限制性核酸内切酶
等购自 TaKaRa 公司，DNA 回收试剂盒购自博日公
司，氨苄霉素、卡那霉素、利福平(Rif)和 5-溴-4-氯-
3-吲哚葡糖苷酸(X-Gluc)购自上海生工。其他试剂
均为进口或国产分析纯，测序工作由华大基因公司
完成。
1． 2 方法
1． 2． 1 玉米基因组 DNA 的提取 利用 CTAB 改
良［12］法从玉米幼嫩叶片中提取基因组 DNA。
1． 2． 2 PCR 扩增 根据公布的玉米基因组(ht-
tp:/ /www． maizesequence． org)AGPase 基因编码区
上游序列设计引物，因后续构建载体的需要，在上游
引物 5端加 EcoR I 酶切位点，下游引物 5端加 Bgl
II酶切位点(下划线部分)。上游引物 P1:5-CG-
GAATTCAGGAGATAGAGTGGCGTCTG-3;下游引物
P2: 5-GGAAGATCTGCACACCTGCACGATCAC-3，
引物由华大基因公司合成。PCR 反应体系:10 ×
PCR reaction buffer 2． 5 μL，Primer(10 μmol /L)各
0． 5 μL，dNTP(10 mmol /L)0． 5 μL，rTaq DNA 聚合
酶(5 U /μL)0． 3 μL，模板(20 ng /μL)2 μL，ddH2O
18． 7 μL，总体积 25 μL。PCR 反应程序:95℃预变
性 5 min;94℃变性 1 min，57℃退火 1 min，72℃延伸
2 min，35 个循环;72℃延伸 10 min，4℃保存。
1． 2． 3 PCR 产物的回收 PCR 反应产物在 1%
的琼脂糖凝胶电泳上检测。然后将含有目的片
段的胶切下，利用 DNA 回收试剂盒回收目的
片段。
1． 2． 4 目的片段的克隆和重组子筛选鉴定 回收
产物与 pGM-T连接后转化大肠杆菌感受态 DH5α。
37℃ 160 r /min的摇床上振荡培养约 1 h之后，吸取
100 μL菌液至 LB固体培养基(Amp 100 mg /L )上，
37℃培养 12 h。挑取单菌落，进行 PCR 及酶切鉴
定。连接反应体系:T4 DNA 连接酶 buffer，T4 DNA
连接酶(350 U /μL) ，pGM-T 载体(50 ng /μL)各 1
μL，PCR 产物(60 ng /μL)7 μL，总体积 10 μL。酶
切体系:10 × H buffer 1 μL，内切酶各 0． 5 μL，质粒 5
μL(约 0． 5 μg) ，ddH2O补平至 10 μL。
1． 2． 5 克隆片段的序列分析 取阳性菌液交由上
海生工测序完成，核酸序列分析用 DNAMAN，并用
Plantcare 数据库(http:/ /bioinformatics． psb． ugent．
be /webtools /plantcare /html /)和植物顺式元件查询
数据库 PLACE 对已克隆的 AGPase 基因启动子
1 912 bp片段做顺式作用元件分析。
1． 2． 6 植物表达载体的构建及鉴定 将克隆的
AGPase基因启动子片段用 EcoRⅠ和 BglⅡ酶切，回
收后与 pCAMBIA3301 的 EcoRⅠ和 BglⅡ酶切载体
进行连接，得到 AGPasep与 GUS基因融合的表达载
pCAM-AGPasep。对植物表达载体 pCAM-AGPasep
进行 PCR 和限制性内切酶酶切鉴定，然后对酶切
片段进行 1%琼脂糖凝胶电泳检测。
1． 2． 7 农杆菌转化植物表达载体和 GUS 活性检测
将植物表达载体 pCAM-AGPasep质粒转入农杆菌
EHA105 菌株中，涂在含有卡那霉素(50 μg /mL)
YEP 固体培养基平板上，28℃选择培养 1 － 2 d。取
单菌落用碱裂解法提取质粒并进行酶切鉴定和
PCR 检测。利用农杆菌介导方法对玉米愈伤组织
进行侵染，参照 Jefferson［13］的方法，对侵染愈伤组织
和未侵染愈伤组织进行 GUS 染色，37℃染色 36 h。
观察照相。
2 结果与分析
2． 1 启动子片段的克隆与扩增
用特异引物 P1，P2 PCR 扩增玉米 B73 基因组
DNA，得到长 1 912 bp 的目的片段(图 1) ，命名为
AGPasep，PCR产物回收后与克隆载体 pGM-T连接，
形成重组载体 pGM-T-AGPasep，转化大肠杆菌
DH5α，进行 PCR和酶切鉴定(图 2) ，片段大小和预
期一致。取阳性克隆测序。
M． DL2000;1． PCR空白对照;2．扩增产物
图 1 AGPasep PCR扩增产物
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生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2011 年第 9 期
图 2 pGM-T-AGPasep载体的鉴定
2． 2 PCR扩增片段的序列分析
序列分析表明，克隆的 AGPasep 序列与公布
的玉米基因组(http:/ /www． maizesequence． org)
序列同源性达 99 ． 66%。采用 Plantcare 数据库和
植物顺式元件查询数据库 PLACE 对已克隆的
AGPase 基因启动子 1 912 bp 片段做顺式作用元
件分析，在 AGPasep 序列(图 3)中包含高等植物
启动子所特有的基本核心序列 TATA-box 和
CAAT-box［14］，以及多种光响应元件 Sp1、A-box、
G-box 和 I-box，序列中还发现种子特异表达所需
的特殊调控元件 GCN4-motif、RY-element、AACA、
ACGT 和 CCAA，GC-box 是真核启动子的基本调
控元件［15］。
图 3 玉米 AGPasep序列及特征分析
2． 3 融合基因表达载体的构建和转化
用 EcoRⅠ和 BglⅡ酶切重组质粒 pGM-T-AG-
Pasep，回收克隆片段，pCAMBIA3301 的 EcoRⅠ和
BglⅡ酶切载体进行连接，得到 AGPasep 与 GUS 基
因融合的表达载体 pCAM-AGPasep。将获得的重组
表达载体转化农杆菌 EHA105 菌株，并经质粒 PCR
和酶切分析(图 4) ，得以确证。
2． 4 GUS基因瞬时检测
将 AGPasep 与 GUS 基因融合，构建成 pCAM-
AGPasep表达载体，通过农杆菌介导的方法侵染玉
米愈伤组织，对侵染和未侵染的愈伤组织同时做
GUS瞬时表达分析，侵染的愈伤组织被染成蓝色而
未侵染的愈伤组织则没有蓝色出现(图 5) ，表明
AGPasep具有启动 GUS表达的功能。
3 讨论
利用转基因技术提高玉米淀粉含量，必须具备
可使外源目的基因在转基因玉米中稳定表达的启动
子。本研究成功地克隆了玉米 AGPase 基因编码区
上游 1 912 bp 的启动子片段(AGPasep) ，并且构建
成 pCAM-AGPasep表达载体，通过农杆菌介导方法
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2011 年第 9 期 王帅等:玉米 AGPase基因启动子的克隆及鉴定
图 4 pCAM-AGPasep载体的鉴定
图 5 AGPase启动子活性的 GUS瞬时检测
侵染玉米愈伤组织进行了 GUS 瞬时表达分析，证明
了 AGPasep的启动子功能，为转基因玉米研究提供了
试验依据和新的转基因元件。AGPasep 序列中包含
基本的启动元件 TATA-box及大量与增强转录效率有
关的 CAAT-box，TATA-box 是 RNA 聚合酶 II 的识别
位点，也是一些反式作用因子与 DNA 相互作用的位
点之一［16］，CAAT-box 对基因转录有较强的激活作
用，对两个方向都可激活，而且作用距离不定［17］，还
存在许多对光响应元件 Sp1、A-box、G-box和 I-box，序
列中还出现了许多种子特异表达所需的特殊调控元
件，其中“GCN4(TGAGTTTC)”是胚乳表达中的顺式作
用元件，RY-element(CATGCA)是种子特异调控中的顺
式作用元件［18，19］，AACA［20］、ACGT 和 CCAA［21］这些调
控元件可能对 AGPasep的胚特异表达方式及表达强度
起着重要作用，G-box(CCACGTGG)对胚乳表达也有重
要调控作用［22］。综上所述，本试验克隆的启动子具备
种子特异表达的基本顺式作用元件和特殊调控元件，
可推测此启动子应该具备种子特异表达启动子的功
能，具体功能需进行进一步分析。
参 考 文 献
［1］李杰，张福城，王文泉，等． 高等植物启动子的研究进展． 生物
技术通讯，2006，17(4) :658-661．
［2］Gurr SJ，Rushton PJ． Engineering plants with increased disease re-
sistance:how are we going to express it?． Trends in Biotechnology，
2005，23(6) :283-290．
［3］Yang L，Tada Y，Yomamoto MP，et al． A transgenic rice seed accumu-
lating all anti-hypertensive peptide reduces the blood pressure of sponta-
neously hypertensive rats． FEBS Letter，2006，580(13):3315-3320．
［4］Taylor DC，Francis T，Guo Y，et al． Molecular cloning and charac-
terization of a KCS gene from Cardamine graeca and its heterologous
expression in Brassica oilseeds to engineer high nervonic acid oils for
potential medical and industrial use． Plant Bioteehnology Journal，
2009，7(9) :925-938．
［5］Tiwari S，Mishra DK，Roy S，et al． High level expression of s func-
tionally active cholera toxin B:rabies glycoprotein fusion protein in
tobacco seeds． Plant Cell Reports，2009，28(12) :1827-1836．
［6］Zhang J，Martin JM，Beccher B，et al． Seed-specific expression of
the wheat puroindoline genes improves maize wet milling yields．
Plant Biotechnology Journal，2009，7(8) :733-743．
［7］Seo B，Kim S，Scott MP，et al． Functional interactions between het-
erologously expressed starch-branching enzymes of maize and the
glucogen synthases of brewer’s yeast． Plant Physiol，2002，128
(4) :1189-1199．
［8］Ball S，Marianne T，Dirick L，et al． A Chlamydomonas reinhardtii
low-starch mutant is defective for 3-phosphoglycerate activation and
orthophosphate inhibition of ADP-glucose pyrophosphorylase． Planta，
1991，185(1) :17-26．
［9］ Denyer K，Dunlap F，Thorbjornsen T，et al． The major from of
ADP-glucose pyrophosphorylase in maize(Zea mays L．)endosperm
is extraplastidial． Plant Physiol，1996，112(2) :779-785．
［10］Denyer K，Foser J，Smith AM． The contributions of adenosine 5
diphosphoglucose pyrophosphorylase and starch branching enzyme
to the control of starch synthesis in developing pea embryos． Planta，
1995，197(1) :57-62．
［11］Smith-white BJ，Preiss J． Comparison of proteins of ADP-glucose pyro-
phosphorylose from diverse sources． J Mol Evol，1992，34(5):449-464．
［12］陶刚，刘作易，朱英，等．水稻玉米基因组 DNA提取方法的改
进．贵州农业科学，2004，32(6) :21-22．
［13］ Jefferson RA． Assaying chimeric genes in plants:The GUS gene fusion
system． Plant Molecular Biology Reporter，1987，5(4):384-405．
［14］ Rachael LN，Robert WW，Raymond LR． Eukaryotic DNA frag-
ments which act as promoters for a plasmid gene． Nature，1979，
277:324-325．
［15］Gao M，Fisher DK，Kim KN，et al． Independent genetic control of
maize starch branching enzyme IIa and IIb:isolation and character-
ization of a SBEIIa cDNA． Plant Physiol，1997，114(1) :69-78．
［16］孙晓红，陈明杰，潘迎捷． 启动子克隆概述． 食用菌学报，
2002，9(3) :57-62．
(下转第 89 页)
57
2011 年第 9 期 江程记等:ApCl基因在毕赤酵母中的表达
参 考 文 献
［1］Gao JM，Xiao Q，Ding LP，et al． Differential responses of lipid per-
oxidation and antioxidants in Alternanthera philoxeroides and Oryza
sativa subjected to drought stress． Plant Growth Regul，2008，56
(1) :89-95．
［2］Bolaos JA，Longstreth DJ． Salinity effects on water potential compo-
nents and bulk elastic modulus of Alternanthera philoxeroides(Mart)
griseb． Plant Physiol，1984，75:281-284．
［3］Longstreth DJ，Burow GB，Yu G． Solutes involved in osmotic adjust-
ment to increasing salinity in suspension cells of Alternanthera phi-
loxeroides riseb． Plant Cell，Tissue and Organ Culture，2004，78
(3) :225-230．
［4］唐昆．喜旱莲子草．湖南农业，2006(4) :16．
［5］ Joseph S，David WR，黄培堂，等． 分子克隆实验指南［M］． 第 3
版．北京:科学出版社，2002．
［6］陈春宝．人表皮生长因子(hEGF)串联体的构建以及在毕赤酵母
中的表达［D］．海口:华南热带农业大学，2007:32-34．
［7］郑燕影．人胰岛素样生长因子(huIGF-1)/毕赤酵母高效表达菌
株的筛选［D］．海口:华南热带农业大学，2004:35-38．
［8］PichiaPinkTM Expression system［M］． Invitrogen，2009．
［9］Keller H，Pamboukdjian N，Ponchet M，et al． Pathogen-induced elic-
itin production in transgenic tobacco generates a hypersensitive re-
sponse and nonspecific disease resistance． Plant Cell，1999，11(2) :
223-235．
(责任编辑 马鑫
櫧櫧櫧櫧櫧櫧櫧櫧櫧櫧櫧櫧櫧櫧櫧櫧櫧櫧櫧櫧櫧櫧櫧櫧櫧櫧櫧櫧櫧櫧櫧櫧櫧櫧櫧櫧櫧櫧櫧櫧櫧櫧櫧櫧櫧櫧
)
(上接第 75 页)
［17］Higo K，Ugawa Y，Iwamoto M． Plant cis-acting regulation DNA el-
ements(PLACE)database． Nucleic Acids Res，1999，27 (1) :
297-300．
［18］苗红梅，Fleming Joy E，吕德彬，等． 胚乳特异 sheIIa启动子在
小麦中的评价及特性分析．科学通报，2004，49(5) :451-456．
［19］蔡毅，谢东绿，王宗阳，等．水稻淀粉分支酶基因 5上游区缺
失对基因表达的影响．植物生理与分子生物学学报，2002，28
(1) :23-27．
［20］Washida H，Wu CY，Suzuki A，et al． Identification of cis-regulato-
ry elements required for endosperm expression of the rice storage
protein glutelin gene GIuB-1． Plant Molecular Biology，1999，40
(1) :1-12．
［21］Chamberland S，Daigle N，Bernier F． The legumin boxes and the
3part of a soybean beta-conglycinin promoter are involved in seed
gene expression in transgenic tobacco plants． Plant Molecular Biolo-
gy，1992，9(6) :937-949．
［22］张宪银，薛庆中．水稻胚乳特异性启动子 Gtl 的克隆及其功能
验证．作物学报，2002，28(1) :110-114．
(责任编辑 李楠
櫧櫧櫧櫧櫧櫧櫧櫧櫧櫧櫧櫧櫧櫧櫧櫧櫧櫧櫧櫧櫧櫧櫧櫧櫧櫧櫧櫧櫧櫧櫧櫧櫧櫧櫧櫧櫧櫧櫧櫧櫧櫧櫧櫧櫧櫧
)
(上接第 80 页)
［17］Tadiello A，Pavanello A，Zanin D，et al． A PLENA-like gene of
peach is involved in carpel formation and subsequent transformation
into a fleshy fruit． J Exp Bot，2009，60(2) :651-661．
［18］胡宗利，王燕，王翊，等．辣椒果实中 CaRIN 转录因子的克隆及
其表达分析．植物生理学通讯，2009，45(11) :1075-1080．
［19］Mouhu K，Hytonen T，Folta K，et al． Identification of flowering
genes in strawberry，aperennial SD plant． BMC Plant Biol，2009，
9:122．
［20］宿红艳，周盛梅，王磊，等．草莓 APETALA2 同源基因的克隆及
表达分析．西北植物学报，2005，25(10) :1937-1942．
(责任编辑 李楠)
98