全 文 ：综述与专论
生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2010年第 2期
减毒沙门氏菌作为 DNA疫苗载体的研究进展
陈伟 1 杨恒 2
( 1昆明理工大学分析研究测试中心,昆明 650000; 2昆明理工大学生命科学与技术学院,昆明 650000)
摘 要: 随着沙门氏菌基因组学的深入研究以及 DNA重组技术的发展, 使得对沙门氏菌进行精确的不可回复性的基因
缺失减毒成为可能。减毒沙门氏菌可作为 DNA疫苗载体,特异性地将其携带的质粒 DNA靶向性的传递给巨噬细胞、树突细
胞等抗原递呈细胞, 从而有效激发相应的体液与细胞免疫应答。减毒沙门氏菌已作为疫苗载体在针对细菌、病毒、寄生虫等
的 DNA疫苗研究中得以广泛应用。
关键词: 减毒沙门氏菌 基因缺失 疫苗载体 DNA疫苗
Progress in Attenuated Salmonella as DNA Vaccine Carrier
ChenW ei
1
YangH eng
2
(
1
Research Center for Analy sis andM easurem entK unm ing Univer sity of Science and T echnology, Kunm ing 650000;
2
College of L ife Science and T echnology, Kunm ing University of Science and T echno logy, K unm ing 650000)
Abstrac:t Recent prog ress in the know ledge of the genetics o f Salmonella and modern recomb inant DNA techno logy offers the
possibility to m ake Salm onella attenuated by in troduc ing de fined nonreverting mutations into the bacte rial genom e. A ttenuated Salm o
nella can be used as vaccine ca rr ier for e fficien t de livery DNA vacc ine directly to professional antig en presen ting cellssuch as m acro
phage and dendritic ce lls, wh ich can elicit strong hum ora l and cellu lar responses aga inst the pathogens. Currently attenuated Sa lm onella
has been w ide ly used to deliver DNA vaccines ofbac terium, v irus and parasite.
Key words: A ttenuated Salm onella Gene deletion Vaccine carr ie r DNA vaccine
收稿日期: 20091218
作者简介:陈伟,女,助理工程师,主要从事微生物分子生物学的研究; Em ai:l cherrychen2008@ 163. com
通讯作者:杨恒, Em ai:l 2008yanghengyh@ 163. com
沙门氏菌为一群寄生于人和动物肠道内的无芽
孢、革兰氏阴性直杆菌,可引起人和动物肠热症、胃
肠炎、败血症等, 呈全球性分布。随着人们对沙门氏
菌基因表达调控、侵入机制、毒力基因的深入研究以
及 DNA重组技术的不断发展,使得在细菌基因组水
平上对其进行基因缺失减毒成为可能。减毒后的沙
门氏菌仍保持了其侵入巨噬细胞、树突细胞的能力,
因此可作为疫苗载体将其携带的抗原蛋白或 DNA
疫苗靶向性的传递给抗原递呈细胞从而更为有效地
激发免疫应答。减毒沙门氏菌作为疫苗载体具有运
送效率高,免疫方法简单,免疫效果较好, 能同时激
发全身免疫和局部粘膜免疫等优点, 有着良好的应
用前景。目前,减毒沙门氏菌已作为疫苗载体在针
对细菌、病毒、寄生虫等的疫苗得以广泛研究并取得
了很大进展。
1 沙门氏菌的基因缺失减毒
沙门氏菌具有致病性, 而作为疫苗载体必须具
备良好的安全性, 因此对沙门氏菌的有效减毒是将
其作为疫苗载体的先决条件。目前许多与沙门氏菌
在宿主体内存活相关的基因被鉴定出来,并被缺失。
这些缺失的基因可分为两类, 一类是与细菌营养代
谢相关的基因;一类是沙门氏菌抵抗力、毒力相关的
基因。
1. 1 与细菌营养代谢相关的基因缺失
aroA、aroC、aroD 等基因分别编码 3磷酸莽草酸
1羧乙烯基转移酶、分支酸合酶、3脱氢奎宁酸脱水
2010年第 4期 陈伟等:减毒沙门氏菌作为 DNA疫苗载体的研究进展
酶,它们控制着细菌体内色氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸、
2, 3二羟基苯甲酸、对氨基苯甲酸等芳香族氨基酸
的生物合成,这些芳香族氨基酸对于细菌的生长起
着重要作用。 aroA 单基因缺失以及 aroA、aroC或
aroC、aroD双基因缺失均可导致细菌只能在体内有
限增殖,从而起到减毒的作用 [ 1, 2]。cya /crp基因分
别编码腺苷酸环化酶和环腺苷酸受体蛋白。细菌代
谢过程中某些基因的转录、营养物质的运送和分解、
一些氨基酸渗透酶的合成都受这两种蛋白的调节。
Curt iss
[ 3]通过 cya和 crp基因的缺失构建了减毒沙
门氏菌,其毒力显著降低并能引起高水平的抗体应
答以及细胞介导的迟发型超敏反应。asd基因编码
天冬氨酸 半乳糖脱氢酶,该酶在细菌合成二氨基
庚二酸 ( DAP)中起着重要作用。 DAP为革兰氏阴
性菌细胞壁主要化学成分肽聚糖中四肽侧链的一个
组分, DAP的缺乏直接影响到细菌细胞壁的合成,
并最终导致细菌死亡。N akayama等 [ 4]在沙门氏菌
cya /crp基因缺失的基础上进一步缺失了 asd基因
构建出平衡致死系统, 一方面使得沙门氏菌毒力进
一步降低,另一方面大大提高了沙门氏菌携带质粒
的稳定性。 pur基因在嘌呤合成途径中起着催化作
用,如 purA 基因编码腺苷酸琥珀酸合成酶,该酶催
化嘌呤合成途径中的次黄嘌呤腺苷酸 ( IMP)转化为
腺嘌呤 ( AMP)。Mcfarland等 [ 5 ]研究表明, pur基因
缺失的沙门氏菌导致细菌的代谢障碍而使毒力得以
有效降低。
1. 2 与细菌抵抗力、毒力相关的基因缺失
htrA基因编码沙门氏菌的 htrA 热休克应激蛋
白,该蛋白控制细菌在面临压力环境中相应基因的
转录, htrA基因缺失导致沙门氏菌对巨噬细胞中氧
化环境的抵抗力降低, 使其毒力得以降低。 Johnson
等 [ 6]构建了沙门氏菌 htrA 基因缺失株,体内外试验
均表明沙门氏菌得以有效减毒。同时, 体外试验表
明 htrA 基因缺失株虽不是温度敏感株, 但对氧化应
激环境的敏感性大大提高。沙门氏菌毒力岛 ( Sal
monella pathogen icity island, SPI)是指沙门氏菌在进
化过程中形成的主要决定其致病作用的区域,它位于
细菌的染色体上,至少由 60个基因组成,包括 SPI1、
SPI2、SPI3、SPI4以及 SPI5, 删除各岛上的调节基
因可使毒力大大降低。另外, 使由 SPI1和 SPI2编
码的 III型蛋白分泌系统的相关基因缺失或发生突
变, 也可大大降低沙门氏菌的毒力 [ 7]。phoP /phoQ
基因分别编码沙门氏菌的 PhoP转录调节蛋白和
PhoQ传感蛋白,当沙门氏菌被巨噬细胞吞噬后, 有
一系列逃避宿主杀灭的适应措施, 其中很多受控于
PhoP /PhoQ双组分调节子, phoP /phoQ基因的缺失
导致细菌在巨噬细胞中的存活能力下降而使其毒力
减弱 [ 8]。此外对调控细菌外膜蛋白 Omp R的以及
调控着沙门氏菌脂多糖 ( LPS)合成的WaaN基因的
缺失均可有效降低沙门氏菌毒力。
2 减毒沙门氏菌的侵入机制
减毒沙门氏菌进入肠道后,主要定植于肠道派
伊尔氏结 ( Peyer S patches, PP) ,以上皮细胞途径和
非上皮细胞两种途径进一步侵入肠道相关淋巴组织
中, 并随淋巴液与血液循环到达机体的深层组织。
21 上皮细胞途径
动物肠道黏膜表面 PP的滤泡上皮细胞中分布着
稀疏的微皱褶细胞, 即 M细胞 ( m icro fo ld cell),被肠
上皮细胞紧紧包围。M细胞有较高的通透性,不仅可
转运可溶性大分子而且还可转运颗粒性物质,细菌选
择性地粘附于 M细胞的顶尖膜表面后再被 M细胞吞
入。研究表明 [ 9] , M细胞膜的起皱是沙门氏菌侵入机
体的一个必要因素,这与细菌利用其 III型系统分泌
效应蛋白作用于 M细胞, 从而与诱导宿主细胞肌动
蛋白细胞骨架的重排有关。在这一过程中细胞质形
成一个向外的突起将细菌包裹在细胞膜内,以细胞摄
粒作用吞入细菌,细菌在穿过 M细胞后,可进一步被
肠道相关淋巴组织中的巨噬细胞吞噬。
2. 2 非上皮细胞途径
沙门氏菌除了通过 M细胞进入机体外,还可通
过树突细胞 ( dendritic cells, DC s)直接吞噬的非上皮
细胞途径侵入机体。DCs广泛分布于包括脾脏、淋
巴结、脚腺和肠道派伊尔结 ( PPs)等淋巴组织中。
PPs中的 DCs位于滤泡上皮的下层, 是上皮下层致
密层的组成部分之一。虽然 DC s不与肠腔直接接
触, 但 DC伸出的树突可以穿过肠上皮细胞间的紧
密连接 ( tight junctions, TJ) ,进入肠腔而不破坏上皮
细胞间连接,在此过程中,一旦发现微生物等抗原物
质就将其摄入体内。由于 DC有很强的迁移性, 因
此可携带细菌进一步到深层淋巴组织 [ 10 ]。
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生物技术通报 B iotechnology Bulletin 2010年第 4期
3 携带 DNA疫苗的减毒沙门氏菌诱发免疫
应答的机制
3. 1 沙门氏菌携带质粒的释放
携带 DNA疫苗的减毒沙门氏菌为吞噬细胞所
吞噬后局限在吞噬小泡中, 质粒 DNA是如何离开吞
噬泡而进入胞液的,目前对这一机制尚不完全明了。
早期的研究中普遍认为吞噬泡内细菌因营养缺陷而
死亡裂解后释放出的质粒 DNA, 可能通过渗漏的方
式从吞噬泡进入细胞质中 [ 11 ]。随后的研究中, 人们
认为也很有可能与细菌自身的特定转运机制有关
系,如在一些革兰氏阴性菌中存在的 III型分泌系
统,可将菌体蛋白注入细胞质中,同样的机制也可能
用于使质粒 DNA穿过溶酶体膜进入细胞质 [ 12 ]。在
体外试验中,不具有逃离吞噬泡功能的重组沙门氏
菌可将质粒 DNA传递给腹腔原代巨噬细胞和树突
细胞, 而对于离体培养的细胞系,这种传递效率则极
为低下。研究者认为, 在不同的细菌与细胞之间很
有可能存在特定的通道进行物质从溶酶体到细胞质
的传递 [ 13]。
3. 2 诱发免疫应答的机制
关于重组减毒沙门氏菌携带的 DNA疫苗如何
激发机体的细胞免疫和体液免疫, 目前尚无定论。
Darji等 [ 14]设想减毒沙门氏菌进入肠道后, 首先通
过 M细胞进入宿主体内,树突细胞 ( DCs)和巨噬细
胞 (M )可吞噬侵入肠粘膜屏障的重组沙门氏菌并
被激活, 活化的 DCs和 M 迁移至脾脏等淋巴组,
此时载体菌因营养缺陷死亡裂解,质粒 DNA通过渗
漏的方式从吞噬泡中进入胞液,然后进入细胞核,转
录出抗原蛋白的 mRNA并最终表达抗原蛋白。抗
原蛋白在 APCs中被降解为短肽片段, 并通过 MHC
I型、MHC II型方式的递呈给 Th细胞和 B细胞,细
胞免疫和体液免疫均被激活,且载体细菌的菌体脂
多糖 ( LPS)和质粒 DNA上的免疫刺激序列 ( ISS)可
起到免疫佐剂的作用,加强特异性的免疫应答。
另一种可能的机制主要通过沙门氏菌介导的细
胞凋亡和交叉激活 ( crossprim ing )的方式进行。研
究表明 [ 15] , 沙门氏菌感染 APC s细胞后可导致宿主
细胞的发生两种形式的凋亡,在细胞凋亡的过程中
可导致细胞成分的大量外泄,其中也包含了沙门氏
菌携带的质粒 DNA。凋亡细胞邻近的 M 与 DCs
细胞可吞噬这质粒 DNA, 经表达后再通过 MHC I
型、MHC II型方式的递呈给 Th细胞和 B细胞,通过
这种交叉激活的方式可诱导产生强烈而持久的保护
性反应。目前,交叉激活以及 DC s在减毒沙门氏菌
携带 DNA疫苗免疫中的重要作用已得到人们较为
广泛的接受。
4 减毒沙门氏菌作为 DNA疫苗载体的
优势
减毒沙门氏菌作为疫苗载体具有以下一些特殊
的优点 [ 16, 17] :减毒沙门氏菌作为疫苗载体能特异地
将质粒 DNA特异性的传递入巨噬细胞、树突细胞等
抗原递呈细胞,从而有效激发相应的体液与细胞免
疫应答;细菌本身可作为一种免疫佐剂,起到增强免
疫应答的能力。类脂 A是沙门氏菌的 LPS的主要
组成部分之一,它可以刺激宿主细胞释放各种细胞
因子,提高机体的免疫应答, 此外, 细菌基因组中的
非甲基化 CpG序列也具有强的免疫刺激活性;已知
至少有 90%的细菌、病毒和寄生虫感染都是在粘膜
表面发生的,以减毒沙门氏菌为载体的免疫可采用
口服、点眼或滴鼻等途径进行,方便了疫苗的群体接
种, 同时接种后刺激产生粘膜免疫,阻止病原在粘膜
表面的侵入和定居;在疫苗的制备上只需培养细菌
即可,大大降低了疫苗的生产成本;减毒沙门氏菌在
侵入宿主后,可于一段时间内进行有限增殖,因此其
免疫具有持续性。
5 减毒沙门氏菌的作为 DNA疫苗载体的
应用
5. 1 应用于细菌疫苗
Darji等 [ 18 ]用携带李斯特菌溶血素 DNA疫苗的
重组减毒鼠伤寒沙门氏菌口服免疫小鼠,获得了很
强的细胞与体液免疫水平, 并能保护小鼠免受致死
量李斯特菌的攻击。此外, Darji还发现沙门氏菌介
导的 DNA疫苗免疫可诱生免疫记忆,鼻内和经口途
径接种都可诱发全身免疫, 但粘膜免疫的效果不一
样, 口服免疫可在肠道而不在肺产生抗体,鼻内免疫
在肺而不在肠道产生抗体。 Pasetti等 [ 19 ]构建了携
带表达破伤风毒素 C未端 ( F ragC)真核表达质粒的
重组伤寒沙门氏菌, 并通过鼻内免疫小鼠。结果表
明,免疫小鼠血清中产生了高滴度的 IgG类抗体, 并
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2010年第 4期 陈伟等:减毒沙门氏菌作为 DNA疫苗载体的研究进展
有效诱导了小鼠的 Th1和 Th2反应。
5. 2 应用于病毒疫苗
由于病毒的保护性抗原蛋白多为糖基化蛋白,
而 DNA疫苗的优势之一在于在细胞内表达的蛋白
可进行有效地糖基化与折叠,最大限度地保证了蛋
白的抗原性,因此减毒沙门氏菌在传递病毒性 DNA
疫苗上得到极为广泛的应用。Woo等 [ 20 ]将携带乙
型肝炎病毒 (HBV)表面抗原 HBsAg的 DNA疫苗转
入减毒鼠伤寒沙门氏菌 SL7207, 后口服免疫小鼠,
并与肌注 HBsAg DNA疫苗和腹膜下注射重组 HB
sAg蛋白两种免疫方法诱导的免疫应答进行比较。
结果显示,重组菌免疫组可诱导比重组 HBsAg蛋白
免疫组更强的 CTL反应,与肌肉注射 DNA免疫诱
导的 CTL相当,但其诱导的体液反应较弱。由于细
胞免疫在清除肝细胞中的 HBV时发挥主要作用,而
体液免疫的清除能力较弱,口服携带 HBsA gDNA疫
苗的重组沙门氏菌可激发较强的 CTL, 显示了其一
定的应用前景。 Li等 [ 21]构建了携带鸡传染性法氏
囊病毒完整多聚蛋白 VP2 /4 /3 DNA疫苗疫苗的减
毒沙门氏菌,口服免疫 7日龄雏鸡后显示了良好的
安全性,对 IBDV攻毒的保护率达到 73. 3%。此外,
减毒沙门氏菌还被应用于艾滋病病毒 ( H IV )、单纯
疱疹病毒 ( HSV )、新城疫病毒 ( NDV )、猪传染性胃
肠炎病毒 ( TGEV )及呼吸道合胞体病毒 ( RSV )等病
毒疫苗的研究 [ 22- 26]。
5. 3 应用于寄生虫疫苗
Du等 [ 27 ]将含有鸡柔嫩艾美尔球虫 5401基因
的真核表达质粒转入减毒沙门氏菌 ZJ111中,通过
口服免疫接种 3日龄雏鸡。结果表明, 重组沙门氏
菌具有相对良好的安全性, 重组质粒在细菌中较为
稳定; 重组沙门氏菌免疫鸡后可诱导产生鸡柔嫩艾
美尔球虫抗体,且能显著增强淋巴细胞增殖水平, 对
鸡柔嫩艾美尔球虫攻毒保护性可达 57. 5%。Qu
等 [ 28]将编码鼠弓形虫的表面抗原蛋白的 SAG1的真
核表达质粒转入转入减毒沙门氏菌 ZJ111中, 以不同
剂量口服接种小鼠。结果显示,重组沙门氏菌有效诱
导了接种小鼠产生 SAG1抗体,且抗体水平与免疫剂
量相关, 107 CFU的接种量诱导的抗体水平显著高于
10
6
CFU与 108 CFU; 免疫小鼠体内检测到了高水平
的 INF ,表明诱导了 Th1型免疫应答;攻毒试验显示
将小鼠的死亡率有效减少了 20%。
6 展望
减毒沙门氏菌载体因其具有特殊的优点而成为
疫苗研究的热点, 已被广泛应用于病毒、细菌、寄生
虫等疫苗的研制并展示了良好的应用前景。但其仍
然存在一些问题, 如携带的高拷贝质粒导致体内细
菌携带质粒的迅速丢失、针对沙门氏菌载体的免疫
应答将消弱其传递的 DNA疫苗免疫效果、诱导的体
液免疫反应不足等 [ 29, 30]。目前,以减毒沙门氏菌为
载体的疫苗虽然只能作为常规疫苗的一种补充, 但
随着生物学技术的发展, 尤其是基因工程改造技术
的不断完善和发展,减毒沙门氏菌载体在疫苗研究
中将体现出更大的应用价值。
参 考 文 献
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