全 文 ：收稿日期:2007-10-22
基金项目:国家948项目(2006-4-123)
作者简介:谭力(1982-),男,在读硕士,主要从事大肠杆菌代谢工程方面的研究
通讯作者:陈介南,Tel:86-0731-5623078,Fax:86-0731-5623078,E-mail:chenj@besti.or
木质纤维素降解后产生六碳糖和五碳糖,六碳糖以葡萄糖为主,兼半乳糖和甘露糖;五碳糖以木糖为
主,兼阿拉伯糖[1]。理想的生物质乙醇发酵菌应能发酵所有生物质来源的糖但自然界中缺少能将上述生物
质有效转化为乙醇的微生物菌种。近年来,根据代谢工程原理,利用基因工程技术对酵母和细菌进行遗传
改造,构建 C5/C6共发酵生成乙醇的程菌方案主要有两种:(1)以大肠杆菌和克雷伯氏菌等基质利用范围
广且能生成乙醇的菌作为受体菌引入新的代谢途径构建工程菌 [2,3];(2)以良好生产乙醇产菌株如酿酒酵
母和 Z.mobilis[4,5]等作为受体菌引入木糖或阿拉伯糖五碳糖的的代谢途径来构建工程菌从而拓展其底物利
用范围。但由于 E.coli其野生菌株能够利用非常广泛的碳源,其中包括六碳糖和五碳糖以及糖酸等物质,
而且还含有代谢五碳糖的磷酸戊糖途径中的整套基因和酶,其遗传图谱明确,容易培养、费用低等优点.遗
传学、生物化学和分子生物学方面已充分被人们了解,是目前基因工程中研究最广泛和最深的模式菌株。
构建的大肠杆菌工程菌株一般利用基因工程手段将运动发酵单胞菌的两个基因,丙酮酸脱羧酶基因
(pyruvatedecarboxylasepdc)及乙醇脱氢酶基因(AlcoholDehydrogenaseadh),克隆到大肠杆菌中,使丙酮酸
运动发酵单孢菌ZM4-pdc基因的克隆及在大肠杆菌
TOP10中的表达与活性分析
谭力 张伟涛 陈介南 王义强 韩笑
(中南林业科技大学生物环境科学与技术研究所,长沙 410004)
摘 要: 利用高保真聚合酶从运动发酵单胞菌中克隆出丙酮酸脱羧酶基因,加 A后克隆到pGM-T载体,测序验
证无误。经酶切、连接、转化到表达载体pUC-18。形成重组质粒pUC-18-pdc,转化到大肠杆菌TOP10中,经定性定量分
析丙酮酸脱羧酶基因在大肠杆菌中高效表达,成功构建出乙醛的代谢途径。
关键词: 运动发酵单孢菌 丙酮酸脱羧酶 克隆 乙醛 代谢工程
CloingandExpressionActivityAnalysisofpdcGenefrom
ZymomonasmobilisZM4inE.coliTOP10
TanLiZhangWeitao ChenJienan WangYiqiang HanXiao
(InstituteofBiologicalandEnviromentalScience&Technology,CentralSouthUniversityofForestryandTechnology,
Changsha410004)
Abstract: Thegenepdcencoding pyruvatedecarboxylaseofZymomonasmobiliswasamplifiedusingHigh-
fidelityDNAPolymerasefrom totalDNA.ClonedintopGM-Tvector afteradding A.Thevectorwasverifiedby
sequencing.Therecombinantplasmid,pUC-18-pdcwasconstructedbyinsertingpdcintoexpresionvectorpUC-18after
endonucleasesdigestingandligating,andthentransformedE.coliTOP10.TherecombinantstrainswereinducedbyIPTG
toexprespyruvatedecarboxylaseisexpresinghighlybymeansofquantitive-qualitativeanalysis,Aldehyde metabolism
pathwayisconstructed in E.coliTOP10.
Keywords: Zymomonasmobilis Pyruvatedecarboxylase Cloning Aldehyde Metabolicengineering
生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN·研究报告· 2008年第2期
生物技术通报Biotechnology Buletin 2008年第2期
脱羧生成乙醛,再有乙醛转化成乙醇。构建了各种不同类型的乙醇发酵重组菌株[6,7],获得选择性产生酒精
的能力。因此当前纤维燃料乙醇生产中的热点之一是对五碳糖和六碳糖共发酵过程特性进行研究致力于
构建可以高效转化木质纤维素水解产物为乙醇的微生物菌种,来生产廉价的酒精实现其产业化,对解决未
来能源短缺以及环保问题等都具有非常重大意义和潜在的商业价值。
目前,国内外构建的大肠杆菌工程菌株中主要有 Ingram构建的 PLOI295质粒型表达载体、Ohta等人设
计构建外源基因整合型菌株 K011、Hespel设计的利用营养缺陷型菌株 FMJ39引入 PLOI297构建的 FBR3/
4/5[1],以及国内构建的 pGM-T-PDC、EoliPp+a、PSE-PDC-ADHⅡ-teminator等。但是带有这些质粒的重组 E.
coli乙醇产量并没有很大的提高,带有 pdc和 adhB2个基因的 E.coliPp+a发酵含 5%葡萄糖的 LB培养
基其最大乙醇浓度也仅为 0.16%,与国外相比还有一定的距离。本研究在这基础上率先在丙酮酸脱羧酶的
结构基因前加入合适的 SD序列,调整合适的 SD与起始密码子 AUG之间的距离[11],并利用高保真的聚合
酶来扩增其序列,保证其碱基的正确性,测序结果与 GenBank公布 ZM4-pdc基因序列完全一致证明了基因
的保守性强,将乙醇脱氢酶基因导入大肠杆菌中,并对其转化菌株进行 SDS-PAGE分析与其理论大小
40kD一致同时也进行了乙醛平板活性检测,使其在大肠杆菌中得到高效表达。表明成功的构建出乙醇脱
氢酶基因的表达载体,改变了大肠杆菌的糖代谢途径为下一步构建利用木质纤维素高产燃料生物乙醇的
新型基因工程菌,提高其乙醇产率奠定基础和提供方向。
1 材料和方法
1.1 材料
1.1.1 菌种和质粒 运动发酵单胞菌(ZymomonasmobilisATTCC31821CICC10273)购自中国工业微生物菌
种保藏中心,大肠杆菌 TOP10和质粒 pGM-T购自北京天根生化科技有限公司,表达载体 pUC-18购自
Takara公司。
1.1.2 培养基 RM培养基 (10%葡萄糖,1%酵母膏,0.1%磷酸二氢钾,pH6.0)用于培养运动发酵单胞
菌,固体培养基添加 1.5%琼脂。LB培养基(1%蛋白胨,0.5%酵母膏,1%NaCl,pH7.0)用于大肠杆菌培
养,固体培养基添加 2%琼脂。乙醛指示平板:将 100mlLB固体培养基加热溶解后加入 200μg/mlamp,
1mmol/LIPTG,10ml20%葡萄糖和无菌希夫(Schif)试剂[8],避光保存。
1.1.3 主要试剂和仪器 Trisbase购自 Amersco公司,SDS购自 Sigma公司,EDTA购自上海生工生物工程
技术服务有限公司;蛋白酶 K购自 Merk公司,加 A试剂盒、PCR纯化试剂盒、质粒抽提试剂盒购自北京天
根生化科技有限公司,高保真聚合酶 PrimeSTARTMHS、rTaq酶、T4DNA连接酶、内切酶、琼脂糖凝胶回收试剂
盒购自 Takara公司;PCR扩增仪为 MJResearchInc.生产的 RTC-100型,岛津 UV-5420紫外分光光度计。
运动发酵单胞菌丙酮酸脱羧酶基因(pyruvatedecarboxylasepdc)扩增引物:
上游引物 5-actctagactgaacgaggaggtcgacgatgagtatactgtcggtacct-3,含内切酶 XbaI序列和 SD序列;
下游引物 5-gacctgcagctagaggagctgtaacag-3,含内切酶 PstI序列。
1.2 方法
1.2.1 运动发酵单胞菌总 DNA的提取 供试菌株在 RM液体培养基中培养至对数期后,离心收集菌体,
经 STE缓冲液洗涤后,用 TE悬浮菌体;加入 10%的 SDS使其终浓度为 1%,反复倒转离心管使菌体裂解;
加入蛋白酶 k至终浓度为 50μg/ml,37℃保温至菌液透明;加入 5mol/LNaCl至终浓度为 1mol/L,混匀后加入
等体积苯酚-氯仿抽提至界面无蛋白;取上清液,经乙醇沉淀、洗涤、干燥并溶解在低浓 TE中,通过岛津
UV-5420紫外分光光度计定量后贮存备用。
1.2.2 PCR反应、加 A反应和测序 每 20μl扩增反应体系为:10×bufer2μl,MgCl2(25mmol/L)2μl,dNTP
(2mol/L)2μl,pdc1(5-actctagactgaacgaggaggtcgacgatgagtatactgtcggtacc-350μmol/L)0.5μl,pcd2(5-gacctgcagct
agaggagctgtaacag-350μmol/L)0.5μl,模板 DNA50ng,PrimeSTARTMHS高保真聚合酶(2.5U/μl)2U,加超纯水
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M:200bpDNAmaker 1:pdc基因
图 1 pdc基因的 PCR产物鉴定电泳图
图 2 pUC18-pdc载体构建示意图
图 3 重组子的质粒电泳图
M:λHindⅢ DNAmarker 1:重组质
粒 pUC-18-pdc 2:质粒 pUC-18
谭力等:运动发酵单孢菌ZM4-pdc基因的克隆及在大肠杆菌TOP10中的表达与活性分析
补足。反应程序 94℃4min;94℃1min;59℃1min;72℃1min;34个循环;72℃5min。
将扩增平末端产物纯化后在 3末端加 A,反应体系:平末端 DNA片段 15μl,加 A反应液 4μl,Taq酶
1μl。反应条件:72℃保温 20~30min。
将加 A后的产物克隆在 pGM-T载体上,转化大肠杆菌 TOP10,委托上海生工生物工程技术服务有限
公司测定其全序列。
1.2.3 酶切、酶连及阳性转化子的筛选 将经过测序验证过的 pGM-T经 PstI和 XbaI酶切及 T4DNA连接
酶连,其反应体系参照说明书,酶切及酶连时间均过夜。目的片段 C经纯化后插入到同样酶切 pUC18中,
形成重组质粒 pUC-18-pdc转化 E.coliTOP10中,在 LB-Amp-X-gal-IPTG平板上,筛选得到白色转化子,再对
所得白色转化子提质粒进行电泳验证以及 PCR,酶切验证。
1.2.4 丙酮酸脱羧酶定性检测[9] 重组大肠杆菌在IPTG的诱导下能产生丙酮酸脱羧酶能将丙酮酸转化为乙
醛,乙醛与希夫试剂反应,使重组子菌落显紫红色。因此将重组菌株点种到乙醛指示平板上,同时以空白质粒转
入大肠杆菌作为对照,在IPTG诱导下,菌落变为紫红色表明有丙酮酸脱羧酶产生,反之没有。
1.2.5 丙酮酸脱羧酶表达产物分析 将构建好的重组质粒转化到大肠杆菌菌株,挑取单菌落到含 100μg/ml
Amp的 LB培养液,37℃振荡培养过夜,然后按 1%接种到新鲜的 LB培养液中,37℃培养至 A600约为
0.4～0.6时,加入 IPTG使终浓度达 1mmol/L,诱导表达 12h,取一定体积菌液 8000r/min离心 5min,收集菌
体,加入 200μlddH2O和 200μl上样缓冲液,沸水浴 5min后,取 10μl样品进行 SDS-PAGE分析。
2 结果
2.1 运动发酵单胞菌丙酮酸脱羧酶基因的克隆
以Zymomonasmobilis总DNA为模板,以高保真聚合酶PrimeSTARTMHS
扩增。PCR产物在1%琼脂糖凝胶上电泳检测扩增片断,结果见图1。结果表明
扩增片段大小约为1741bp,与预期一致。
2.2 加 A反应和测序
将扩增平末端产物纯化后在 3末端加 A,产物克隆在载体上,将
构建的克隆载体 pGM-T-pdc转化大肠杆菌 TOP10,送上海生工测定其
全序列,测序结果如下:
ACTTCTAGACTGAACGAGGAGGTCGACGagtatactgtc....
taacaagctcctctagCTGCAGGTC
下划线 TCTAGA为 XbaI的酶切位点,GAGGAGG为 SD序列,方框内 atg为起始密码子,下划线 CTGCAG为
PstI的酶切位点.结构基因序列与 GenBank网上公布的 ZymomonasmobilisZM4的 pdc基因(ACCESSION
AE008692REGION:1373405.1375111)一致。
2.3 表达载体 pUC-18-pdc的构建及重组子鉴定
克 隆 载 体 pGM-T-pdc经 XbaI和
PstI双酶切后,与同样经 XbaI和 PstI
处理的 pUC-18载体连接,连接后转化
到大肠杆菌 TOP10感受态细胞,其构
建总路线见图 2。
挑选白色重组子,提取质粒、PCR
验证及质粒电泳验证结果见图 3。结果
表明外源片段已经连接到表达质粒上。
重组的表达质粒命名为 pUC-18-pdc。
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生物技术通报Biotechnology Buletin 2008年第2期
2.4 丙酮酸脱羧酶的定性检测
将重组菌株接种到乙醛指示平板,37℃倒置培养过夜,结果
见图 4。结果显示重组菌株显紫红色,对照菌株颜色色很浅,说明
重组菌株有丙酮酸脱羧酶生成。
2.5 丙酮酸脱羧酶的蛋白电泳检测
TOP10(pUC-18-pdc)表达蛋白的 SDS-PAGE分析表明:重组
菌株在有很明显蛋白质特征条带出现,而对照菌株在相同位置
上没有特征条带出现,该蛋白质分子量与基因序列推测所得理
论分子量 60kD大小一致,该蛋白质即为表达的乙醇脱氢酶。
3 讨论
要在大肠杆菌建立一个新的酒精产生途径,必须同时在大肠
杆菌中导入乙醇脱氢酶基因和丙酮酸脱羧酶基因,使丙酮酸转
化为乙醛,再有乙醛转化为乙醇。本研究率先在丙酮酸脱羧酶的
结构基因前加入合适的 SD序列[10],并利用高保真的聚合酶来扩
增其序列,保证其碱基的正确性,使其在大肠杆菌中得到高效表
达。由乙醛指示平板上可以看出,导入了丙酮酸脱羧酶的重组菌
显色既红又大而没有导入丙酮酸脱羧酶的对照菌株既显色浅又
小,表明丙酮酸脱羧酶基因在重组菌中得到高效表达。本研究虽
然已经成功得到了丙酮酸脱羧酶基因的活性表达,但还不足已
利用木质纤维素的糖化产物来生产生物乙醇,要在大肠杆菌建
立一个新的酒精产生途径,必须同时在大肠杆菌中导入乙醇脱
氢酶基因和丙酮酸脱羧酶基因,使丙酮酸转化为乙醛,再有乙醛
转化为乙醇今后的工作重点是今后的工作重点是(1)利用基因
工程手段将另外一关键基因乙醇脱氢酶基因[11]与丙酮酸脱羧酶
基因串联一起置于 lac启动子,同时得到高效的共表达。(2)再通
过基因阻断或者基因敲除等手段改造其它代谢途径,控制其细胞内的碳代谢方向使其向生成乙醇的方向
进行。(3)受体菌中重组质粒的自主复制及编码基因的高效表达会大量消耗能量,由于生存竞争,不含质粒
的细菌生长速度远比含有质粒的细菌要快,经过若干代繁殖后,重组质粒会丢失。解决的方法可以在培养
基中添加抗生素或将外源基因整合到受体细胞染色体的非必需编码区上,使之成为染色体 DNA的一个组
成部分,从而增加其稳定性。前者在大规模生产上添加抗生素会提高生产成本,且造成环境污染,而后者则
是一劳永逸的方法。因此,在下一步工作将把目的基因整合到大肠杆菌染色体的非必需编码区上,使之成
为染色体 DNA的一个组成部分,从而增加其遗传稳定性。(4)采用化学,物理或者基因突变的方法诱变得
到其突变菌株。进一步改进、完善,以期构建出高效、稳定的,能够利用木质纤维素降解产物生产燃料乙醇
的新型工程菌株。
参考 文献
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图 4 乙醛指示平板
A:含有重组质粒 pUC-18-pdc的菌株
B:含有质粒 pUC-18的菌株
图 5 TOP10(pUC-18-pdc)表达蛋白
的 SDS-PAGE分析
M:蛋白质分子 marker 1:TOP10(pUC-18)表达
蛋白 2:TOP10(pUC-18-pdc)表达蛋白
(下转第190页)
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(上接第154页)
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龄幼虫的总蛋白进行了 SDS-PAGE,发现在 14.4kD~20.0kD之间相同的位置存在蛋白带,用抗 AeSCP-2的
多克隆抗体与 3种样品的总蛋白进行 westernblot杂交,发现这些组织和细胞中确实存在目的蛋白,这就说
明了在鳞翅目昆虫体内是存在具有 SCP-2结构域蛋白,且鳞翅目昆虫的 SCP-2蛋白和伊蚊的 SCP-2蛋白
极有可能是同一种蛋白,但不排除这两个目的 SCP-2蛋白存在某方面的差异,但这只是猜测,可以肯定的
是它们都含有胆固醇载体结构域,都属于同一家族。本实验只是初步的鉴定,要想证实它们是同一种蛋白,
还需进一步测定其分子结构,分离和鉴定其基因等诸多方面的研究。
2005年,Kim等筛选和鉴定了几种 AeSCP-2的抑制剂,这些抑制剂可与胆固醇竞争 AeSCP-2,与
AeSCP-2有相当高的亲和力。通过黄热伊蚊和烟草夜蛾的活体生测显示,抑制剂具有潜在杀虫剂活性和性
质,并表现出和活体相似效应,但对哺乳动物鼠细胞基本无毒性,对昆虫具有特异性[7]。显然,AeSCP-2是重
要的靶标蛋白,通过干扰或抑制 AeSCP-2的作用,阻断胆固醇转运途径,可控制黄热伊蚊种群数量和危害。
那么,同样也可以在鳞翅目害虫中找到同类的新靶标,开发新型的对脊椎动物安全的杀虫剂,从根本上控
制害虫的种群数量。近年来,由于棉铃虫对化学杀虫剂和生物杀虫剂抗性的持续增加,严重威胁着棉花产
量和相关行业的可持续发展,寻找新的靶标,并以此为基础开发、研制出新型、高效、环保的杀虫剂是害虫
防治的首要任务。SCP-2正是针对阻断昆虫代谢活动、阻碍或影响昆虫发育的情况下寻找到的新靶标,由
此非常有必要继续进行 SCP-2基因鉴定、SCP-2蛋白在鳞翅目昆虫中的分布和亚细胞定位、研究 SCP-2基
因在棉铃虫胆固醇转运中的功能及对其发育的影响以及该基因在昆虫中存在的普遍性,从分子水平阐明
SCP-2作用的机制等,同时要以 SCP-2蛋白作为分子靶标,筛选该蛋白的抑制剂,为开发新的杀虫剂防治
棉铃虫提供理论依据。
参考 文献
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