全 文 ：生物杖术通银
研究报告 刀爪口r E CJ 孙心乙 O G Y B U L L E TJ rN 2 (X 为 年增 刊
含抑制素重组质粒的减毒猪霍乱沙门氏菌
CSOO 遗传稳定性研究
甄艳红 韩丽 梁爱心 王庆玲 杨利国
(华中农业大学动物科技学院 ,武汉 43(X) 70 )
摘 要 : 为了分析研究含抑制素重组质拉pvA x 一is 一asd (以下简写为 px A Is )的c甲 (c AM P 受体蛋白)和 asd (天冬氛政 日-
半乳粉脱兔阵)基因双缺失猪霍乱沙门氏菌c 50 菌株的遗传德定性 方法:将现有的无杭性抑制素重组表达质拉px人15 特化
入 c甲和 as d 基因双缺失猪霍乱沙门氏菌 c so 菌株(简称 空质粒林 )中,得 含质粒株 将 含质拉株 细菌在无选择压力条
件下传代培养 50 代 ,利用璐切鉴定方法 ,分析 含质杜株细菌中抑制紊 px A Is 质杜的德定性 ;利用Pc R 方法扩增菌林(含质
粗株 和 空质杜株 保守序列中in vA 基因,分析各代细菌的 in vA 基因德定性;通过比较传代培养后各代细蔺的生长图型 ,分
析 含质杜株 细蔺传代后的生长规律结果表明 , 含质粗株 细菌连续传代 50 次后 ,仍能检出pX A Is 质粗和inv A 基因, 而且
生长规律与 空质粗株没有明显差异 说明含 px A Is 质粗的猪霍乱沙门氏菌crp 和 as d基因双缺失株具有良好的遗传德定性
关. 词: 减毒沙门氏菌 抑制紊 (IN H ) 基因重组 基因免疫
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K6 y wo ds: A tenu.ted sa] 比 onela ehole~ 山5 1刊巨bin (IN H ) Ge ne ~ um zaoon G ene reeomb ina tion
收稿 日期 :2(X 拍一02 一20
羞金项 目:国家 自然科学墓金(307 M g )和教育部博士点墓金 (2(X) 70引洲旧19 )
作者简介 :甄艳红(1984 一),女 ,硕士研究生 ,主要从事动物生殖生理与生物技术研究 ;E一口1:止朗y山山On 砰如eb mai l.卜翻 .ed u. cn
通讯作者 :杨利国 ,E 一ha 卜yan gl i脚 2仪以西山o .co m .cn
2 O( 为 年 增 刊 甄艳红等 :含抑制素重组质粒的减毒猪霍乱沙门氏菌 Cso 遗传稳定性研究 30 1
卵泡抑制素是调节垂体促卵泡素 (FSH )分泌
进而影响卵泡发育的重要生殖激素 应用抑制素免
疫小鼠 大鼠和牛, 产生的抑制素抗体可以中和体
内的抑制素 , 减少它对 FSH 的抑制作用 ,从而促进
卵泡发育 ,增加排卵率 ,提高胚胎质量1 抑制素疫
苗的研究经过了以下几个阶段 :首先从性腺 (卵巢
和精液 )组织 中提取抑制素12 ;其次是生化合成抑
制素片断 ;最后是基因重组 原核表达抑制素 13 ,但
存在技术上的障碍和工作量大 成本高 载体蛋白
连接复杂等问题 最新发展起来的抑制素基因疫苗
因其独特的优点成为近年来的研究热点14一刀,本实
验室 自 19 8 年开始 , 着手抑制素基因免疫的研究
工作 ,构建了多种抑制素 D NA 疫苗 ,其中将抑制素
与乙肝表面基因融合表达构建而成的 pC Is ls] 基因
疫苗 ,免疫大鼠后 ,抗体阳性鼠占 50% ,抗体阳性鼠
卵巢上的成熟卵泡数比阴性鼠多 2. 3 个 但常规的
抑制素基因疫苗因为抗性基因的存在 ,有可能导致
临床抗药菌株的传播 , 对家畜和人体健康带来威
胁 因此 ,构建非抗性筛选抑制素基因疫苗显得尤
为重要 将抑制素基因疫苗引人以 as d 为营养选择
标志基因的染色体一质粒平衡致死系统 , 可以在不
添加任何抗生素及外源物质的前提下培养含有目
的抗原的载体 ,从而避免了使用抗生素筛选带来的
潜在危害l9j
染色体一质粒平衡致死系统是以营养选择标志
基因代替抗性基因为特征的新型质粒载体系统l10] ,
主要用于基因疫苗的开发研制中 以营养标志基因
缺陷的减毒活菌苗为载体 ,将一种或几种外源保护
性抗原克隆至互补质粒中 ,构成的载体一宿主平衡
致死系统以一定方式接种后 ,通过粘附 侵袭 定居
在肠道相关淋巴组织继而到达肝脾 ,故能有效地刺
激机体产生粘膜 体液和细胞免疫应答1 ,可用于
制备口服疫苗 以减毒沙门氏菌为载体的口服基因
疫苗虽然非常实用 ,但同时也存在着载体中表达质
粒的不稳定 质粒丢失以及抗原的不稳定表达等问
题 , 以致可能严重影响疫苗的免疫效果圈 安全性
和稳定性是衡量和评价基因疫苗有无开发价值的
基本条件 质粒稳定性的高低 ,是实验室中的成果
能否转化为生产的关键问题l3一l6] 质粒不稳定现象
在生产实践中普遍存在 ,是导致其推广受限的重要
原因
因此 , 研究并鉴定所构建的抑制素染色体一质
粒平衡致死系统 , 即含抑制素基因重组质粒 pX -
AI S 缺失 c甲基因和 as d 基因的猪霍乱沙门氏菌
Cso 菌株的稳定性 ,不仅具有理论意义 ,还具有应
用价值 本试验在以前构建的抑制素质粒 pCIS 18]
基础上 ,去除抗性基因 ,插人 as d 基因 ,构建不含抗
性基因的质粒 px AI s , 并将其转化到 空质粒株
中 ,得到 px AI S 缺失 c甲 基因和 as d 基因的猪霍乱
沙门氏菌 Cso 菌株 (简称 含质粒株 ) ,然后进行
继代培养 通过分析原代和继代培养的 空质粒株
和 含质粒株 细菌的生长规律以及菌中 px AI S 质
粒和 inv A 基因稳定性 ,旨在探讨抑制素染色体一质
粒平衡致死系统的遗传稳定性 ,为构建安全 稳定
免疫效果好的新型抑制素基因疫苗 分析新型疫苗
的安全性 促进该疫苗的临床应用奠定基础
, 材料与方法
1.1 菌种和质拉
不含抗性基因的抑制素与乙肝表面抗原融合
表达重组质粒 px AI S 由本实验室构建 ,该质粒的
生物学活性已经通过 ELA IS 的方法鉴定 缺失 crp
和 as d 基 因的猪霍乱沙门氏菌 Cso 菌株l7!由华中
农业大学农业微生物国家重点实验室郭爱珍教授
惠赠
1 .2 工具酶及主要试剂
1.2.1 主要试剂 D N A M ar ker 和 Ec oR I 川nd 111
等内切酶购自天根公司 D AP (2, 6一二氨基庚二酸)
购 自Si gm a 公司 ;Ta q 酶 dN TP 等购 自上海生工公
司 ;其他的一些溶液均由一些生化试剂配制
1.3 方 法
1.3.1 含质粒株 菌制备 取纯化好的质粒 pX -
AI S ,用电转化法 18将其转人 空质粒株 细菌中 ,筛
选阳性克隆 ,经酶切及测序鉴定正确后得抑制素重
组质粒 px AI S 的 Crp 和 as d 基因双缺失猪霍乱沙门
氏菌 C so 菌株 ,即 含质粒株 菌 ,一70 保存 取保
存于一70 的 含质粒株 和 空质粒株 细菌 ,分别
培养于不含和含有 DA P (50 林g/m l) 的 LB 固体平板
上 , 37 划线培养 12 h 挑取在线上的单个菌落 ,
置于 ro 耐 无抗性的 比 液体培养基中 , 37 振
302 生物杖术通根 B勿te chnol侧沙 2风为 年 增 刊
荡(250 :/m in )培养 14 h
1.3. 2 细菌传代培养 取 含质粒株 细菌 ,按 1
份细菌 1 0[X) 份无抗性 LB 液体培养基的比例于
37 振荡培养 , 12 h 后再次按 l:1 0( 旧的比例转接
到无抗性 LB 液体培养基中 , 连续进行 50 次转接
空质粒株 细菌培养需在培养液中加人 D A P (50
林g/m l) ,稀释比例与转接方法及次数与 含质粒株
相同
1.3. 3 目的基因质粒鉴定 分别取原代和继代培
养 2 5 ro 20 40 50 代的 含质粒株 和 空质粒
株 细菌 lml ,用碱裂解法10 提取质粒 ,用 Ec oR I 和
月示d 川 内切酶进行酶切 , 然后进行电泳鉴定目的
基因质 粒 px AI S(l .2% 琼脂糖凝胶)
1.3.4 菌株稳定性鉴定 分别取原代和继代培养
2 5 10 20 40 50 代的 含质粒株 和 空质粒株 ,
细菌 l耐 , 用超声波破碎仪破碎 (JY % 一1 , 上海新
芝 ) 细菌 I n in, 之后 PCR 法扩增 invA 基因片段 ,
鉴定菌株的稳定性
PC R 扩 增用引物 l 为 CA G G ATA CCTATA GT-
G CTG C , 引物 2 为 CG CA CCG TCA AA G G A ACC GT
PC R 扩增体系包括 :10x 缓 冲液 2 闪 dNTP 0. 5
林l 引物 1 0.5 林l 引物 2 0.5 林l M g, 0.8 林l Taq
酶 0.5 卜l 模板 3 卜l 水 12.2 卜l,总体积 20 林l
PC R 反应条件 :94 变性 s m in , 94 40 5 , 55
40 5 , 72 40 5 ,共 35 个循环 ,最后 72 延伸 10
m In o
1.3.5 细菌生长规律测定 在无菌条件下 , 分别
取原代和传代 2 5 10 20 4D 50 代的 空质粒株
和 含质粒株 细菌 ,每小时取样一次 ,利用紫外分
光光度法测 定 O D60 值 ,绘制生长 曲线图
2 结果
2 .1 含质粒株 原代细菌中目的基 因质粒 pX -
AI S 和保守序列中 inv A 基 因鉴定
构建的 含质粒株 细菌 ,破碎 ,扩增 inv A 基 因
后进行电泳 , 出现特异性的 580 bp 条带 (图 1),说
明该菌株具有 c印和 as d 基因双缺失猪霍乱沙门氏
菌 Cso 菌株的特性 ;构建的 含质粒株 细菌酶切
后 用琼 脂糖凝胶进行 电泳 , 75 0 bp 左右有特异性
条带出现 (图 1) ,与目的基因质粒 pX AI S 片段大小
相吻合 ,说明该菌株含目的基因质粒
2 3 4 5
砚n甘勺六UlJU魂.弓,了JJ月.
图 , 含质粒株 细菌 户C R 扩增物与双醉切产物
电泳图谱
1 :以 ddH 20 为模板的阴性对照 ;2 ~4 : 含质粒株 破碎后 inv A 基
因 PC R 扩增产物 ;5 : 含质粒株 双酶切产物的 pX AI S 质粒检
测 ;M :15(X) bp 的 D N A M ark er
2. 2 含质粒株 传代培养后细菌保守序列 inv A
基 因测 定
空质粒株 (图 2 )和 含质粒株 细菌传代培
养 2 5 10 20 30 40 50 代(图 2 )时 ,分别取样 ,超
声波破碎后用 PC R 法扩增细菌保守序列中的 inv A
基因 ,电泳后均出现明亮的 580 !)p 特异性条带 ,阴
性对照(图 2) 未出现条带 ,说明 含质粒株 在传代
50 代后 ,仍然具有与 空质粒株 细菌类似的特性
图 2 空质粒株 和 含质粒株 细菌传代培养 2 5 , 0
20 30 40 50 代时 ,保守序列中 invA 基因 P C R 扩增
产物电泳图诺
l :空质粒株 细菌 inv A 基因 PC R 扩增产物 ;2 :以 ddH 20 为模
板的阴性对照 ;3一9 :分别为传代培养 2 5 10 20 30 40 50 代的
含质粒株 细菌 inv A 基因 PC R 扩增产物 ;M :巧 0 b p 的 D N A
M ar k e r
2.3 含质粒株 传代培养后各代细菌中px AI S
质粒检测
含质粒株 细菌传代培养 2 5 10 20 , 40 , 50
代时 ,提取质粒并进行双酶切 ,酶切产物电泳时出
2 兀因年 增 刊 甄艳红等 :含抑制素重组质粒的减毒猪霍乱沙门氏菌 Cso 遗传稳定性研究 303
现明显的 75 0 bP 条带(图 3 ) ,经上海生工测序鉴
定 ,该片段为抑制素融合基因质粒 px AI S 片段 ,说
明 含质粒株 细菌在培养 50 代后仍能检出目的基
因质粒 pX A IS
列一少
圈 3 含质粒株 细菌传代培养 2 5 10 20 40 和 50 代
时 ,双醉切产物电泳圈谱
1一6 :分别表示 含质粒菌 传代培养 2 5 10 20 40 和 50 代 的双
酶切产物 ;M :7(X) bp 的 D N A M ark er
2. 4 含质粒株 传代培养后各代细菌的生长规
律
含质粒株 和 空质粒株 细菌传代培养 2 5
ro 20 , 40 , 50 代后 ,分别取样 ,直接测 O D枷值 以
O D . 值为纵坐标 ,培养时间 (h )为横坐标 ,作生长
曲线图(图 4) 结果发现 ,虽然 含质粒株 细菌比
空质粒株 细菌生长速度快 ,但各代细菌生长进人
平缓期 ,对数生长期和稳定期的时间及曲线走势均
很相似 ,说明 含质粒株 和 空质粒株 的生长规律
趋于一致
3 讨论
最新发展起来的抑制素基因疫苗因其独特的
优点成为近年来的研究热点14一71 ,但常规的抑制素
基因疫苗因为抗性基因的存在不能广泛应用 ,因此
本实验室构建了不含抗性基因的抑制素染色体一质
粒平衡致死系统抑制素基因疫苗 ,即含抑制素重组
质粒 px AI S 的 c印 和 asd 双缺失猪霍乱沙门氏菌 C
50 菌株 ,其优势为(l ) Cso 菌株在机体内可以较
长时间地存活 ,可持续表达外源抑制素, 使机体产
生相应的抗体中和 自身抑制素 , 从而降低体内的
抑制素水平 (2) 抑制素染色体一质粒平衡致死系
统是无抗性的 含抗药基因的质粒是导致临床抗药
菌株播散的主要原因之一 ;同时抗生素的使用是基
. :含质粒菌 (tran , fo rm ed pxA Is plo m id Sal m onella C holera e-
suis CS(X) Stra sn w ith double deletion of 印 an d asd 罗nes ) : O :
空质粒菌 (un tran sfo rm ed pXA IS p las m id Sal m onella e holera e, uis
C S(X) Straj n w ith double deletion Of e甲 an d as d genes )
圈4 含质粒曹 和 空质较蔺 传代培养第 2 a ) 5 (匕)
10 (c ) 20 (d ) 40 (e )和 50 f)代的生长曲线
因工程产品制备过程中造成潜在痕量过敏现象发
生的重要来源19 因此本试验使用的非抗生素为标
记和选择压力载体具有更好的优越性和安全性
质粒在宿主中的稳定性是影响克隆效率的主
要因素之一 质粒的遗传稳定性是指转化细胞在生
长期间能够保持其含有的质粒不发生变化 ,并能显
示它们的表型特征困 ,质粒不稳定性 ,主要包括分
配不稳定性和结构不稳定性 , 前者是因质粒在细
胞分裂时的缺陷分配 , 导致整个质粒丢失而引起
的质粒数或质粒拷贝数降低;后者是指重组质粒中
插人的外源基因片段 , 由于分子内或分子间的重
组而发生的重排 插人或缺失等 , 而无法表达正常
的目的蛋白I2lJ 质粒的稳定性将显著影响其作为重
组质粒基因疫苗的应用效价I习一圳,因此在无抗性压
力存在下对质粒在 C so 菌株中是否稳定存在的研
究是必要的
本实验为研究含抑制素重组质粒 px AI S 的 甲
和 as d 基因双缺失猪霍乱沙门氏菌 Cso 菌株的遗
传稳定性 ,将其连续转接 50 代 首先利用双酶切及
PCR 扩增的方法 , 检测原代菌种是否含有抑制素
px AI S 目的片段及 c印 和 as d 基因双缺失猪霍乱沙
304 性物杖术通橄习初 hno 匆盯 B川肠血 2 X为 年 增 刊
门氏菌 Cso 菌株保守序列中 inv A 基因 ,结果显示
pxA Is 目的片段和 inv A 基因均被检测出(图 1) ,说
明原代菌株为 含质粒株 可以做继代培养 其次分
别从继代培养的菌液第 2 5 10 20 30 4() 和 50 代
取样 ,做检测发现除以去离子水为模板的阴性对照
无条带出现 ,均有 580 bp 特异性条带 ,与设计基因
大小一致 (图 2 ); 酶切产物电泳时均出现明显的
75 0 bp 条带 (图 3 ) ,经上海生工测序鉴定 ,该片段
为抑制素融合基因质粒 吓 AI S 片段 ,说明继代培养
含质粒株 的各代与 空质粒株 一样均能检测出
in vA 基因 ,具有与 空质粒株 细菌类似的特性 由
此得出 , 含质粒株 在传代 50 代后 ,仍能像 空质
粒株 一样稳定存在 结果表明 含质粒株 即抑制
素融合基因质粒 Px AI s 可以稳定存在于缺失 c印
墓因和 asd 基因的猪霍乱沙门氏菌 Cso 菌株中
对继代培养的 含质粒株 和 空质粒株 细菌
第 2 5 10 20 40 和 50 代分别取样 , 直接测 O D胡
值 ,绘出它们的生长曲线图 (图 4) ,从图中可以看
出 , 含质粒株 比 空质粒株 生长的快 但在最初
几代里生长缓慢 ,为其调整期 ,主要是由于刚刚接
种到培养液中 ,新旧环境差异 ,在细菌的细胞内需
要重新合成相应的诱导酶 ,以适应新环境 诱导酶
合成的调节是一种缓慢的粗调节 ,必须消耗一定的
时间 ,所以各代生长曲线的平缓期 ,对数生长期和
稳定期不是很明显 接下来 10 20 40 和 50 的细菌
生长曲线的平缓期 , 对数生长期和稳定期就很明
显 ,最初几个小时生长缓慢 ,接下来几个小时生长
迅速 ,进人对数生长期 最后一个小时可以看出进
人稳定期 ,细菌数 目基本独定 从试验结果可见 含
质粒株 和 空质粒株 细菌基本符合一般菌的生长
规律网;且两种菌的生长规律趋于一致 ,从而也说
明了 含质粒株 可以和 空质粒株 一样稳定存在
至少 50 代
本试验结果说明含抑制素重组质粒 pX AI S 的
crp 和 asd 基因双缺失猪霍乱沙门氏菌 Cso 菌株
生长稳定 ,且具有良好的遗传稳定性 ,这就为新型
无抗性的抑制素基因疫苗的成功构建提供依据 ,并
为提高动物繁殖力奠定理论基础
今 考文 做
1 茹达干,杨利国 .等.2仪场,37(11):11印州11肠.
2 姜勋平, 杨利国.畜牧兽医学报, 2(X) 2, 32(4) :38 自40 .
3 孙晓萍, 杨博辉,等.家畜生态学报.2仪巧, 27 (1): 84 州86 .
4 张红琳, 杨利国.黑龙江动物萦殖, 2以犯, 10( l): 12一14.
5 茹达干 ,杨利国,等.中国兽医学报, 2(X 拓, 26 (3): 29 2一29 5.
6 茹达干, 杨利国,等.畜牧兽医学报, 2加7,38(7) :713 一717.
7 张成云, 曾宪垠.畜牧兽医杂志 , 2加8 , 27(2) :35 37 .
8 H an L, Y 助名 比 声妞目.A ni耐 R ep耐 uc ti二 Sc i~ , 20 8 , 1的
(1礴 ):25 1~6 5.
9 梁爱心,杨利国,等.生物工程学报,2仪犯, 24 (6) :9 5~9 &
10 黄维.曹诚 ,等.生物工程学报,2(X) 3, 19( 5) :521~525 .
n 黄维 ,钟辉.等.生物技术通讯,2仪粗,13 (5 ):378一381 .
12 徐引弟,陈焕春,等.猪与禽, 20 7 , 27(6) :71 ~74.
13 陆文渊.成浩,等.茶叶科学 , 2(X) 8 , 28 (2) :147一151 .
14 凡时. i M , K. hav az T . BI Otec hnol叨 b 嗽e, 19 7 , 19 (10) :
985~988 .
15 吴乃虎.基因工程原理第 2 版M] .北京:科学出版社 , 1的8.
16 N 叮ak DP , v yas W . W odd jou rn al of M ic汕 101叨 , 1999. 巧:
65 ~ 7 1 .
17 徐引弟,郭爱珍 ,等.生物工程学报 ,2(X巧,2 (3) ,36 侧372 二
18 萨姆布鲁克 J, 弗里奇 EF, 曼尼阿蒂斯 T.分子克隆实脸指南
[M I.(第 3版 ).北京:科学出版社 ,2 犯,卯一102 .
19 萨姆布协克J, 弗里奇 EF ,受尼阿蒂斯 T.分子克隆实脸指南
[M .(第 3版 ).北京:科学出版社 ,2仪犯,27一30.
20 张秀华.重组质较的稳定性 M I. 国外医药抗生素分册 ,
19 1.12(3):161~I肠.
21 韦利军, 阮期平,等.药物生物技术 , 2(X 抖.11(2 ):肠侧0 .
2 李三建, 荣俊.长江大学学报 (自科版)农学卷 20 7 , 4( l):
4 8 ~ 5 5 .
23 张文治.徽生物学 M .北京:高等教育出版社 ,2侧万:肠自88.