全 文 ：·研究报告·
生物技术通报
B IO TECHNOLOGY　BULL ETIN 2009年第 7期
农杆菌质粒 DNA的间接酶切鉴定
马滋蔓 1 　王文治 1 　杨本鹏 1 　张树珍 1 　杨志坚 2
(1 中国热带农业科学院热带作物生物技术国家重点实验室 ,海口 571101; 2 福建农林大学 ,福州 350002)
　　摘 　要 : 　采用常规手段提酶切鉴定法 ,与普通大肠杆菌质粒小量抽提试剂盒提取农杆菌质粒酶切鉴定法 (简称试剂盒
法 )和农杆菌质粒反导大肠杆菌间接酶切鉴定法 (简称间接法 )进行对比 ,发现本试验创新的试剂盒法和间接法可轻松做酶切
鉴定 ,可为农杆菌质粒 DNA提取经验不足者参考。
关键词 : 　农杆菌 　质粒 DNA　试剂盒法 　间接法 　酶切鉴定
Indirect Restr iction Endonuclease Testing of Plasm id DNA from
Agrobacterium tum efaciens
Ma Ziman1 　W ang W enzhi1 　Yang Benpeng1 　Zhang Shuzhen1 　Yang Zhijian2
(1 Institue of Tropical B iotechnology, Chinese Academ y of Tropical Agricultural Sciences, Haikou 571101;
2 Fujian Agriculture and Forestry University, Fuzhou 350002)
　　Abs trac t: 　Routine method of p lasm id DNA isolation from A grobacterium tum efaciens was alkaline lysis and phenol2chloroform
method, but its p roduction is low and not purity enough. It is available for PCR testing, but usually difficult for restriction endonuclease
testing. Routine method with kit method and indirect method was compared, and it was finding that the later two methods were good e2
nough for restriction endonuclease testing.
Key wo rds: 　A grobacterium tum efaciens　Plasm id DNA　Kit method　 Indirect method　Restriction endonuclease testing
收稿日期 : 2009202227
基金项目 :现代农业产业技术体系建设专项资金 ,国家自然科学基金 (30560081) ,中央级公益性科研院所基本科研业务费
作者简介 :马滋蔓 (19832) ,女 ,云南昆明人 ,硕士研究生 ,研究方向 :植物基因工程
通讯作者 :杨本鹏 , y_bp@163. com
　　农杆菌质粒 DNA的提取进行酶切鉴定是分子
生物学研究中的一项常规技术 ,然较之与大肠杆
菌质粒 DNA 的提取并进行酶切鉴定有一定的难
度。经验不足者采用常规手提法提取农杆菌质粒
DNA ,产率较低 ,纯度不高 ,常带有影响酶切鉴定
的大量蛋白质和盐等污染物 ,无法酶切鉴定 ,常常
因此小步骤而影响实验进展 [ 1～3 ] 。针对此不足 ,
本试验采用大肠杆菌质粒小量抽提试剂盒提取农
杆菌质粒酶切法及农杆菌质粒反导大肠杆菌间接
酶切鉴定法 ,发现这两种方法可轻松应用于质粒
DNA导入农杆菌的酶切鉴定。大肠杆菌质粒抽提
试剂盒一般用于大肠杆菌质粒的提取 ,少见有人
将其拿来应用于农杆菌质粒的提取 ,然此法所提
质粒 DNA纯度够高 ,容易酶切鉴定。农杆菌质粒
反导大肠杆菌间接酶切鉴定法则是将手提法 (或
试剂盒法的 )提取的农杆菌质粒通过冷冻法反导
入大肠杆菌扩增 ,然后提取大肠杆菌质粒 (手提法
或试剂盒法可轻松提取大肠杆菌质粒 DNA进行酶
切鉴定 )进行间接酶切鉴定。
1　材料和方法
111　材料
11111　菌珠和质粒 　农杆菌 EHA105,大肠杆菌
DH5α,质粒表达载体 PYW ,均为本实验室保存。
11112　主要试剂 　 STE 溶液 , TE Buffer, Solution
Ⅰ, SolutionⅡ, SolutionⅢ,均按王关林《基因工程原
理与技术 》书上说明配制 [ 4 ] , H indⅢ、EcoRⅠ及质粒
DNA小量纯化试剂盒等购自宝生物工程 (大连 )有
限公司。
11113　主要仪器 　离心机 ,电泳仪 ,干浴锅。
生物技术通报 B iotechnology　B u lle tin 2009年第 7期
11114　培养基 LB、YEP培养基均按王关林《基因
工程原理与技术 》书上说明配制 [ 4 ]。
112　方法
11211　PYW质粒转化到感受态 EHA105中 　根据
王关林《基因工程原理与技术 》上冻融法制备农杆
菌 EHA105感受态 [ 4 ]。向农杆菌 200μl的 EHA105
感受态细胞中加人 1 μg左右的纯化 PYW 质粒
DNA ,混匀 ,冰上放置 5 m in。置于液氮速冻 5 m in,
立即 37℃水浴热激 5 m in,加入 800μl YEP液体培
养基 , 28℃, < 200 r/m in,培养 2～3 h。10 000 r/
m in, 1 m in,吸去 800μl上清 ,剩余 200μl菌液重悬
菌体 ,把菌液涂布于 YEP三抗固体培养基上 , 28℃
放置培养 48 h。
11212　常规法提取 EHA105中 PYW 质粒 　挑取
1. 2. 1中所长单菌落于 YEP三抗液体培养基中培养
36 h左右。根据王关林 [ 4 ]常规法提取 EHA105中的
PYW质粒。
11213　试剂盒法提取 EHA105中 PYW质粒 　挑取
1. 2. 1中所长单菌落于 YEP三抗液体培养基中培养
36 h左右。按照质粒 DNA小量纯化试剂盒说明书
步骤提取 EHA105中的 PYW质粒。
11214　间接法提取 PYW 质粒 　根据关林《基因工
程原理与技术 》制备大肠杆菌 DH5α感受态 [ 4 ]。取
2μl常规法所提 PYW 质粒 ,加入 100μl大肠杆菌
感受态细胞中 ,轻弹管壁混匀 ,冰浴 30 m in。42℃热
休克 90 s,迅速转入冰浴 1～2 m in。加入 1 m lLB培
养基 ,混匀 , 37℃, 250 r/m in,培养 1 h。4℃ 10 000
r/m in离心 30 s,吸弃部分上清 ,重悬剩余菌液 ,吸
200μl左右涂板。37℃培养 12～16 h,长出单菌落。
挑取所长 DH5α单菌落 , 37℃摇菌过夜。按照质粒
DNA小量纯化试剂盒说明书步骤提取 DH5α中的
PYW质粒。
1. 2. 5酶切 1. 2. 2、1. 2. 3、1. 2. 4所得 PYW 质粒 　将
1. 2. 2常规法所得 PYW质粒用 HindⅢ、EcoRⅠ双酶切 ,
20μl体系 : EcoRⅠ1μl, HindⅢ 1μl, Buffer 2μl, PYW
质粒 16μl。因常规法所提 PYW质粒效率低 ,故将酶
切底物 PYW加到最大 16μl,而不补水。将 1. 2. 3试
剂盒法与 1. 2. 4间接法所得 PYW质粒进行同等条件
的酶切对比 , 20 μl体系 : EcoRⅠ1μl, H indⅢ 1 μl,
Buffer 2μl, PYW质粒 10μl, ddH2O 6μl。
2　结果和分析
211　3种方法所提质粒的电泳检测结果
将常规法、试剂盒法、间接法所得质粒分别进行
电泳检测 (图 1)。1～6别展示了 3种方法所得质
粒的质量 , 1、2为常规法所得质粒 ,说明常规法所提
质粒效率很低 ,且纯度差 ; 3、4为试剂盒法所得质
粒 ,说明试剂盒法所得质粒效率一般 ,纯度较好 ; 5、6
为间接法所得质粒 ,说明间接法所得质粒效率最高 ,
纯度最好。
图 1　3种方法所得质粒凝胶电泳
212　3种方法所得质粒酶切结果
图 2为 PYW质粒图 ,此载体在 H indⅢ和 EcoR I
双酶切下 ,可切出 8条不同大小的片段 ,大小分别为
6 396 bp, 2 163 bp, 1 996 bp, 943 bp, 845 bp , 755
bp, 670 bp, 112 bp。为展示酶切效果 ,故而选择
H indⅢ和 EcoRⅠ双酶多条带酶切。
图 2　PYW 质粒图
图 3为常规法所提质粒的酶切效果图 ,因常规
法所提质粒纯度不够 ,效率很低 ,因此很难得到良好
的酶切效果 ,容易出现酶切不完全 ,或酶切目的条带
较暗的现象。
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2009年第 7期 马滋蔓等 :农杆菌质粒 DNA的间接酶切鉴定
图 4泳道 2～5为间接法所得质粒酶切鉴定效
果 ,即将所提转化后待鉴定的农杆菌菌株质粒反导
回大肠杆菌 ,再用试剂盒法提取大肠杆菌质粒 ,然后
再进行间接的酶切鉴定 ; 6～9为试剂盒法所得质粒
酶切效果 ,即直接用大肠杆菌质粒小量抽提试剂盒
提取转化后待鉴定的农杆菌菌株质粒进行酶切鉴
定 ; CK为大肠杆菌质粒小量抽提试剂盒提取转化
前保存于大肠杆菌的 PYW 质粒酶切效果。相对于
图 3的常规法所得质粒酶切效果来说 ,因其提取效
率和纯度都很高 ,所以间接法所得质粒酶切效果极
佳 ,酶切条带从大到小 6 396 bp, 2 163 bp, 1 996 bp,
943 bp, 845 bp, 755 bp , 670 bp, 112 bp,仅最小的
112 bp看不见 ,其它条带清晰明亮 ,而试剂盒法所
得质粒酶切效果一般 ,主要因大肠杆菌质粒小量抽
提试剂盒提取大肠杆菌质粒的效率不是很高 ,但比
起常规法 ,效果好很多。
3　讨论
农杆菌质粒的提取并进行酶切鉴定相对于大肠
图 3　常规法所提质粒酶切图
图 4　间接法与试剂盒法所得质粒酶切图
杆菌质粒的提取与酶切鉴定有一定难度。根据本实
验结果 ,如需对转化的农杆菌质粒进行精确的酶切
鉴定 ,可先用常规法提取农杆菌质粒 ,再将其反导回
大肠杆菌 ,然后提取大肠杆菌质粒进行间接酶切鉴
定。只要大肠杆菌所得质粒的酶切结果与正对照一
致 ,即可间接的证明质粒载体转化农杆菌的成功。
如不必要对转化过的农杆菌菌株质粒进行多条带的
精确的酶切鉴定 ,可直接采取试剂盒法进行酶切鉴
定。间接法相对于通常采用的直接手提转化过的待
鉴定的农杆菌质粒进行酶切鉴定的方法在操作时间
上 ,额外增加一步大肠杆菌的转化 ,所耗时间仅为
12 h左右 ,然而却可以得到效果极佳的酶切图片 ,
因此此间接酶切鉴定法值得参考。
参 考 文 献
1　陈章良 ,植物基因工程研究 [M ]. 北京 :北京大学出版社 , 1992.
2　萨姆布鲁克 J,北京分子克隆实验指南 (第 3版 ) [M ]. 北京 :科
学出版社 , 2002.
3　单世华 ,李春娟. 生物技术 , 2003, (4) : 19～20.
4　王关林 ,植物基因工程原理与技术 [M ].北京 :科学出版社 , 2002.
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