全 文 ：·研究报告·
生物技术通报
B IO TECHNOLOGY　BULL ETIN 2009年第 12期
一株产木质素降解酶真菌的分离与鉴定
武善军 荚荣 甘露
(安徽大学生命科学学院 安徽省生态工程与生物技术重点实验室 ,合肥 230039)
　　摘 　要 : 　从自然界中分离到一株产木质素降解酶真菌。平板显色反应显示 ,该菌株具有产多种木质素降解酶的能力 ,
并通过酶活力测定得到证实。为确定该菌株的分类地位 ,对其 ITS序列进行了扩增并测序 ,并利用 MEGA4. 0生物学软件计算
其与同属其它菌株的遗传距离并构建系统发育树 ,在分子水平上确定它们之间的亲缘关系。试验结果表明 ,该菌株的 ITS序
列与 Irpex lacteus乳白耙菌序列相似度达 99% ,且与 Irpex lacteus XSD22亲缘关系最近。
关键词 : 　平板显色 　 ITS序列 　系统发育树 　乳白耙菌
收稿日期 : 2009209203
作者简介 :武善军 (19822) ,男 ,硕士研究生 ,研究方向 :环境微生物 ; E2mail: wushan2002@gmail1com
通讯作者 :荚荣 ,硕士生导师 ,教授 ; E2mail: jiarong@ah1631com
Isolation and Identif ication a Fungus Enable to Secret
L ign in2degrading Enzymes
W u Shanjun　J ia Rong　Gan Lu
( School of L ife Science, Anhui University, Anhui Key Laboratory of Eco2engineering and B iotechnology, Hefei 230039)
　　Abs trac t: 　A lignin2degrading fungus was isolated in the natural by us1 The strain p roduced a wide variety of lignin2degrading en2
zymes through the p late2color reaction1 we also assayed its lignin2degrading enzymes in liquid culture1 To determ ine the taxonom ic sta2
tus of this strain, its ITS sequence was amp lified through PCR reaction1 The genetic distance of severa strains of the same genus was
calculated and a phylogenetic tree was constructed based on ITS sequence by software MEGA ( version 410) 1The results demonstrated
that the ITS sequence of this strain had a sim ilarity as high as 99% compared to Irpex lacteus and its closest strain in genetic was Irpex
lacteus XSD22
　　Abs trac t: 　Plate2color reaction ITS sequence　Phylogenetic tree　Irpex lacteus
　　农作物秸秆作为一种可再生资源 ,在造纸、能
源、饲料等方面有重要的用途 ,我国的农作物秸秆具
有分布广、数量大、种类多、价格低廉的特点 [ 1 ] ,秸
秆主要由纤维素、半纤维素和木质素三组分相互镶
嵌、彼此间隔组成的立体网状结构 ,该结构复杂、稳
定 ,严重阻碍了秸秆的降解和利用。采用生物法降
解秸秆类木质纤维素具有处理成本低、条件温和、对
环境无污染等优点 [ 2 ]。自然界中的白腐真菌是秸
秆等木质纤维素降解的一类重要微生物 ,可合成与
分泌包括木质素过氧化物酶 (L iP)、锰过氧化物酶
(MnP)和漆酶 (Lac)等木质素降解酶 [ 3, 4 ]。
国内外对白腐真菌的研究已有 20多年的历程 ,
研究报道集中于平革菌、栓菌等几个菌属 [ 3, 4 ]。近
年来 ,新菌株的研究报道也日渐增多 [ 5, 6 ]。本试验
期望通过木质素降解酶平板显色反应以及降解酶活
力测定等方法 ,从自然界筛选出更有价值的降解酶
产生真菌 ,并对所分离的真菌确定其分类地位 ,其意
义在于发掘具有本国优势的土著菌株 ,充分利用本
国的生物资源。
1　材料与方法
1. 1 菌种的筛选
1. 1. 1　菌种 　在合肥市大蜀山的树林中 ,分别从
生长的树枝和被砍伐的树墩上采集子实体及长有白
色菌丝的腐败树皮作为分离样品。
1. 1. 2　培养基 　PDA培养基 ( g /L ) :去皮马铃薯
200,葡萄糖 20, KH2 PO4 3,MgSO4 ·7 H2 O 115, VB1
4～10 mg,琼脂 18, pH自然。
分离培养基 :在 PDA培养基中添加 250 mg/L的
2009年第 12期 武善军等 :一株产木质素降解酶真菌的分离与鉴定
氯霉素。
初筛培养基 :在 PDA培养基中添加 0101%的愈
创木酚。
液体发酵培养基 ( g /L ) :葡萄糖 10, 酒石酸铵
012, KH2 PO4 210, MgSO4 ·7H2 O 015, CaCl2 0101,
VB1 110 mg,微量元素溶液 70 m l, 011 mol/ L 醋酸 2
醋酸铵缓冲液 (pH 415) 100 m l。
微量元素溶液 ( g /L ) : MgSO4 ·7H2 O 310, Mn2
SO4 ·H2 O 015, NaCl 110, FeSO4 ·7H2O 011 g, Zn2
SO4 ·7H2O 011, CuSO4 ·5H2 O 011, CoCl2 ·6H2 O
0118, A lK ( SO4 ) 2 ·12H2 O 0101, H3 BO3 0101, Na2
MoO4 ·2H2 O 0101, NTA 115。
1. 1. 3　菌种的分离 将采集的腐败树皮用自来水
清洗干净后切成 2 mm ×2 mm的小块 ,将小块先用
011%的 HgCl2表面灭菌 30 s后在无菌水中漂洗 3～
4次 ,然后转到 75%乙醇中灭菌 30 s,并用无菌水反
复振荡清洗 ,最后用灭菌滤纸擦干。以上过程均在
无菌条件下进行 [ 6, 7 ]。待灭菌过的分离培养基倒平
板并完全凝固后 ,每培养皿接种上述树皮小块 1块
并置于 28℃恒温培养箱中培养 2～3 d。从长有菌
丝的平板边缘小心挑出白色菌丝接种到新的分离培
养基 ,反复接种数代直至获得纯菌株。分离所得到
的纯菌株 4℃保存于 PDA试管斜面上。
1. 1. 4　平板显色反应 从 4℃保存的斜面菌种挑
取少量菌丝接种到 PDA培养基上 , 28℃培养 5 d以
活化菌株。将活化的菌株接种到初筛培养基平板
上 , 28℃培养 4 d。若分离得到的菌株产木质素降解
酶 ,则会在含愈创木酚的 PDA平板上因愈创木酚的
氧化而显示出红色 ,红色颜色越深 ,范围越大表明菌
株产木质素降解酶的能力越强。根据 Luci等 [ 8 ]学
者的方法 ,对培养 4 d后的菌落进行滴定试验 ,检查
其产木质素降解酶的能力。即在菌落边缘用打孔器
打直径 5 mm孔 ,分别滴入数滴 011 mol/L用 96%
乙醇配制的α2萘酚 ,现配的等量 4% H2 O2与 1%焦
酚混合液。
1. 1. 5 　粗酶液的发酵 250 m l三角瓶中装入 100
m l发酵培养基 , 121℃灭菌 20 m in,冷却后接入活化
的 5 d菌龄直径 5 mm、厚 2 mm的菌塞 5个 ,做 3个
重复 , 120 r/m in, 28℃恒温摇床培养。从第 3天起
每天取培养液 , 10 000 r/m in离心 10 m in,上清液即
为粗酶液。
1. 1. 6 酶活力分析 　木质素过氧化物酶 L iP测
定 [ 9 ] : 4 m l体系中 , 250 mmol/L 酒石酸缓冲液
(pH310) 215 m l, 10 mmol/L黎芦醇 110 m l,粗酶液
014 m l,在 30℃下 ,往此反应液中加入 10 mmol/L H2
O2 011 m l启动酶促反应 ,在 310 nm处测定光密度
变化值。一个酶活力单位 (U )定义为 1 m in内氧化
1μmol/L黎芦醇所需的酶量。
锰过氧化物酶 MnP测定 [ 10 ] : 50 mmol/L丙二酸
缓冲液 (pH415) , 1 mmol/L MnSO4 , 011 mmol/L H2
O2 ,在 240 nm处测定光密度值。定义一个酶活力单
位 (U)为每分钟氧化 1μmolMn2 +成为 Mn3 +所需的
酶量。
漆酶 Lac测定 [ 11 ] : 200 mmol/L 柠檬酸缓冲液
(pH315) 3175 m l, 10 mmol/L DMP ( 2 , 62二甲氧基
酚 ) 0115 m l,粗酶液 011 m l,反应温度为 30℃,在
470 nm 处测定光密度值。定义一个酶活力单位
(U)为每分钟氧化 1μmol的 DMP成为 3, 5, 3′, 5′2
四甲氧基二苯醌所需要的酶量。
1. 2　菌种的鉴定
1. 2. 1　DNA的提取 参考周小玲方法 [ 12 ]并作了
修改。
1. 2. 2　 ITS区域的特异性 PCR 扩增 　引物序列
ITS21: 5′2TCC GTA GGT GAA CCT GCG G23′, ITS24:
5′2TCC TCC GCT TAT TGA TAT GC23′,由上海生工
生物公司合成。
PCR扩增反应体系 ( 50μl) : 10 ×PCR buffer 5
μl, 25 mmol/L M gCl2 4μl, 10 mmol/L dNTP 4μl, 20
μmol/L引物 ( ITS21和 ITS24)各 1μl, Taq DNA聚
合酶 015μl, DNA 模板 1μl,加 ddH2 O 至 50μl。
扩增程序 : 94℃预变性 3 m in, 94℃变性 1 m in,
57℃退火 1 m in, 72℃延伸 1 m in,经 30个循环后 ,
72℃后延伸 10 m in。
PCR产物的检测 :取 5μl PCR产物 , 1%的琼脂
糖凝胶电泳检测。片段的纯化与测序 由上海生工
生物公司完成。
1. 2. 3　系统发育树的构建 用 ClustalX1183对所
得 ITS序列与 GenBank中已公布的同属多株代表菌
株进行比对 ,比对结果用 MEGA410进行分析 ,使用
Kimura two2parameter ( K2P)模型构建序列距离矩
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生物技术通报 B iotechnology　B u lle tin 2009年第 12期
阵 ,用邻接法 (Neighbor2Joining Method)进行聚类分
析 ,对于由序列长度多态性所造成的空位 ( gap ) ,在
运算中处理为缺失 (m issing)状态 ,选取 Hydnum
repandum ( AJ783968 ) 做系统发育树的外群 ( out
group) ,并进行重复 1 000次的自举检验。
2　结果与分析
2. 1 菌株分离与纯化
通过连续在分离培养基上培养 ,从子实体和腐
败树皮上分离得到 12株菌株 ,并经过多次纯化 ,获
得纯培养。
2. 2 　平板显色
将分离所得的纯菌株接种到含愈创木酚的平板
后 ,从中选取了显色圈颜色深 ,范围大的菌株 W 1
(图 1)。为进一步确定何种木质素降解酶以使愈创
木酚显色 ,进行了滴定试验 :在滴加α2萘酚 30 m in
后 ,孔 1周围形成了较弱的紫色显色圈 ,说明该菌株
能够产生漆酶 (Lac) ;在滴加有焦酚的 2、3孔可看
到明显的黄褐色显色圈 ,指示该菌株有较强的产过
氧化物酶 (L iP、MnP)活力 (图 2)。根据显色结果 ,
菌株 W 1不仅产 L iP和 (或 ) MnP,同时也产 Lac,有
着较复杂的产酶体系。
2. 3 液体发酵
采用液体发酵培养基 ,测定 L iP、MnP和 Lac 3
种酶的酶活力 ,结果如图 3。L iP在第 6天达到最大
酶活 (4616 U /L) ,而 MnP和 Lac的峰值出现在第 7
天 ,分别为 9419 U /L和 2213 U /L。菌株 W 1产 Lac
能力较弱 ,最大值仅为 2213 U /L ,这与平板显色的
结果相吻合 ,MnP在发酵周期内变化明显 ,从第 3天
的 15 U /L增至第 7天的 9419 U /L。
图 3　酶活力随时间变化
2. 4　rDNA2ITS的序列扩增
为确定 W 1菌株的分类地位 ,选择了真菌物种
常用的分子鉴定方法 — ITS序列鉴定。由图 4可见 ,
引物 ITS21 / ITS24成功扩增出了惟一的一条条带 ,表
明所用的引物适用于 W 1菌株的核糖体基因转录间
隔区 ,该段序列长度为 600～700 bp。经对 ITS序列
进行测序 ,W 1 rDNA2ITS序列长度为 647 bp,其中 T
为 3018% , C为 2118% , A为 2413% , G为 2312% ,
G + C为 4510%。
图 4　 ITS序列扩增电泳图谱
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2009年第 12期 武善军等 :一株产木质素降解酶真菌的分离与鉴定
2. 5　 ITS序列片段分析
所得 rDNA2ITS序列通过与数据库进行 B lastn
检索比对 ,发现与 Irpex lacteus T60 ( FJ462768)、I 1
lacteus XSD22 ( EU273517)等多株 Irpex lacteus乳白
耙菌同源性达 99%。据序列相似性 ≥99% ,可以鉴
别为相同种 ;序列相似性为 95% ～99 % ,可以鉴别
为相同属 [ 13, 14 ] ,因此可确定 W 1为 Irpex lacteus乳白
耙菌的一株 ,暂定名为 Irpex lacteus W 1。
为确定 W 1 与同属其它种的亲缘关系 ,选择
GenBank中 Irpex属已公布的代表性的 8株菌 DNA
序列 ,去除 W 1测序序列两端由于荧光染料干扰所造
成的误差部分 ,由 Clustal X1183匹配排列后 ,通过 MEGA410进行分析 ,以 Hydnum repandum (AJ783968)为树根 ,通过邻接法 (Neighbor2joiningMethod)构建系统发育树 [ 15～17 ] (图 5,只显示 bootstrap 值 > 50% )。基于 Kimura two2parameter的遗传距离计算结果表明(表 1 ) : 种 间 遗 传 距 离 W1 与 Irpex sp. HZ213( EU301643)、I1 lacteus XSD22 ( EU273517)和 I1 lacte2us T60 ( FJ462768)的遗传距离最近 ,仅为 01002,与 Ir2pex sp1F20081106K的遗传距离最远 ,也仅为 01023。而由系统树 (图 5)可知 ,W1与其它 I1 lacteus以 95%的置信度同属一类群 ,该类群又分为 2枝 , I1 lacteusdd08106 ( FJ810187)单独为 1枝 ,在另一支中 W1与I1 lacteus XSD22 (EU273517) 关系最近。
表 1　供试菌株的遗传距离矩阵
1 2 3 4 5 6 7 8 9
1
2 01002
3 01013 01015
4 01013 01015 01000
5 01021 01023 01019 01019
6 01019 01021 01017 01017 01002
7 01019 01021 01017 01017 01002 01000
8 01019 01021 01017 01017 01002 01000 01000
9 01021 01023 01019 01019 01004 01002 01002 01002
10 01412 01408 01408 01408 01411 01415 01415 01415 01419
　　1. Irpex sp1SUN m299326216 ( FJ750850) ; 2. Irpex sp1F20081106K ( FJ750851) ; 3. I1 hydnoides SFC 971011212 (AF479668) ;
4. I1 hydnoides SFC 97125219 (AF479667) ; 5. I1 lacteus dd08106 ( FJ810187) ; 6. Irpex sp1HZ213 ( EU301643) ; 7. I1 lacteus
XSD22 ( EU273517) ; 8. I1 lacteus T60 ( FJ462768) ; 9. I1 lacteus W1 10: Hydnum repandum (AJ783968)
图 5　rD NA2ITS序列系统发育树 (未显示 bootstrap值 ≤50%)
3　讨论
N ishida等 [ 18 ]认为 ,能在愈创木酚为指示剂的
愈创木酚培养基上产生变色圈的微生物具有降解木
质素的能力。本试验使用的平板显色反应正是利用
愈创木酚作为定性检测木质素降解酶的重要指示
剂 ,结果明显且方法简单 ,可作为很好的初筛木质素
降解酶真菌的方法。酶活性测定表明 ,菌株 W 1所
分泌的主要酶为 MnP和 L iP,且产酶高峰期分布在
571
生物技术通报 B iotechnology　B u lle tin 2009年第 12期
5～8 d。但酶活力较低 ,因此 ,该菌株产酶条件的优
化有待深入研究。
基于真菌核糖体转录间隔区 ( rDNA2ITS)多态
性的序列分析 ,可以从不太长的核酸序列中获得相
对足够的信息用来反映生物亲缘关系与分类情况 ,
具有特异性高、操作简便和准确性高的特点 ,因而成
为真菌分类及鉴定研究的热点 [ 19 ]。本试验利用 ITS
序列分析方法 ,发现 W 1 菌株的 ITS序列与 Irpex
lacteus乳白耙菌序列相似度达 99% ,从而将 W 1归
为 Irpex lacteus的一种。由构建的系统发育树可知 ,
W 1与 I1 lacteusXSD22亲缘关系最近。
参 考 文 献
1　 黄茜 ,黄凤洪 ,江木兰 ,万楚筠 ,刘睿 1 中国生物工程杂志 ,
2008, 28 (2) : 66～701
2　宋安东 ,张百良 ,吴坤 ,黄保 1过程工程学报 , 2005, 5 (4) : 414～4181
3 　 Christopher HV1 International B iodeterioration & B iodegrad2ation,
2003, 51: 67～75.
4　 Lekounougou S, Mounguengui S, DumarcayS, et al1 International
B iodeterioration & B iodegradation, 2008, 61: 287～2931
5　 Mario CNS, Paulina M, Constanza SL, et al1 ProcessB iochem istry,
2008, 43: 368～3751
6　 Revankar MS, Lele SS1 Process B iochem istry, 2006, 41: 581
～588.
7　徐晓峰 ,何北海 ,徐丽丽 ,石海强 ,林鹿 1 华南理工大学学报 ,
2007, 35 (4) : 105～1111
8　 Luci KO, Kátia MGM, Carla F, Vera LRB1World JournalofM icrobi2
ology & B iotechnology, 2000, 16: 889～8931
9　黄丹莲 ,曾光明 ,黄国和 ,胡天觉 1 环境科学学报 , 2005, 25
(2) : 232～2371
10　Muhammad A, Shaheerah B, et al1 International B iodeterioration &
B iodegradation, 2008, 62: 465～4701
11　康从宝 ,刘巧 ,李清心 ,曲音波 ,高培基 1中国生物化学与分子生
物学报 , 2002, 18 (5) : 638～6421
12　周小玲 ,沈微 ,饶志明 ,王正祥 ,诸葛健 1微生物学通报 , 2004,
31 (4) : 89～921
13　杨金水 ,刘葳 ,倪晋仁 1环境科学 , 2006, 27 (5) : 981～9851
14　候军 ,林晓民 ,江芸 ,等 1食品科学 , 2009, 30 (5) : 141～1441
15　李晶 ,柯崇榕 ,杨欣伟 ,等 1福建师范大学学报 , 2008, 24 ( 3 ) :
77～821
16　李敏 ,隋正红 ,易恒 ,张学成 ,阎炳伦 ,朱明 1中国海洋大学学报 ,
2009, 39 (1) : 77～831
17　李海波 ,吴学谦 ,魏海龙 ,等 1菌物研究 , 2007, 5 (1) : 14～19
18　N ishida T, Kashino Y, M imura A, et al1 Mokuzai Gakkaishi,
1988, 34: 530～5361
19　李河 ,郝艳 ,宋光桃 ,等 1 西南林学院学报 , 2009, 29 ( 2 ) :
40～431
·科学出版社新书 ·
中国至 2050年人口健康科技发展路线图 (中、英版 )
中国科学院人口健康领域战略研究组
中文版 97827203202465728　　  55100　　　　　2009年 6月出版
英文版 97827203202562021　　  88100　　　　　2009年 10月出版
人口健康直接影响到一个国家的经济发展和社会进步 ,并且是构建和谐社会的重要基础。我国人口健康领域一方面正在面临着重大的挑
战 ,另一方面科学技术的迅速发展为其提供了重要的机遇。中国科学院人口健康领域战略研究组通过对我国人口健康领域的科技发展趋势和
需求分析 ,提出了我国人口健康领域 2010～2050年的科技战略发展路线图 ;其科技愿景是 ,建立一个让中国人民生活得更健康的普惠健康保
障体系。这个科技战略发展路线图主要由八个部分组成 : ①生物医学创新体系 ; ②人口控制与生殖健康 ; ③营养、食品安全与健康 ; ④慢性病防
治与健康管理 ; ⑤传染病防治 ; ⑥认知神经科学与心理精神健康 ; ⑦创新药物与生物医学工程 ; ⑧再生医学。每个部分都包括了特定的发展目
标、战略任务和关键技术。
本报告可作为政府部门、科研机构、大学、企业进行科技战略决策的重要参考 ,可供国内外专家、学者研究和参考。
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