全 文 ：生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN·研究报告· 2008年第 6期
收稿日期：2008-05-09
基金项目：北京自然科学基金（6053024），北京市教委基金（KM200510082008）
作者简介：刘思敏（1982-），女，硕士，研究方向：微生物分类
通讯作者：韩素贞，Tel：68902964，E-mail：hansuzhen99@vip.sina.com
根瘤菌能与豆科植物共生建立固氮系统，并且具有使豆科植物结瘤的特性，该特性也是根瘤菌鉴定的
最关键特征。 虽然有些细菌与根瘤菌有高度的 DNA 相似性，但因为没有结瘤特性而不被承认是根瘤菌 [1]。
根瘤菌中与根瘤或茎瘤形成相关的基因称为结瘤基因，结瘤基因可分为 2 类：（1）共同结瘤基因（common
nodulation genes)存在于所有的根瘤菌中，如 nodABC；（2）宿主专一性结瘤基因（host specific nodulation genes)
只存在于某些根瘤菌种内，如 nol 和 noe。 共同结瘤基因定位于根瘤菌的共生质粒或染色体上，nodA、nodB
和 nodC 在大多数根瘤菌中总是存在于同一个操纵子中，通常 nodA 是该操纵子中的第一个基因 ，在 nodA
下游紧接着是 nodB，但也有例外 [2]。 nod 基因产物是诱导根瘤形成的一个关键信号分子——结瘤因子，能够
使根毛弯曲、侵入线形成和根皮层的细胞分裂。 其中，nodA 编码结瘤因子的酰基转移酶，该酶催化酰基链
向结瘤因子的寡糖骨架转移，直接参与结瘤因子的合成。 因此 nodA 是根瘤菌关键的结瘤基因之一 [3]。
Agrobacterium 和 Rhizobium 处于不同的系统发育亚分支，但是在彼此的亚分支内，它们的种混在一起 [4]。
分离自杭子梢等宿主根瘤的 30株菌的结瘤特性的研究
刘思敏 韩素贞
（首都师范大学生命科学学院，北京 100048）
摘 要： 对分离自杭子梢、菜豆和决明等宿主根瘤、处于 Agrobacterium系统发育分支、DNA-DNA杂交与A.rubi
的相似性达到100%的30株土壤杆菌，分属于Agrobacterium、Bradyrhizobium、Mesorhizobium、Rhizobium和 Sinorhizobium
5个属的12个参比菌株。nodA PCR的结果表明，30株供试菌中扩增不出nodA，即没有结瘤性。以 Sinorhizobium meliloti
USDA1002T的nodA做探针对所提取的细菌总DNA进行斑点杂交，在65℃~68℃严谨洗膜条件下，该探针只能与同种的
根瘤菌进行杂交，不能与其它属的根瘤菌或土壤杆菌杂交，初步推测共同结瘤基因 nodA探针只能对种内根瘤菌的结瘤
性进行鉴定。
关键词： 杭子梢 nodA扩增 斑点杂交
The Study on Nodulation of 30 Strains Isolated from Root
Nodules of Campylotropis spp.
Liu Simin Han Suzhen
（Life Science College，Capital Normal University，Beijing 100048）
Abstract： 30 strains iaolated fromC mpylotropis spp.，Phaselous vulgaris andCassia spp.were examed nodulation
with 12 reference strains belonging toAgrobacterium，Bradyrhizobium，Mesorhizobium，Rhizobium andSinorhizobium by
PCR and Dot blots.These isolated strains were involved inAgrobacterium phylogenetic branch a d at the similarity of
100% withAgrobacterium rubi in DNA-DNA hybridization.The results ofnodA PCR showed that there were no genes
of nodA exiting in those 30 strains.Dot blots were done with the probe made of the genenodA f omSinorhizobium
meliloti USDA1002T to hybridize to total DNA of all strains.The probe only reacted with the samerhizobium speieces，
but not with the otherrhizobium ragrobacterium under 65℃~ 8℃ of strict washing membrane.It was concluded that
the probe of common nodulation genenodA was only us d to identify rhizobia in the speices.
Key words： Campylotropis sppnodA PCR Dot blots
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2008年第 6期
De Lajudie 等 [5]曾从热带豆科植物中分离到 Agrobacterium 菌株。 谭志远等 [6]研究了从水生豆科植物 Aeschyn
omene fluminensis 和 Sesbania aculeata 分离出来的对水稻生长有促进作用根瘤菌 。 用 IGS 指纹分析和 16S
rRNA 基因序列分析表明，菌株 IRBG74 与 Agribacterium tumefaciens 的相似性达到 98.9%。 Mhamdi 等 [7]研究
了从突尼斯菜豆（Phaseolus Vulgaris）中分离到的根瘤菌，其中有 16%属于 Agrobacterium，从它们的 DNA 中
扩增不出 nifH 和 nodC 基因片段，共生基因探针实验得不到杂交信号，结瘤实验表明它们不能和菜豆结瘤
固氮。 Mhamdi 等认为能从菜豆中分离到 Agrobacterium 的原因有 2 个：一是它们与根瘤菌混合入侵豆科植
物根毛，二是它们获得了共生质粒，但这个质粒很不稳定，在分离和保藏菌种过程中丢失。
菜豆（Phaselous vulgaris），又称“四季豆”，既有食用价值又有药用价值；杭子梢（Campylotropis spp.）可作
水土保持的重要树种，还可作药用；决明（Cassia spp.）的种子称“决明子”，有清肝明目作用。 先前的研究表
明 [8]，它们的根瘤菌表现出极大的表型多样性、遗传多样性和系统发育多样性。 本研究选取结瘤基因 nodA
为探针，对处于 Agrobacterium 系统发育分支且与 A.rubi 的相似性达到 100%的分离自菜豆、杭子梢和决明
根瘤的 30 株菌 [8]进行总 DNA 斑点杂交，以确定它们的结瘤特性。
1 材料与方法
1.1 菌种
本实验共选用 42 株菌， 其中参比菌株 12 株， 分属于 Agrobacterium、Bradyrhizobium、 Mesorhizobium 、
Rhizobium 和 Sinorhizobium5 个属； 供试菌 30 株， 来源于云南、 湖北 、 陕西和甘肃省 ， 宿主植物为菜豆
（Phaseolus vulgaris) 、决明（Cassia sp.) 和杭子梢（Campylotropis sp.）（表 1）。
1.2 主要试剂
TaqDNA 聚合酶购于华美公司； 凝胶回收试剂盒购于 Takara 公司；DIG DNA Labeling and Detection Kit
购于 Roche 公司。
1.3 DNA 的提取
DNA 提取方法参见文献[9]。
1.4 nodA 基因的扩增
正向引物：5-TGCRGTGGAATNTRNNCTGGGAAA-3，反向引物：5GGNCCGTCRTCRAAWGTCATGTA-3[10]。
引物交由上海生工生物技术公司合成。 反应体系中含 TaqDNA 聚合酶 （3U/μl）0.5μl、10×PCR Buffer 5μl、
MgCl2（25mM)3μl、dNTPs 2μl、引物 （10pM）2μl、模板 DNA2μl，用 ddH2O 补足至 50μl。 PCR 扩增 nodA 条件
为：94℃预变性 5min，94℃变性 30s，60℃退火 45s，72℃延伸 60s，循环 34 次，72℃最后延伸 5min。 PCR 产物
用 1% 琼脂糖凝胶电泳检测鉴定，并于-20℃保存。
1.5 探针的制备
选用 Sinorhizobium meliloti USDA1002T扩增 nodA 片段 （方法同 1.4），PCR 产物采用凝胶回收试剂盒回
收并纯化，并送交上海生工生物技术公司测序。然后按照 DIG DNA Labeling and Detection Kit 产品使用说明
进行标记，标记好的探针置-20℃备用。
1.6 斑点杂交
将所提取的参比菌 、供试菌 DNA 各取 1μl，点在尼龙膜上 ，自然晾干后 ，按照 DIG DNA Labeling and
Detection Kit 产品说明进行斑点杂交。 杂交温度 55℃~60℃，洗膜温度 60℃~68℃。 以 Sinorhizobium meliloti
USDA 1002T作为正对照，以 A. tumefaciens IAM13129T和 Agrobacterium rubi IAM13569T作为负对照。
2 结果
2.1 PCR 扩增 nod A
采用引物对 nodA1 、nodA2（nodA1 和 nodA2 分别位于 nodA 和 nodB 基因序列内）进行 nodA PCR 扩增，
可产生约 660 bp 片段 （图 1A)。 可以看出 Mesorhizobium 、Rhizobium 和 Sinorhizobium 标准菌株均能扩增出
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2008年第 6期
表 1 菌株一览表
T: Type strains；CCBAU: Culture Collection of Beijing Agricultural University ；USDA: The United States
Department of Agriculture；IAM: Institution of Applied Microbiology ,The University of Tokyo ；CIAT:
CIAT Rhizobium Collection of Colombia

   
1 CCBAU 43159 Campylotropis delavayi
2 CCBAU 65052 Campylotropis delavayi 
3 CCBAU 65053 Campylotropis delavayi 
4 CCBAU 65054 Campylotropis delavayi 
5 CCBAU 65108 Campylotropis delavayi 
6 CCBAU 65161 Campylotropis delavayi 
7 CCBAU 65162 Campylotropis delavayi 
8 CCBAU 65163 Campylotropis delavayi 
9 CCBAU 65164 Campylotropis delavayi 
10 CCBAU 65192 Campylotropis delavayi 
11 CCBAU 65193 Campylotropis delavayi 
12 CCBAU 65194 Campylotropis delavayi 
14 CCBAU 65237 Campylotropis delavayi 
15 CCBAU 65238 Campylotropis delavayi 
16 CCBAU 65155 Campylotropis prainii 
17 CCBAU 65156 Campylotropis prainii 
18 CCBAU 65157 Campylotropis prainii 
19 CCBAU 65158 Campylotropis prainii 
20 CCBAU 65201 Campylotropis delavayi 
21 CCBAU 65202 Campylotropis delavayi 
26 CCBAU 81433 Phaseolus vulgaris 
31 CCBAU 71181 Phaseolus vulgaris 
32 CCBAU 71197 Phaseolus vulgaris 
33 CCBAU 73083 Phaseolus vulgaris 
43 CCBAU 65266 Phaseolus vulgaris 
44 CCBAU 65265 Phaseolus vulgaris 
54 CCBAU 65034 Cassia leschenaultiana 
55 CCBAU 65035 Cassia leschenaultiana 
56 CCBAU 65036 Cassia leschenaultiana 
57 CCBAU 65037 Cassia leschenaultiana 
C1 Agrobacterium tumefaciens IAM 13129

C2 Agrobacterium rubi IAM13569 

C3
C4
Bradyrhizobium japonicum
USDA 6

USDA 76
Glycine max 
C7 Mesorhizobium huakuii CCBAU 2609 Astragalus sinicus 
C11 Mesorhizobium ciceri USDA 3378 Cicer aret inum 
C12 Rhizobium etli CFN42 Phaseolus vulgaris 
C13 Rhizobium leguminosarum USDA 2370
Pisum sativum 
C15 Rhizobium tropici CIAT899 Phaseolus vulgaris 

C17
Sinorhizobium meliloti
USDA 1002
Medi cago sati va


C18 102F28
C19 Sinorhizobium fredii USDA205 Glycine soja 

刘思敏等：分离自杭子梢等宿主根瘤的 30株菌的结瘤特性的研究 103
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2008年第 6期
nod A，Bradyrhizobium 和 Agrobacterium 标准菌
株，没有扩增出 nod A。 30 株供试菌均无目的
条带出现（图 1B）。
2.2 斑点杂交结果
以 S.meliloti USDA 1002T 的 nodA 为探针 ，
对所有参比菌及供试菌进行了斑点杂交 。 在
60℃杂交，65℃~68℃严谨洗膜的条件下，结果只
有 C17 （S.meliloti USDA1002T）、C18 （S.meliloti
102F28）出现阳性斑点。55℃杂交，65℃~68℃严
谨洗膜时，C17、C18 出现明显阳性斑点，C7（M.
huakuii CCBAU 2609T）、C11 （M.ciceri USDA
3378T）、C12 （R.etli CFN42T）、
C13（Rhizobium leguminosar
um、 C15（Rhizobium tropic iCI
AT899T ）和 C19（Sinorhizobium
fredii USDA205T）出现隐约斑
点， 即使在高背景情况下也
只有很淡的印迹， 各供试菌
株无阳性斑点（图 2）。
55℃杂交，降低洗膜温度至 60℃，各标准菌株与一些供试菌株均出现阳性斑点。 但作为负对照的土壤
杆菌标准菌株 C1（A.tumefaciens IAM13129T）和 C2（Agrobacterium rubi IAM13569T）也呈现阳性反应 ，结果不
可靠，可能为假阳性。
3 讨论
nodA 是根瘤菌关键的结瘤基因之一， 所以通过检测 nodA 的有无可以从基因水平上判断供试菌株是
否具有结瘤特性。 nodABC 总是存在于同一个操纵子中，除 M.loti、M.huakuii 和 R.etli 之外，大多数根瘤菌种
用引物对 nodA1、nodA2 都扩增出了 nodA 基因。
在本研究中 ，Mesorhizobium、Rhizobium 和 Sinorhizobium 标准菌株均能扩增出 nodA，Bradyrhizobium 和
Agrobacterium 标准菌株没有扩增出 nodA。 Bradyrhizobium 和其他属根瘤菌属于不同的系统发育分支 ，其
nodA 的扩增可能需要设计不同的引物。 Agrobacterium 虽与 Sinorhizobium 和 Rhizobium 同属一个发育分支，
但却不是根瘤菌，没有结瘤特性，所以扩增不出 nodA。
分离自杭子梢等宿主根瘤的 30 株供试菌， 用引物对 nodA1 、nodA2 没有扩增出结瘤基因 nodA。 以 S.
meliloti USDA 1002T的 nodA 作探针对它们进行斑点杂交，在 65℃~68℃严谨洗膜条件下，也无阳性斑点出现。
本研究结果表明，30 株分离杭子梢、菜豆和决明的供试菌不含有结瘤基因，属于 A.rubi [8]。 对于土壤杆
菌是如何进入根瘤的问题除了 Mhamdi[7]的观点外，有报道 [11]指出从野生豆科植物根瘤中分离的菌株，有相
当一部分是根瘤内生菌，如 Pseudomonas、 Bacillus、 Xanthomonas、 Staphylococcus、Agrobacterium 等属的细菌。
这些内生菌有可能产生某些抗性物质影响根瘤菌在根瘤内的生长，也有可能启动宿主的防御机制，导致如
水杨酸一类的物质产生，使宿主对根瘤菌有不同的敏感性。高俊莲 [3]对采自我国北方地区的 16 株斜茎黄芪
根瘤菌代表菌株的共同结瘤基因 nodA 进行了 PCR 扩增，结果表明来自 Mesorhizobium 和 Rhizobium 系统发
育分支的代表菌株都得到了 nodA PCR 扩增产物； 而来自 Agrobacterium 系统发育分支的代表菌株都没有
得到 nodA PCR 扩增产物。
图 1 各菌株 PCR 扩增 nodA 电泳图
A：（从左至右 ）Marker、S. meliloti USDA 1002T、S.fredii USDA205T、R.trop-
ici CIAT899T、R.leguminosarum USDA 2370、R.etli CFN42T、M.ciceri USDA
3378T、M.huakuii CCBAU 2609T、B.japonicum USDA 6T 和 USDA 76T、A.ru-
bi IAM13569T 和 A.tumefaciens IAM13129T、 Marker；
B：部分供试菌 nodA 扩增结果 ，除了 S. meliloti USDA 1002T 作为对照有
带之外，其余供试菌都没有扩增出 nodA
图 2 各菌株斑点杂交结果
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共同结瘤基因如 nodABC 是根瘤菌中最为保守的基因，试验试图通过 nodA 在根瘤菌间的高度同源性
鉴定分离自杭子梢、 菜豆和决明根瘤、 处于 Agrobacterium 分支的菌株的结瘤性。 但在以 S.meliloti USDA
1002T 的 nodA 作探针进行斑点杂交试验时 ， 在严谨洗膜条件下该探针只能与 S.meliloti USDA1002T、S.
meliloti 102F28（图 1）杂交，与其它种属根瘤菌及土壤杆菌均无阳性印记，或印记极淡。 根据此结果初步推
断，在一定的实验条件下，nodA 探针能很好地区分种内菌株与其他种属根瘤菌及土壤杆菌，即只能在种内
而不能在种间鉴定菌株的结瘤性，这与覃筱婷的报告结果一致 [12]。
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