全 文 ：
研究报告

生物技术通报
BIOTECHNOLOGY
BULLETIN 2010年第 11期
pEGFP
C2 /LAT
ORF3真核表达载体的
构建及其在 Vero细胞中的表达
薛礼长 1 杨慧兰 2
( 1华南理工大学生物科学与工程学院,广州 510006; 2中国人民解放军广州军区广州总医院皮肤科,广州 510010 )


摘
要:
克隆单纯疱疹病毒
型 ( herpes sim plex v irus
, H SV
2)潜伏相关转录体 ( la tency asso ciated transc ript, LAT )第 3
个开放阅读框 ( open read ing fram e 3, ORF3)的 DNA序列, 构建 pEGFP
C2 /LAT
ORF3真核表达载体,并观察其在非洲绿猴肾细
胞 ( Vero)中的表达, 为进一步研究 LAT基因及 ORF3的生物学功能奠定基础。用 HSV
2 333株感染 Vero细胞, 从 Vero细胞培
养液中收集 H SV
2并提取 HSV
2基因组。以 H SV
2基因组为模板, PCR扩增得到 HSV
2 LAT ORF3 DAN片段。将 ORF3片
段连接到 pEGFP
C2质粒上, 用卡那霉毒筛选阳性克隆, 经菌落 PCR,双酶切及测序验证 pEGFP
C2 /LAT
ORF3真核表达载体
构建成功。用 Xfect转染试剂将重组载体转染入 Vero细胞,倒置荧光显微镜观察其在 V ero细胞中的表达。双酶切及测序结
果验证 ORF3片段正确插入 pEGFP
C2质粒,荧光显微镜观察到融合蛋白在转染的 Vero细胞中的表达。成功构建 pEGFP
C2 /
LAT
ORF3真核表达载体, 该重组质粒能在 Vero细胞中成功表达。
关键词:
单纯疱疹病毒
型 pEGFP
C2质粒 LAT ORF3 真核表达载体 Vero细胞
Construction and Identification of Eukaryotic Expression Plasm id
pEGFP
C2 /LAT
ORF3 and Its Expression in Vero Cells
Xue L izhang
1
YangHu ilan
2
(
1
School of Biological Science and Engineering, South China University of Technology, Guangzhou 510006;
2
D epar tment of D ermatology, Guangzhou LiuhuaqiaoH osp ital, Guangzhou 510010)


Abstrac:t
The study w as to construct the eukaryo tic expression p lasm id contain ing the open reading fram e( ORF ) 3 o f the herpes
simp lex v irus 2( HSV
2) la tency asso ciated transcr ipt( LAT ) gene, and de tect its expression in Vero ce lls in order to lay a founda tion fo r
further research on the b io log ical function o f LAT gene and ORF3. The Vero cellsw ere infected w ith H SV
2 333 strain, and HSV
2 ge

nom e w as ex tracted from HSV
2 which w ere co llected from cell cu lture flu id. TheH SV
2 LAT ORF3 gene fragm en t was am plified by
PCR, and the am plified productsw ere inse rted into pEGFP
C2 to conduct a recomb inant plasm id wh ich w as se lected by kanam yc in, then
sequenced and identified by restrictive endonuc lease digestion. The construc ted recomb inant plasm id w as fina lly transfected into Vero
ce lls w ith X fect transfec tion reagent and the expression of ORF3 w as observed by inverted fluorescence m icro scope. Resu lts show ed that
the successful construc tion o f the recomb inant plasm id pEGFP
C2/LAT
ORF3 w as verified by restrictive endonuc lease assay and se

quence ana ly sis w ith LAT ORF3. The expression o f fussion prote in in Vero ce llsw as observed by fluo rescencem icroscope. The eukaryot

ic express ion p lasm id fo rLAT ORF3 was successfu lly constructed and its expression in V ero ce lls w as confirm ed.
Key words:
H erpes s imp lex v irus
pEGFP
C2 plasm id LAT ORF3 Euka ryotic expressing vecto r Vero ce lls
收稿日期: 2010
04
14
基金项目:国家自然科学基金资助项目 ( 30972666) ,全军医学科学技术研究
十一五
计划资助项目 ( 06J008)
作者简介:薛礼长,男,在读硕士,研究方向:分子生物学; E
m ai:l xu e
l i
zh ang@ 163. com
通讯作者:杨慧兰,教授, E
m ai:l hu ilany@ m edm ai.l com
单纯疱疹病毒
型 ( herpes simplex v irus type 2,
HSV
2)是一种常见的人类病毒性疾病病原体, 主要
引起生殖器疱疹,也可引起新生儿感染,偶见于口腔
病变 [ 1]。HSV
2可以在人的骶尾神经节内建立终
生潜伏,并可伴随各种非特异性刺激而活化,从而导
致相关临床症状的复发。HSV
2的这种嗜神经潜伏
生物技术通报 B iotechnology
Bulletin 2010年第 11期
性使得 HSV
2感染难以治愈。
潜伏相关转录体 ( LAT )是 HSV
2在潜伏感染
期间惟一大量表达并可被检测到的基因组转录产
物 [ 2]。很多学者认为 LAT在 HSV
2潜伏的建立、
维持和再激活过程中起重要的作用。 LAT已经被
公认为是 H SV
2处于潜伏状态的一个标志。已有
的研究结果表明 H SV LAT ORF可能编码蛋白质,
且这些蛋白有一定的生物学功能, 能对 HSV的潜
伏感染起调节作用 [ 3- 10]。HSV
2 LAT含有 3个开
放阅读框, 分别为 ORF1、ORF2和 ORF3[ 11]。本研
究旨在构建含有 H SV
2 LAT ORF3的 pEGFP
C2 /
LAT
ORF3真核表达载体, 并在 V ero细胞中瞬时
表达成功, 为进一步研究 ORF3及 LAT在 H SV
2
潜伏的建立、维持和再激活过程中的重要生物学
作用奠定基础。
1
材料和方法
1
1
材料
质粒 pEGFP
C2, HSV
2 333标准株, V ero细胞
由本实验室保存; 大肠杆菌 TOP10感受态细胞由
本实验室用 CaC l2法制备。病毒 DNA提取试剂
盒, 质粒 DNA小量纯化试剂盒, DNA回收试剂盒,
T4DNA连接酶, DNA marker, dNTP购自 TaKaRa;
RPM I
1640细胞培养基, 胎牛血清购自 H yC lone;
高保真 DNA聚合酶, 无内毒素质粒中提试剂盒购
自 Inv itrogen; 限制性内切酶 E coR I, Kpn I购自
NEB;胰酶购自 G iboc; X fect转染试剂盒购自 C lon

tech;卡那霉素购自 MD; 链霉素, 青霉素由广州军
区总医院医学实验科提供; 荧光倒置显微镜为 O

lympus公司产品。
1
2
方法
1
2
1
HSV
2 333株基因组的提取 用含 10%胎
牛血清的 RPM I
1640培养基 37
, 5% CO 2条件下
在培养箱中培养 V ero细胞, 注意换液以保证细胞良
好长势,等培养瓶底部大部分被细胞铺满时, 将培
养液全部倒出, 向培养瓶中加入 HSV
2 333株, 使
病毒在细胞表面吸附几分钟, 再向培养瓶中加入
新鲜的培养液继续培养。当观察到细胞发生明显
病变时,收集细胞上清液, 用于提取病毒基因组。
在提取基因组前反复剧烈震荡, 让病毒从细胞中
释放出来。使用病毒 DNA提取试剂盒提取 H SV
2
333株的基因组, 并用琼脂糖凝胶电泳检测提取是
否成功。
1
2
2
LAT ORF3片段的 PCR扩增 根据 GenBank
上的 HSV
2 333株 LAT ORF3序列,用 Primer Prem ier
5
0设计 PCR引物并添加酶切位点和保护碱基如下。
上游引物: CCGGAATTCATGCTGGTGTGTGTTGCTGT

TCGG,下划线为 E coR I酶切位点; 下游引物为
CGGGGTACCACAAGACGGTCACGGGGGACTGCCT,
下划线为Kpn I酶切位点。以提取的 HSV
2 333株基
因组为模板,进行 PCR反应。反应体系如下: 10
pfx
扩增缓冲液 5
L, 10mmo l/L dNTP混合液 1
L, 50
mmol /LM gSO4 1
L,上游引物 ( 10
mo l/L ) 1
L,下
游引物 ( 10
mol/L ) 1
L, 模板 2
L, pfx DNA聚合
酶 0
6
L, 10
PCRx加强缓冲液 10
L,补灭菌蒸
馏水至 50
L, 瞬时离心混匀。 PCR反应条件为
94
2 m in; 94
15 s, 55
30 s, 68
45 s, 35个循
环; 72
7 m in。反应完毕后 0
8%琼脂糖凝胶电
泳, 切胶回收目的片段, 具体回收步骤参照 T aK aRa
胶回收试剂盒说明书。
1
2
3
pEGFP
C2质粒和 ORF3片段双酶切及酶切
产物回收 将回收纯化的目的片段和提取的 pEG

FP
C2质粒用限制性内切酶 E coR I和 Kpn I分别双
酶切,并回收酶切产物。双酶切反应体系如下: 10

NEB缓冲液 15
L, pEGFP
C2质粒 10
L( ORF3片
段 8
L), 100
BSA 0
5
L, E coR I 1
L和 Kpn I
1
L,补灭菌蒸馏水至 50
L, 37
水浴过夜。反应
完毕后 0
8%琼脂糖凝胶电泳,切胶, 分别回收线性
载体和 ORF3片段,具体回收步骤参照 TaKaR a胶回
收试剂盒说明书。
1
2
4
ORF3片段与 pEGFP
C2质粒的连接及转化

ORF3片段与 pEGFP
C2质粒连接反应体系如下:
ORF3片段酶切回收产物 11
L, pEGFP
C2质粒酶
切回收产物 4
L, T4 DNA连接酶 1
L, T4DNA连
接酶 Buffer 2
L, 补灭菌蒸馏水至 20
L, 瞬时离
心后放入 PCR仪中 16
连接过夜。连接产物转
化至预先用 CaC l2法制备的大肠杆菌 TOP10感受
态细胞中, 均匀涂布于含 60
g /mL卡那霉素的
LB固体培养基上,静置 1 h,再倒置培养 16- 24 h。
1
2
5
重组质粒提取和鉴定
1
2
5
1
菌落 PCR鉴定 将含卡那霉素的 LB固
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2010年第 11期



薛礼长等: pEGFP
C2/LAT
ORF3真核表达载体的构建及其在 Vero细胞中的表达
体培养基上长出的阳性克隆菌落编号, 再挑取这些
阳性菌落, 进行菌落 PCR。除模板外, PCR反应体
系和反应条件及循环参数与扩增 ORF3片段相同。
以 HSV
2基因组为模板做阳性对照。用 0
8%琼脂
糖凝胶电泳检测目标条带。
1
2
5
2重组质粒 PCR鉴定 挑去电泳中和阳性对
照有一致条带出现的阳性菌落,用质粒提取试剂盒提
取重组质粒。用提取的重组质粒作为模板, 进行重组
质粒 PCR。除模板外, PCR反应体系和反应条件及循
环参数与扩增 ORF3片段相同。以 HSV
2基因组为
模板做阳性对照,以 pEGFP
C2质粒为模板做阴性对
照。用 0
8%琼脂糖凝胶电泳检测目标条带。
1
2
5
3
重组质粒的双酶切及测序鉴定 选取只
能扩增出与阳性对照有一致条带的重组质粒, 进行
E coR I和 Kpn I双酶切。酶切体系和 pEGFP
C2质
粒双酶切相同,酶切条件为 37
水浴 4 h。酶切产
物用用 0
8%琼脂糖凝胶电泳检测。将同一阳性克
隆的菌液送至华大基因用 pEGFP
C2质粒的通用引
物测通。
1
2
5
4
V ero细胞的培养和重组质粒的转染 用
含 10%胎牛血清的 RPM I
1640培养基 37
, 5%
CO2条件下培养 Vero细胞。待 V ero细胞贴壁后,根
据培养液的颜色变化,更换新的培养液。当细胞完
全贴壁后,用胰蛋白酶消化细胞, 接种于 6孔板,继
续培养。当 6孔板中的细胞铺满整个孔的 90%左
右时, 按照 C lontech的 X fect转染试剂盒操作步骤转
染重组质粒。转染级别的重组质粒 pEGFP
C2 /LAT

ORF3,使用 Inv itrogen无内毒素质粒中提试剂盒提
取。向六孔板中加入双抗溶液,终浓度为 100 U /mL,
以防染菌。
1
2
5
5
重组质粒在 Vero细胞中表达的检测 瞬
时转染 48 h后用 O lympus荧光倒置显微镜观察融
合蛋白表达情况。
2
结果
2
1
目的片段的扩增
以提取的 HSV
2 333株基因组为模板,扩增出
的条带和目标条带大小 (加酶切位点和保护碱基共
559 bp)一致 (图 1)。
1, 2. LAT ORF3片段的 PCR产物; M. M ak er DL2000
图 1
目的片段 LAT ORF3的 PCR产物
2
2
重组质粒 pEGFP
C2 /LAT
ORF3的 PCR鉴定
选取的阳性克隆提取的重组质粒经 PCR扩增
出 559 bp的片段且与阳性对照获得的片段一致, 而
阴性对照则没有目标片段出现。试验结果 (图 2)和
预期的一致。
M 1. DL15000 M arker; 1. pEGFP
C2质粒; 2. pEGFP
C2 /LAT

ORF3重组质粒; 3. pEGFP
C2质粒 PCR产物; 4. pEGFP
C2 /
LAT
ORF3重组质粒 PCR产物; 5. H SV
2 333株基因组 PCR;
6. pEGFP
C2 /LAT
ORF3重组质粒双酶切; M 2. DL2000M ark er
图 2
重组质粒的 PCR鉴定及双酶切鉴定
2
3
重组质粒 pEGFP
C2 /LAT
ORF3的酶切和测
序鉴定
重组质粒在电泳图上明显表现为比质粒 pEG

FP
C2长度要大。重组质粒经限制性内切酶 E coR I
和 Kpn I双酶切, 可以获得大小约 550 bp和 4
7 kb
的条带 (图 2)。说明目的片段已经成功插入真核表
达载体 pEGFP
C2。将华大基因序列结果与 Gen

Bank中的 HSV
2 333株 LAT ORF3序列比较, 完全
一致, 表明重组质粒 pEGFP
C2 /LAT
ORF3构建
成功。
2
4
重组质粒 pEGFP
C2 /LAT
ORF3在 V ero细胞
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生物技术通报 B iotechnology
Bulletin 2010年第 11期
中的表达
转染 48 h后, 用荧光倒置显微镜观察重组质粒
在 V ero细胞中的表达情况, 发现 EGFP
LAT /ORF3
融合绿色荧光蛋白在部分 Vero细胞的细胞质和细
胞核中均有表达,表现为强绿色荧光 (图 3) ,表明重
组质粒 pEGFP
C2 /LAT
ORF3 可在 V ero 细胞中
表达。

图 3
转染 48 h后重组质粒 pEGFP
C2 /LAT


ORF3在 V ero细胞中的表达情况
3
讨论
HSV
2的嗜神经性使其能在人体内潜伏感染,
反复发作,难以治愈, 给患者带来沉重的身心痛苦。
这种易潜伏感染是 HSV
2感染难以治愈的难题所
在。临床上主要运用抗病毒药物治疗 HSV
2感染,
但不能从根本上治愈 HSV
2感染 [ 12]。同时, HSV
2
抗药性的不断增强又给预防和治疗 HSV
2感染带
来了新的难题 [ 13]。 LAT的发现给研究者们揭开
HSV
2潜伏感染的神秘面纱提供了新的契机。众多
的研究结果证明 LAT 对 HSV的潜伏激活至关重
要,但学术界对 LAT在潜伏期间的作用机制仍有争
议 [ 14]。大部分学者认为 LAT具有反义 RNA分子机
制,通过下调立即早期蛋白 ICP0的表达, 从而使病
毒处于潜伏感染状态 [ 15]。也有学者认为 LAT ORF
编码了与 ICP0有相似功能的蛋白,这个蛋白以级联
调控的方式调节早期基因和晚期基因的有序表达及
复制, 从而激活潜伏的病毒,且这种蛋白瞬时表达后
即发挥作用,存在时间很短,难以检测 [ 3- 5]。已有研
究表明 HSV
2 LAT含有 3个开放阅读框, ORF1与
ORF2在序列上有重叠,而 ORF3则是一个独立的开
放阅读框 [ 11] , 所以本试验选用 ORF3为研究对象,
构建真核表达载体。
该试验采用的 pEGFP
C2真核表达载体易转染
细胞, 可在真核细胞中高效表达,且其上连有可以表
达绿色荧光蛋白的报告基因 EGFP。绿色荧光蛋白
检测方便、荧光稳定、对宿主细胞无任何毒害且不影
响目的蛋白的生物活性 [ 16]。本研究从 HSV
2 333
株中克隆到 LAT基因 ORF3序列, 并将其连接到真
核表达载体 pEGFP
C2上。 DNA 测序结果证明
ORF3序列已经成功插入到 pEGFP
C2质粒的多克
隆位点,并能和载体上的报告基因 EGFP共同表达
融合蛋白。在 Xfect的作用下, 重组质粒转染 Vero
细胞,并在倒置荧光显微镜下观察到了融合蛋白的
表达。本试验选用的真核表达载体 pEGFP
C2具有
报告基因 EGFP和 neo抗性基因, 可以方便快捷地
检测到 EGFP
LAT /ORF3融合蛋白的表达并能用
G418筛选出稳定转染的细胞株,从而进一步 ORF3
的生物学功能。
目前国内外还没有将 HSV
2 LAT ORF3克隆进
pEGFP
C2真核表达载体的报道, 本试验首次成功
构建了可以在 Vero细胞中瞬时表达的真核表达载
体 pEGFP
C2 /LAT
ORF3。该重组载体的成功构建
为进一步研究 HSV
2 LAT的生物学功能和作用机
制提供重要的分子工具和试验基础。
参 考 文 献
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