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生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2011 年第 3 期
稳定携带山羊痘病毒 DNA疫苗减毒沙门氏菌的构建
尹传宝1 程振涛2 朱琦1 彭彩丽1 鲜思美1 周碧君1，2 文明1，2
(1贵州大学动物科学学院，贵阳 550025;2贵州省动物疫病研究室，贵阳 550025)
摘 要: 为构建质粒稳定型山羊痘 DNA疫苗，采用 PCR与限制性酶切技术去除真核表达质粒 pcDNA3． 1(+)的氨苄抗性
bla基因启动子序列，构建改良质粒 pmcDNA3． 1(+)，然后插入山羊痘病毒 P32 基因，获得重组表达质粒 pmcDNA3． 1-P32，通过
TSS法将其转化至减毒沙门氏菌中，构建成功携带山羊痘DNA疫苗的重组减毒沙门氏菌 SL7207 (pmcDNA3． 1-P32);体内和体外
试验结果表明，重组质粒 pmcDNA3． 1-P32在沙门氏菌中的稳定性显著高于 pcDNA3． 1-P32。这为下一步减毒沙门氏菌介导的山
羊痘 DNA免疫研究奠定了基础。
关键词: 减毒沙门氏菌 稳定 山羊痘 疫苗
Construction of Attenuated Salmonella typhimurium Stably
Harbouring DNA Vaccine Against Goatpox Virus
Yin Chuanbao1 Cheng Zhentao2 Zhu Qi1 Peng Caili1 Xian Simei1 Zhou Bijun1，2 Wen Ming1，2
(1College of Animal Science，Guizhou University，Guiyang 550025;2Laboratory of Animal Epidemic Disease of Guizhou，Guiyang 550025)
Abstract: In order to construct the goatpox DNA vaccine of stable plasmid，the methods of PCR and restriction enzyme were ap-
plied to remove the promoter sequence of ampicillin resistance gene (bla gene)in plasmid pcDNA3． 1(+)to construct the pmcDNA3．
1(+)． The P32 gene of goatpox virus was subcloned into eukaryotic expression vector pmcDNA3． 1(+)． The recombinant plasmid was
transformed into attenuated Salmonella typhimurium SL7207，and the recombinant was designated as SL7207(pmcDNA3． 1-P32)． In
vitro and in vivo experiments showed that the plasmid stability of pmcDNA3． 1-P32 was apparently higher than that of pcDNA3． 1-P32 in
SL7207． It provided the foundation for the future research of mucosal immunity with attenuated Salmonella typhimurium．
Key words: Attenuated Salmonella typhimurium Stability Goatpox Vaccine
收稿日期:2010-07-29
基金项目:贵州省优秀科技教育人才省长专项基金项目(黔省专合［2006］12 号) ，国家自然科学基金主任基金项目(30940054)
作者简介:尹传宝，男，硕士研究生，研究方向:动物分子免疫学;E-mail:chuanbaoyin@ 163． com
通讯作者:文明，男，博士，教授，主要从事预防兽医学教学与科研工作;E-mail:as． mwen@ gzu． edu． cn
沙门氏菌作为胞内侵袭细菌，能有效呈递抗原，
激发机体产生抗沙门氏菌和诱导外源蛋白的特异性
体液与细胞免疫反应，并能同时诱导黏膜免疫。减
毒沙门氏菌 SL7207(aro A －)为芳香族基因缺失株，
在宿主体内只能有限增殖，已被广泛应用于携带
DNA质粒和作为外源抗原基因的表达宿主菌［1］。
质粒在减毒沙门氏菌的稳定性是口服疫苗刺激机体
产生免疫应答的关键。高拷贝质粒在减毒沙门氏菌
中不稳定，在无选择压力培养条件下体外或体内极
易丢失［2］。因此，在利用减毒沙门氏菌为载体传递
DNA疫苗研究时，要充分考虑质粒类型、拷贝数与
其在宿主菌内稳定性的关系、携带外源基因重组质
粒对载体菌侵袭力和存活力的影响等问题，以提高免
疫效果。为此，本研究对真核表达质粒 pcDNA3． 1
(+)进行改造，然后插入山羊痘病毒(GPV)P32 基因，
导入减毒沙门氏菌 SL7207 并测定其质粒稳定性，以
期为下一步减毒沙门氏菌介导的山羊痘 DNA免疫研
究奠定基础。
1 材料与方法
1． 1 质粒和菌种
真核表达质粒 pcDNA3． 1(+)、宿主菌E． coli
DH5α和减毒鼠伤寒沙门氏菌 SL7207(aro A －)由贵
州大学预防兽医学实验室保存;含山羊痘病毒
(GPV)P32 基因的重组质粒 pcDNA3． 1-P32 由笔者
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2011 年第 3 期
构建。
1． 2 主要试剂
Taq酶、高保真 Pfu酶、DNA Marker 购自天根生
化科技(北京)有限公司;限制性内切酶 BamHⅠ、
HindⅢ、PagⅠ和 MluⅠ，购自 Fermentas 公司;T4
DNA连接酶、pMD18-T 载体、DNA A-Tailing Kit 购
自宝生物(大连)有限公司;质粒小剂量提试剂盒、
Gel Extraction kit(50 ×) ，购自 Omega 公司;其他均
为国产分析纯。
1． 3 无启动子 bla基因获得
根据 pcDNA3． 1(+)载体序列与酶切位点，参考
张晓明等［3］设计合成引物 P1(5-TCATGAGAAAAA-
GGAAGAGTATGAGTAT-3，下划线为 PagⅠ酶切位
点)和 P2(5-AACGCGTGGTCTGACAGTTACCAAT-
GC-3，下划线为 MluⅠ酶切位点) ，预期扩增大小
900 bp。以 pcDNA3． 1(+)为模板，Pfu 酶扩增不含
启动子 bla基因，回收纯化，经 DNA A-Tailing Kit 进
行末端加 A 处理，与 pMD18-T 载体连接，转化
DH5α，挑取单个菌落并增菌，提取质粒，进行 BamH
Ⅰ与 Hind Ⅲ双酶切和 P1 /P2 引物 PCR 鉴定，阳性
质粒送宝生物(大连)有限公司测序，重组质粒命名
为 pMD18-T-bla。
1． 4 改良载体构建
回收 pMD18-T-bla 的 BamHⅠ /Hind Ⅲ双酶切
产物，再用 PagⅠ和 MluⅠ进行双酶切和回收，与经
同样处理的真核载体 pcDNA3． 1(+)进行连接，转化
DH5α，挑取单个菌落增菌后抽提质粒并进行双酶切
鉴定，改良载体命名为 pmcDNA3． 1(+)。
1． 5 携带 P32 基因重组载体构建
用 BamHⅠ与HindⅢ酶分别 pcDNA3． 1-P32和改
良载体 pmcDNA3． 1(+)进行酶切、回收、连接，转化至
DH5α，挑取单个菌落增菌后抽提质粒，采用 GPV P32
基因引物［4］(P32a:5-CGGGATCCCTAAACTATATAC-
GAAATAACATAC-3，P32b:5-CCCAAGCTTATGGCA-
GATATCCCATTATATG-3，预期扩增片段大小 986 bp)
进行 PCR和双酶切鉴定，阳性质粒送宝生物(大连)有
限公司测序，重组质粒命名为 pmcDNA3. 1-P32。
1． 6 重组减毒沙门氏菌的构建
采用 TSS法制备减毒沙门氏菌感受态细胞，将
重组质粒 pmcDNA3. 1-P32 和 pcDNA3. 1-P32 分别
转化至减毒沙门氏菌中，挑取单个菌落增菌，碱裂解
法抽提质粒，采用 P32 基因引物进行 PCR 鉴定;取
PCR产物送宝生物(大连)有限公司测序，阳性转化
子命名为 SL7207 (pmc-DNA3. 1-P32)和 SL7207
(pcDNA3． 1-P32)。
1． 7 重组沙门氏菌体外稳定性测定
挑取 SL7207(pmcDNA3. 1-P32)与 SL7207
(pcDNA3. 1-P32)单个菌落分别接种于 100 mL
LB(Amp +)和 100 mL LB(Amp －)液体培养基，
37℃ 100 r /min 摇床培养。吸取不同培养时间菌
液测定 OD600值后，适当稀释菌液，分别涂布于含
与不含氨苄青霉素的 LB 平板，37℃培养 24 h，以
含氨苄青霉素平板上生长的菌落数除以不含氨
苄青霉素的菌落数，计算重组减毒沙门氏菌质粒
的稳定性。
1． 8 重组沙门氏菌体内稳定性测定
取 8 － 10 周龄、体重 20 － 25 g 的 BALB /c 小鼠
40 只(购自贵阳医学院动物实验中心) ，随机 2 组
(20 只 /组) ，对应腹腔注射含 1 × 108CFU的 SL7207
(pmcDNA3． 1-P32)和 SL7207(pcDNA3． 1-P32)菌
液，于注射后 1、3、5 和 7 d 扑杀小鼠，5 只 /组，无菌
取脾脏后用 0． 1% Trition X-100 PBS研磨后分别涂
布于含与不含氨苄青霉素的 LB 平板，37℃培养 24
h，计算重组减毒沙门氏菌质粒的稳定性。随机挑
取单个菌落增菌后，采用沙门氏菌属特异性引
物［5］ (stn1:5-CTTTGGTCGTAAAATAAGGCG-3，
stn2:5-TGCCCAAAGCAGAGAGATTC-3，预 期 扩
增大小 260 bp)对分离菌进行 PCR检测;碱裂解法
提取阳性菌质粒，再用 GPV P32 基因引物进行
PCR鉴定。
2 结果
2． 1 无启动子 bla基因获得
以 bla 基因 P1 /P2 为引物，pcDNA3． 1(+)为模
板，Pfu 酶扩增不含启动子 bla 基因，PCR 产物末端
加 A处理后与 pMD18-T 载体相连，转化至 DH5α，
提取重组质粒进行 BamHⅠ /Hind Ⅲ双酶切和 PCR
鉴定(图 1，图 2)。
由图 1 和图 2 看出，双酶切后可见载体带
(2 650 bp)与目的基因(942 bp) ，PCR扩增后可得
601
2011 年第 3 期 尹传宝等:稳定携带山羊痘病毒 DNA疫苗减毒沙门氏菌的构建
到与预期大小(900 bp)相一致的 DNA条带;测序显
示，目的基因与 pcDNA3． 1(+)中 bla 基因序列一致
且不含氨苄抗性启动子，即成功获得了无启动子序
列的 bla基因。
M． 200 bp Marker;1，2．重组质粒 pMD18-T-bla
图 1 重组质粒 pMD18-T-bla双酶切鉴定
M． 200 bp Marker;1，2．酶切产物 PCR扩增
图 2 重组质粒 pMD18-T-bla酶切产物 PCR鉴定
2． 2 改良载体构建
酶切、回收和纯化 bla 基因，与线性质粒 pcD-
NA3． 1(+)相连，经 PagⅠ和 MluⅠ双酶切鉴定(图
3)。
M． 200 bp Marker;1，2．改良质粒
图 3 改良载体酶切鉴定
由图 3 看出，经 PagⅠ和 MluⅠ双酶切后，pm-
cDNA3． 1(+)呈现载体带(4 100 bp)与目的带(900
bp) ，说明成功构建出 pmcDNA3． 1(+)改良质粒。
2． 3 携带 P32 基因重组载体构建
从质粒 pcDNA3． 1-P32 截取山羊痘病毒 P32 基
因，亚克隆到 pmcDNA3． 1(+)中，采用 PCR 扩增与
双酶切鉴定(图 4，图 5)。
M．200 bp Marker;1，2．重组质粒
图 4 重组质粒 PCR鉴定
M．200 bp Marker;1，2．重组质粒
图 5 重组质粒酶切鉴定
由图 4 和图 5 看出，采用 P32 基因引物对重组
pmcDNA3． 1(+)进行 PCR 扩增，可得到与预期大小
(986 bp)相一致的 DNA 条带;以 BamHⅠ /Hind Ⅲ
重进行双酶切，可见到载体带(5 000 bp)与 P32 基
因带(980 bp) ;测序显示，重组载体插入序列与已知
GPV P32 基因核苷酸同源性 100%，说明成功构建
了重组质粒 pmcDNA3． 1-P32。
2． 4 重组减毒沙门氏菌构建
将重组质粒 pmcDNA3． 1-P32 与 pcDNA3． 1-P32
分别转化减毒沙门氏菌中，经 LB(Amp +)琼脂平板
筛选，增菌培养后，采用碱裂解法提取质粒，以 P32
基因引物进行 PCR鉴定(图 6)。
M. DL2000 Marker;1. SL7207(pmcDNA3. 1-P32) ;
2． SL7207(pcDNA3． 1(+)-P32)
图 6 重组沙门氏菌 PCR鉴定
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生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2011 年第 3 期
从图6看出，采用 P32基因引物进行 PCR扩增，均
能得到与预期大小(986 bp)相一致的 DNA条带;测序
显示，插入目的片段与已知 GPV P32基因核苷酸同源
性为 100%，表明成功构建了重组减毒沙门氏菌 SL7207
(pmcDNA3. 1-P32)和 SL7207(pcDNA3． 1-P32)。
2． 5 重组沙门氏菌体外稳定性
取 SL7207(pmcDNA3． 1-P32)和 SL7207(pcDNA3. 1-
P32)不同培的时间菌液，测定OD600值后，用 PBS适当稀
释菌液，涂布 LB平板，计算质粒的稳定性(图7)。
图 7 重组沙门氏菌在 LB(Amp －)稳定性
从图 7 看出，在选择压力下两者稳定性差异不
显著，OD600至 1． 8 时质粒稳定性均保持在 90%以上
(数据未列出) ，而在无选择压力下重组菌 SL7207
(pmcDNA3． 1-P32)稳定性高于 SL7207(pcDNA3． 1-
P32) ，OD600至 1． 8 左右稳定性仍保持在 90%左右。
2． 6 重组沙门氏菌体内稳定性
取 SL7207(pmcDNA3． 1-P32)和 SL7207(pcD-
NA3． 1-P32)的 1 ×108CFU菌液，分别腹腔注射小鼠，
于注射后1、3、5和 7 d杀鼠，无菌取脾脏，匀浆处理后
涂布在 LB平板，计算重组菌质粒的稳定性(图 8) ;随
机挑取单个菌落增菌，分别进行沙门氏菌特异性引物
和 P32基因引物 PCR鉴定(图 9，图 10)。
图 8 重组沙门氏菌体内稳定性
M． DL2000 Marker;1－ 4．脾脏分离菌
图 9 沙门氏菌属 PCR鉴定
M． DL2000 Marker;1－ 4．分离菌质粒
图 10 分离菌质粒 P32 基因 PCR扩增
由图 8 看出，重组菌 SL7207(pmcDNA3． 1-P32)
在第 7 天稳定性仍保持在 80% 左右，而 SL7207
(pcDNA3． 1-P32)第 1 d稳定性下降至 40%左右，到
第 7 天下降至 0%。由图 9 和图 10 看出，采用沙门
氏菌属引物对小鼠脾脏分离菌进行 PCR扩增，可得
到与预期大小(260 bp)一致的 DNA 条带;以 GPV
PC2 基因引物对阳性菌株提取质粒进行 PCR 扩增，
可见到大小约为 986 bp 的目的条带，提示经 LB
(Amp +)琼脂平板筛选后，分离菌均为携带 P32 基
因的减毒沙门氏菌，也证实了以含氨苄青霉素平板
上生长的菌落数除以不含氨苄青霉素的菌落数，计
算质粒稳定性方法的可靠性。
3 讨论
通过基因工程减毒的沙门氏菌，能有效地将真
核表达载体转移到机体巨噬细胞和树状突细胞中，
使表达质粒编码的抗原基因得到高效表达，从而激
发机体产生有效的免疫应答反应，故广泛作为 DNA
疫苗的新型载体。研究表明，P32 蛋白是已知羊痘
病毒中的特异性高、免疫原性强的结构蛋白，可作为
研究和开发新型羊痘疫苗的首选蛋白［6］。
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稳定性是衡量和评价 DNA 疫苗有无开发价值
的基本条件。重组质粒在宿主菌内的稳定性和对宿
主菌的侵袭力影响因素有多种，如质粒类型［7］、侵
袭相关蛋白 (三型分泌系统)［8］、细菌的培养条件
(pH、渗透压和含氧量等)［9 － 11］等，其中质粒类型与
质粒在宿主菌内的稳定性直接相关［12］。重组减毒
沙门氏菌分裂增殖时重组质粒随机分配到子代，在
抗生素条件下抑制或杀死不含重组质粒的细菌，而
一旦体外选择压力减弱或消失，不含重组质粒的细
菌生长速度将远远超过含重组质粒的细菌。重组沙
门氏菌中质粒的不稳定情况可考虑通过对真核载体
质粒进行改造得以解决:一是控制质粒拷贝数。但
过低的拷贝数导致传递的质粒 DNA量也大大减少，
相应可能降低 DNA疫苗的免疫效果。因此，通过降
低质粒拷贝数提高质粒在细菌中的稳定性，需在质
粒稳定性与拷贝数之间选取一个合适的平衡点;二
是在质粒与沙门氏菌中同步引入“平衡致死系统”，
该系统一方面避开了抗性基因的使用，另一方面一
旦细菌中质粒丢失，将直接导致细菌死亡，使得不含
质粒的细菌不可能大量增殖成为优势群体，从而提
高质粒的稳定性［13］。
重组质粒在宿主菌不稳定，主要是由于外源的
高拷贝质粒对于宿主菌来讲是一个沉重的“代谢负
担”，高拷贝质粒在单个细菌中的拷贝数可达到 500
个，其中 DNA 的复制、相关蛋白质的表达占用了细
菌的大量资源，在抗生素压力下，高拷贝质粒依赖其
携带的抗生素抗性基因来维持在宿主菌体内的稳定
性;一旦外源压力不再存在，高拷贝质粒将迅速从宿
主菌丢失［14］。
陈洪等［15］在体外培养携带柯萨奇 B 组病毒
DNA疫苗的沙门氏菌 SL7207 (pcDNA3-VP1)时发
现，细菌在培养 6 h 前，含有质粒的细菌比例可在
95%以上，但培养时间超过 16 h，质粒的稳定性不足
20%，但未对重组菌进行体内培养测定。Dunstan
等［12］通过比较不同表达质粒在沙门氏菌内的稳定
性，发现低拷贝数的质粒具有较高的稳定性，但也未
考虑到低拷贝可能会减低免疫效果。Garmory 等［16］
也通过降低拷贝数成功构建了高稳定性的表达质
粒，也仅对空载体稳定性进行了检测，未插入外源基
因。张晓明等［3］利用 PCR与酶切技术，扩增获得不
含启动子序列的氨苄抗性基因 bla 后插入原载体
pcDNA3． 1(+) ，构建完成 pmcDNA3． 1(+) ，体外培
养发现 SL7207 (pmcDNA3． 1 +)接种含与不含抗生
素的液体培养基都能保持很高的质粒稳定性。而
SL7207 (pcDNA3． 1)在生长的早指数期(OD600≤
0． 2)能很好保持质粒的稳定性，随后质粒很快丢
失，在不含抗生素的液体培养基中，质粒迅速丢失。
基于以上几点，本研究构建了重组质粒 pmcD-
NA3． 1-P32，并将其转化至减毒沙门氏菌 SL7207，体
内外培养两种重组菌 SL7207(pmcDNA3． 1-P32)、
SL7207(pcDNA3． 1-P32) ，测定两种重组菌质粒稳定
性。体外培养结果显示，在 Amp +条件下 SL7207(pm-
cDNA3． 1-P32)与 SL7207(pcDNA3． 1-P32)稳定性相
当;在 Amp-条件下 SL7207(pmcDNA3. 1-P32)培养
OD600至 1． 8 左右时稳定性仍能保持在 80%，SL7207
(pcDNA3． 1-P32)在 OD600在 0． 6 前稳定性较好，培养
14 h后，质粒稳定性仅为 3%。体内培养结果显示，
SL7207(pmcDNA3． 1-P32)稳定性显著高于 SL7207
(pcDNA3． 1-P32) ，到第 7 天稳定性保持在 80%。出
现上述现象可能是由于改良质粒 bla 基因缺乏自身
启动子，仅通过高拷贝数带来的累积效应［17］或载体
潜在的微弱启动子活性序列表达抗性蛋白［18］，一定
程度上降低了宿主菌“代谢负担”。
综上所述，本研究成功构建了稳定携带山羊痘
病毒 DNA疫苗减毒沙门氏菌，为制备高稳定性山羊
痘 DNA口服疫苗奠定了基础。
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(责任编辑 狄艳红)
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