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生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2010 年第 6 期
盐胁迫下甘菊叶片中 BADH基因表达及
甜菜碱含量的变化
曹华雯 牛雅静 黄河 戴思兰
(北京林业大学园林学院，北京 100083)
摘 要: 利用实时荧光定量 PCR(real-time PCR)和雷氏盐紫外分光光度计法分别测定了 400 mmol /L NaCl胁迫处理 0，
0. 5 h，2 h，12 h，1 d，2 d，4 d，6 d，8 d，10 d和 12 d，甘菊叶片中 BADH基因表达和甜菜碱含量的变化，并讨论了二者间的相互
作用关系。试验结果表明，在高盐胁迫下甘菊叶片中 BADH 基因和甜菜碱含量均呈现先上升后下降的趋势。在处理初期
(0. 5 h和 2 h)BADH基因的表达量与对照相比略有下降，此后随处理时间的增加 BADH基因表达持续增大，在胁迫处理6 d时
BADH基因表达量最大为对照的 4. 6 倍，6 d之后 BADH基因表达量逐渐降低。甜菜碱含量在 NaCl处理 0. 5 h突然增大以应
对胁迫反应，此后其含量出现了小幅的震荡上升，在胁迫处理 4 d时达到了最大值，此后随胁迫处理时间的增加甜菜碱含量逐
渐降低。二者之间的变化并不是同步的，而是存在滞后性，分析认为甘菊叶片中 BADH基因表达与甜菜碱积累间存在相互抑
制的作用。
关键词: 甘菊 盐胁迫 BADH基因 real-time PCR 甜菜碱
Expression of BADH Gene and Betaine Content in Leaves of
Dendranthema lavandulifolium Under Salt Stress
Cao Huawen Niu Yajing Huang He Dai Silan
(College of Landscape Architecture，Beijing Forestry University，Beijing 100083)
Abstract: In this study，we analyzed the expression of BADH gene by real-time fluorescence PCR and the content of betaine in
leaves from Dendranthema lavandulifolium under 400 mmol /L NaCl treatment with 0，0. 5 h，2 h，12 h，1 d，2 d，4 d，6 d，8 d，10
d and 12 d，discussed the relationship between BADH gene and betaine. The results showed that，under NaCl treatment both BADH
gene expression and the content of betaine had exhibited the tendency that first increased and then decreased. The expression level of
BADH gene was down slightly compared with the untreated control at 0. 5 h and 2 h. With the extension of treatment time，the level of
BADH gene was continuous increased and reached the maximum at 6 d，which were 4. 6 － higher than untreated control. The activity of
BADH gene was decreased gradually after 6 d under NaCl treatment. The content of betaine was a sudden increase in NaCl treated with
0. 5 h，since then the content of betaine fluctuate raise until treatment at 4 d reached a maximum. Thereafter the synthesis of betaine
was drop drown slowly. The changes between BADH gene and betaine were not at the same time，but had a lag. The BADH gene ex-
pression and betaine expression were inhibition by each other.
Key words:Dendranthema lavandulifolium Salt stress BADH gene Real-time PCR Betaine
收稿日期:2010-03-26
基金项目:“863”计划重点项目(2007AA021403)
作者简介:曹华雯，女，在读博士，研究方向为花卉抗逆性分子生物学;E-mail:huawenc@ 163. com
通讯作者:戴思兰，女，教授，博士生导师，研究方向为花卉分子生物学
高盐、低温和干旱是影响植物生长和产量的最
重要的非生物胁迫因子。在生物进化过程中，为了
在胁迫条件下保持细胞的正常代谢平衡，许多高等
植物衍化出一系列的适应策略［1，2］。在细胞水平
上，最常见的渗透胁迫适应是在细胞质中大量积累
相溶性溶质，包括氨基酸、铵类化合物、多元醇和糖
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2010 年第 6 期
等。这些溶质可以降低细胞的渗透势，但并不破坏
细胞内的代谢平衡或蛋白的结构与功能，因此在胁
迫条件下保持了细胞的含水量［3，4］。
甜菜碱(glycine betaine)被认为是这些渗透保
护剂中最为有效的物质之一［5］，它是一种季铵类化
合物(quaternary ammonium compound) ，在细菌、藻
类、高等植物和动物中都有发现。研究表明绝大多
数的植物在受到盐、干旱或低温胁迫时都能合成甜
菜碱［6-8］。甜菜碱通过稳定蛋白的四级结构和调节
细胞质的渗透势来增加细胞对于胁迫的耐受性;并
通过稳定光系统Ⅱ(PSⅡ)外周多肽等来维持植物
正常的光合作用［9，10］。外源施用甜菜碱可以显著改
善植物对于胁迫的适应性［11，12］。甜菜碱在植物体
中由两步合成:胆碱(choline)→甜菜碱醛(betaine
aldehyde)→甜菜碱，其中胆碱单加氧酶(choline mo-
nooxygenase，CMO)催化第一步反应，第二步反应则
由甜菜碱醛脱氢酶(betaine aldehyde dehydrogenase，
BADH)催化完成［14］。
菊科是被子植物第一大科也是双子叶植物进化
程度最高的科［15］，拥有丰富的极具观赏价值的栽培
和野生种类。作为植物化学分类学里中央种子目的
一员，菊科中普遍存在着甜菜碱［16］，蕴藏着宝贵的
甜菜碱及其合成酶基因资源。因此，对菊科植物进
行胁迫条件下甜菜碱含量与 BADH 基因变化间的
相互关系进行研究具有重要价值。在前期的研究工
作中，本课题组已经克隆到了菊科菊属植物甘菊
［Dendranthema lavandulifolium(Fisch. ex Trantv.)
Ling et Shih］中的两个 BADH基因 cDNA全长，命名
为 DlBADH1 和 DlBADH2 (GenBank 登 录 号:
DQ011151 和 DQ011152)［17］。半 定 量 RT-PCR-
Southern 杂交结果表明，在相同处理时间下甘菊
BADH基因表达量随 NaCl处理浓度的增加而增大，
在 400 mmol /L浓度下其表达量远远高于对照［18］。
在前期工作基础上研究了高盐胁迫处理下甘菊叶片
中 BADH基因和甜菜碱含量随胁迫处理时间的变
化趋势，同时对高盐处理下甘菊叶片中 BADH 基因
表达与甜菜碱含量间的关系进行了讨论。
1 材料与方法
1. 1 试验材料
本研究所用甘菊为组培苗，当株高长到 2 －
3 cm，根长约 1 cm 时从组培瓶中移栽至 5 × 10 孔穴
盘中，基质为蛭石。甘菊幼苗在穴盘中生长 40 d 后，
每 4棵一盆移至直径为 15 cm的花盆中，此时基质为
泥炭∶蛭石∶珍珠岩 =2∶ 2∶ 1。待甘菊恢复生长10 d之
后，甘菊苗长至 15 － 20 cm 高时即可进行胁迫处理。
甘菊生长于温室中，温度为(23 ±1)℃，光照时间 14 h。
胁迫处理盐浓度为 400 mmol /L，处理时间分别为
0、0. 5 h、2 h、12 h、1 d、2 d、4 d、6 d、8 d、10 d 、12 d。采
收各处理甘菊叶片，液氮中速冻，超低温冰箱中保存
备用。
1. 2 主要试剂及仪器
离心机(Bifuge stratos. D-37520 Osterode，德国) ;
双光束紫外可见分光光度计(TU-1901 型，北京普析
通用仪器有限责任公司) ;恒温磁力搅拌器(79-3 型，
上海司乐仪器有限公司) ;摇床(HY-6 双层调速多用
振荡器，江苏省金坛市荣华仪器制造有限公司) ;实时
荧光定量 PCR 仪(ABI Step One Plus 型) ;针孔过滤
器，注射器购自北京拜尔迪公司;漏斗。
甜菜碱标准品购自 Sigma公司;雷氏盐，丙酮，乙
醚购自国药集团化学试剂有限公司;SYBR GreenⅠ染
料购自 ABI公司;引物由上海生工合成。
1. 3 试验方法
1. 3. 1 甘菊叶片总 RNA 的提取 采用改良 Trizol
法提取甘菊叶片总 RNA［19］。
1. 3. 2 逆转录合成 cDNA第一链 按照 Promega 公
司的M-MLV反转录酶说明书进行 cDNA第一链合成。
1. 3. 3 实时荧光定量 PCR 根据实时荧光定量
PCR引物设计要求，以及甘菊 BADH 基因和 Actin
基因序列各设计两对引物，其序列分别为:
BAF1:5′-CACTATTTGGTTGCTTCTGGAC-3′
BAR1:5′-CCTTCACTTCTGGCTGTTTCA-3′
BAF2:5′-TGAAACAGCCAGAAGTGAAGG-3′
BAR2:5′-TACAGCAGAACCCAAGCCA-3′
ACF1:5′-CATTGAGCACGGTATTGTCA-3′
ACR1:5′-CCACTGGCATAAAGAGAAAGC-3′
ACF2:5′-GGTTCTCTTCCAGCCATCTT-3′
ACR2:5′-CGGTGATTTCCTTGCTCAT-3′
反应体系(20 μL) :反转录产物 2 μL，引物
(10 μmol /L)各 0. 3 μL，SYBR Green Ⅰ 10 μL，
ddH2O 7. 4 μL。反应程序:95℃预变性 10 min，95℃
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2010 年第 6 期 曹华雯等:盐胁迫下甘菊叶片中 BADH基因表达及甜菜碱含量的变化
变性 15 s，60℃退火 1 min，40 个循环。
1. 3. 4 甘菊叶片甜菜碱含量测定 利用雷氏盐紫外
分光光度计法测定各处理甘菊叶片中甜菜碱含量［20］。
1. 3. 5 甘菊叶片叶绿素含量测定 采用丙酮法测
定各处理甘菊叶片中总叶绿素含量［21］。
2 结果与分析
2. 1 NaCl处理对甘菊植株生长的影响
在 400 mmol /L的高盐浓度处理下，甘菊植株表
现了较强的抗逆性。如图 1所示在处理的初期即 0. 5
h时，由于突然接受到很高浓度的盐处理，因此甘菊
植株叶片出现了萎蔫现象，之后当甘菊植株适应了高
浓度的 NaCl胁迫后逐步恢复了正常生长状态。从 2
h开始至 2 d的处理植株均未表现任何生长异常的现
象。但随着处理时间的进一步增加，在 400 mmol /L
NaCl胁迫处理 4 d后，甘菊植株叶片逐渐出现了失绿
现象，处理 12 d 的甘菊植株表现最为明显。对各处
理甘菊叶片中叶绿素含量进行了测定(图 2) ，试验结
果表明，400 mmol /L NaCl 胁迫处理下甘菊叶片中叶
绿素含量随处理时间的增加逐渐降低。在胁迫处理
的初期 0. 5 h，2 h 和 12 h，叶绿素含量与对照相比略
有降低，从胁迫处理 1 d开始叶绿素含量下降幅度增
大，但此时植株叶片并未表现明显的失绿现象。在胁
迫处理 4 d后叶绿素含量下降较为平缓，但此时叶片
已经表现出了明显的失绿现象。
图 1 400 mmol /L NaCl处理不同时间甘菊植株生长情况变化
图 2 400 mmol /L NaCl处理不同时间
甘菊叶片中叶绿素含量变化
2. 2 Real-time PCR引物筛选
本研究所采用的 real-time PCR 技术为荧光染
料法———SYBR GreenⅠ检测。SYBR GreenⅠ是一
种能结合到 dsDNA 小沟部位的具有绿色激发波长
的染料，它只有与 dsDNA 结合后才会发出荧光，其
荧光强度可以代表扩增产物的数量。此方法检测灵
敏度高。但由于其可以与任何的 dsDNA结合，因此
不能分辨特异性产物、引物二聚体和非特异性产
物［22］。所以 SYBR GreenⅠ法对于引物的设计要求
非常高，符合要求的引物在 PCR扩增时仅可以产生
一条特异性的产物，不能有引物二聚体和非特异性
产物的存在。判断引物设计是否成功可以利用熔点
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生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2010 年第 6 期
曲线分析，当熔点曲线仅有单一峰出现时，说明
PCR扩增仅产生了一条特异性产物［23］。
根据 real-time PCR SYBR GreenⅠ法的要求，利
用 DNAman软件对甘菊 Actin 和 BADH基因分别设
计了两对引物，通过 real-time PCR 熔点曲线分析最
终选取引物对 ACF2 /ACR2 和 BAF1 /BAF2 进行基
因表达的分析(图 3)。
A.引物对 ACF1 /ACR1;B.引物对 ACF2 /ACR2;C.引物对 BAF1 /BAR1;D.引物对 BAF2 /BAR2
图 3 Real-time PCR引物筛选
2. 3 NaCl胁迫处理下甘菊叶片中 BADH 基因表达
变化
本研究利用实时荧光定量 PCR 的方法分析了
不同胁迫处理时间下甘菊叶片中 BADH 基因的表
达情况。由图 4 可以看出，随 400 mmol /L NaCl 胁
迫处理时间的增加，甘菊叶片中 BADH 基因的表达
呈现先上升后下降的趋势。在胁迫处理的初期
BADH 基因表达量的增加并不明显，在胁迫处理
0. 5 h和2 h时 BADH 基因的表达量略低于对照，此
后随处理时间的增加 BADH 基因的表达量逐步增
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2010 年第 6 期 曹华雯等:盐胁迫下甘菊叶片中 BADH基因表达及甜菜碱含量的变化
大，当胁迫处理 6 d 后 BADH 基因的表达量达到了
最高峰，之后其表达量就呈现出了下降的趋势，胁迫
处理 12 d其表达量低于对照。
图 4 Real-time PCR检测 400 mmol /L NaCl
胁迫处理下甘菊叶片中 BADH基因表达变化
2. 4 NaCl 胁迫处理下甘菊叶片中甜菜碱含量的
变化
与 BADH基因的变化趋势相同，随 400 mmol /L
NaCl胁迫处理时间的增加甘菊叶片中甜菜碱的含
量也出现了先上升后下降的变化(图 5)。在胁迫处
理的初期即 0. 5 h时甘菊叶片中合成了大量的甜菜
碱以应对突然出现的胁迫反应，此后甜菜碱的合成
量出现了小幅度的震荡变化，在胁迫处理 4 d 后叶
片中甜菜碱的合成量逐步减少，这与叶片失绿现象
出现的时间一致。
图 5 400 mmol /L NaCl胁迫处理下甘
菊叶片中甜菜碱含量变化
2. 5 甘菊 BADH基因和甜菜碱含量间的变化关系
综合分析盐胁迫下叶片中 BADH 基因表达和
甜菜碱含量变化间的关系发现，两者之间的变化并
不是同步的。由图 4 和图 5 可以看出胁迫处理 0. 5
h时 BADH基因的表达量与对照相比出现了下降，
而此时叶片中甜菜碱在大量的合成，之后在 2 h 时
BADH基因的表达与 0. 5 h 相比略微上升，但此时
甜菜碱的含量相比 0. 5 h 出现了下降，之后在 12 h
时 BADH基因的表达量大量增加，而此时甜菜碱的
含量却大幅下降，甚至低于非胁迫处理下叶片中甜
菜碱的含量。在此后的处理时间下也都遵循这个趋
势，即当 BADH基因表达量增加叶片中的甜菜碱含
量却出现了下降，二者之间存在滞后的现象。
3 讨论
3. 1 BADH基因的表达变化
高等植物中，首先在菠菜中发现 BADH 基因的
mRNA受盐诱导表达［24］。此后，BADH 基因在许多
高等植物中被克隆及研究，如甜菜(Beta vulgar-
isL.)［25］，大麦(Hordeum vulgare L.)［26］，三角叶滨
藜(Atriplex triangularisWarb)［27］，麻疯树(Jatropha
curcas L.)［28］，细叶结缕草(Zoysia tenuifolia)［29］等，
试验结果表明在盐碱、干旱和低温处理下 BADH 基
因的表达水平都有不同程度的提高。本课题组前期
利用 RT-PCR-Southern 方法测定 100、200 和 400
mmol /L NaCl胁迫处理 7 d 甘菊叶片中 BADH 基因
表达活性，结果表明 BADH 基因表达与盐处理浓度
成正相关，400 mmol /L 浓度处理下 BADH 活性最
大［28］。Moghaieb(2004)对两种盐生植物盐角草
(Salicornia europaea)和碱蓬 (Suaeda maritima)的盐
胁迫处理发现在不同浓度 NaCl 胁迫处理 3 周后，
BADH基因的表达活性均随盐浓度的增大而增
加［30］。在海榄雌［31］，大麦和麻疯树的研究中也得
到了相同的结果，同时研究还表明叶片中 BADH 基
因表达活性及胁迫处理下的变化量均高于根中的表
达量。
前人的研究主要关注 BADH 基因与盐胁迫处
理浓度间的相互关系［30，31］，对于不同处理时间下
BADH基因的表达变化研究少，因此本研究在前期
工作基础上选取 400 mmol /L NaCl浓度胁迫处理甘
菊植株。Tasuku(2009)对大麦 BADH基因 BBD1 和
BBD2 的研究表明，200 mmol /L NaCl胁迫处理 0，2，
6，24，72 h。BBD1 基因在胁迫处理 24 h 才有表达，
72 h其表达量低于 24 h。BBD2 基因在胁迫处理 2h
有微弱的表达，其表达量最大值与 BBD1 基因一致
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生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2010 年第 6 期
均出现在 24 h，此后表达量降低。本研究中甘菊叶
片 BADH基因表达量在胁迫处理 2 h 后活性显著增
加，此后 BADH mRNA活性震荡上升，在胁迫处理 6
d时达到了最大值。由此可以看出甘菊 BADH基因
对盐胁迫响应敏感性及持续性均高于大麦。
前人的研究表明 BADH mRNA 在菠菜［32］，甜
菜［25］，大麦［33］，高粱［34］和水稻［35］中需要较长的胁
迫处理时间其表达量才会有明显的变化，Legraia
(1998)对苋菜(Amaranthus hypochondriacus)的研究
结果表明在水分缺失 2 h 后 BADH 基因大量表
达［36］，作者认为苋菜是在已研究的所有植物中响应
渗透胁迫表达 BADH基因最为快速的植物。由图 4
可以看出，甘菊叶片中的 BADH基因在 NaCl 处理 2
h后其表达量即有明显的增加，同时在干旱处理 0. 5
h甘菊 BADH 基因表达量为对照的 1. 5 倍(数据未
列出)。因此本研究结果表明甘菊中 BADH 基因的
表达响应在已研究的植物中是最为迅速的。
3. 2 甜菜碱含量的变化
甜菜碱是植物体细胞内的一种无毒渗透调节
剂，定位于细胞质中，在逆境(干旱 / 盐碱)条件下
大量合成和积累，通过渗透调节作用以平衡液泡与
细胞质、细胞与环境的渗透势差，使细胞免受胁迫伤
害，而且植物抗性强的表现为甜菜碱合成和积累多，
因而渗透调节能力强。干旱和盐碱胁迫能诱导植物
体内甜菜碱的积累和 BADH 基因活性的显著增加，
并且二者间的变化具有相关性［37 － 39］。Yamada［40］研
究了 300 mmol /L NaCl胁迫处理 5 d和 15 d甜菜各
器官中甜菜碱含量的变化，结果表明虽然甜菜碱在
甜菜的各器官中表达量不同，但随处理时间的增加
其含量均明显增大，在处理 15 d 时，各器官中的甜
菜碱含量均达到最大值。本研究中甘菊叶片甜菜碱
含量在处理 4 d 后即达到最大值，此后虽然 BADH
基因表达量仍然增加，但甜菜碱含量却大幅度降低。
在双子叶植物的甜菜碱合成途径中，首先胆碱被输
入叶绿体中［41，42］，此后在 CMO 和 BADH 的催化下
生成甜菜碱。对菠菜和甜菜的研究结果也表明甜菜
碱的是在叶绿体内合成的，并且 BADH 基因的 cD-
NA是在叶绿体中翻译为氨基酸序列的［7，32，43］。本
研究中甘菊在 400 mmol /L NaCl 胁迫处理 4 d 叶片
中叶绿素含量明显降低，叶片出现失绿现象，推测认
为长时间的高盐处理使得甘菊叶片中叶绿体含量降
低。因此，虽然 BADH 基因表达量仍在增加，但是
甜菜碱合成量却出现了下降。
3. 3 二者间的相互作用
Cui［44］对羊草(Leymus chinensis)的研究结果表
明，在 Na +浓度为 18. 75 － 400 mmol，pH7. 8 － 10. 1
的盐碱胁迫下，羊草中甜菜碱含量与 BADH 基因表
达活性随处理浓度和处理时间的增加逐渐增大，在
处理 5 d后 BADH基因活性与甜菜碱含量均达到了
最大值。在对植物甜菜碱合成途径的研究中也表明
BADH基因表达量的增加可以增大甜菜碱的积累，
这与本研究结果相同。但甘菊叶片中 BADH 基因
的表达与甜菜碱含量变化在时间上不具有一致性，
在相同的处理时间下，BADH 基因活性增大而甜菜
碱含量却出现了降低。在大麦的研究中也得到了相
似的结果，200 mmol /L NaCl 胁迫处理大麦叶片时，
BADH基因表达在 24 h 达到最大值，72 h BADH 蛋
白活性才检测到最大值［26］，结果说明大麦中 BADH
基因与其蛋白活性表达间也存在非同步性。由此推
测甘菊中甜菜碱的合成过程存在反馈机制，当叶片
中甜菜碱含量增加时，就抑制了 BADH 基因的表
达，而随着胁迫时间的增加，叶片中的甜菜碱含量逐
渐减少，解除了对 BADH 基因的抑制，因此 BADH
基因的表达量就出现了增大，此过程往复进行，直到
二者间达到了一个动态的平衡。这一现象也与
BADH基因产物甜菜碱醛脱氢酶为甜菜碱合成过程
中的限速酶的研究结果相一致。
目前 BADH 基因是盐碱和干旱基因工程中研
究较多也较为清楚地基因之一。利用转基因工程将
外源 BADH基因导入玉米［45 － 47］，水稻［48］和番茄［49］
中，增加了其对干旱，盐碱和低温的胁迫抗性。本研
究对于甘菊中 BADH 基因在渗透胁迫下表达变化
的研究为在该植物中寻找有效地胁迫诱导启动子和
对环境胁迫相应机制的研究都是非常重要的。
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