全 文 ：董阳医学院学报 1 9 8 8年第 16卷第 4期 2 8 4
田基黄水煎剂对 亚型单纯疤疹病毒
复制的抑制作用
衡阳医学院微生物学教研室 吴移谋 占利生
内容扭要 作者在细 胞培养中发现 田基黄时 I型单纯疙疹病毒 ( H S V 一 2 ) 的复制 有
明又的抑例作用 。 它对 V er 。 一 E 6细 胞的无毒浓度为 7 . sm g / m l ( 即 相 当于每毫升 7。 s m g生
药 ) , 最小有效抑制 H s v 一 2 复制的浓度 为 2 . s m g / m l 。 抑制指数 〔即病毒时照的滴度 (时数 )
减去病物处理过的病每滴度 (时数 ) 〕 为 3 . 2 5, 抑制明显 。 有效浓度的 田 基黄 ( 2 . S nI g / m l)
在细胞外对 H S V 一 2 无直接 灭活作用 。 H S V 一 2 在复制周期中的早期即病毒的吸附或 穿 入
阶段时 田基黄敏惑 。 此药在 2 . s m g / m l的浓度下 , 杭 H S V 一 2 的作 用不亚 于环 胞 普 ( s gu
/ m l) 或疙疹净 ( 1 0 o u g / m l ) 。 因此 , 提出了用此药预防宫烦瘩或与无环乌替 合 用 治 疗
H S V 一 2 感染的可能性 。
关锐词 田 基黄 单纯疙疹病毒 l 型
对 H S V 一 2 的感染 , 目前虽有 些 核 普
类似物如疤疹净 , 阿糖腺普有一定疗效 , 但
毒性作用较大 , 且可 诱发 畸 胎 与 致 癌 作
用① ② ①。 为此 、 本文针对 H S V 一 2 进行了
抗病毒药物的筛选 , 发现单味田基黄水煎剂
对 H S V 一 2 的复制有明显的抑制作用 , 可能
对 H S V 一 2 的感染有临床意义 , 现将所作的
工作报告如下 。
材料和方法
( 一 ) 药 物 : 田 基黄水煎剂的制备 ,
将田基黄用单蒸水洗五次 , 双蒸水洗二次 ,
以 1 克原生药与 1 0 0 1 1双蒸水的比例 配 备煎
荆 , 调节 P H 至 6 一 8 , 并经水浴煮沸消毒
30 分钟 , 冷后用吸管吸出 , 分装于试管中 ,
置 4 ℃冰箱中保存备用 。 实验前用维持液稀
V
e r o 一 E 。细 胞
释至所需浓度 。
( 二 ) 组织培养 : 采用V e r 。 一 E . (非
洲绿猴肾 ) 传代细胞 。 待长成单层后 , 选细
胞形态良好的细胞 , 用 P H 了. 名磷酸 盐 缓 冲
液洗二次供实验用 。 生长液用 E a gl e 氏M E
M ( 日本 N i s s u i ) , 加 1 0写灭活小 牛 血 清
( 维持液则加 2 纬灭活小牛血清 ,加 N 一 2 径
乙基喊嗓 一 N 一 2 乙敬酸 ( N 一 Z H y d r o x y e
t h y 1P I P e r a z i n e 一 N 一 2 e t h a n e s u i f o n i e
a e i d H E P E S 2 5m M ) 按常规加双抗及
调 P H④ 。
( 三 ) 病毒 : H S V 一 2 由湖北医学院
病毒研究所赠给 , 在 V e r 。 一 E 6细胞中传代 ,
其滴度 为 1 0 “ ” “ ` r C I D 5 0 / o 。 l m l , 分 装
于链霉素小瓶中 , 置 一 40 ℃冰箱中保存 。
( 四 ) 化学药品 : 环胞普 、 上海第十
二制药厂出品的注射液 , 批号 8 5 0 5 0 6 , 每支
实 脸 卿
一组裹一产
一分
.
2 8 5
o o zm g
, 实验时溶于 l o m l H a o k ` 。 液中 ,
4 ℃保存备用 , 用时用维持液稀释成所需浓
度 ( 5 件 g / m l ) 。 疤疹净 、 广州白云 山 制
药厂出品的眼药水 , 批号 87 一Q10 5 、 每龚 1亚。
m g
、 用时用维持浪稀释成所需的浓度 ( 1 0
u g / m l )
( 五 ) 实验方法 : 此实验主要分两步
进行 。
( l ) 单层细胞首先用 H a n k’ s 液 或
含药物的维持液洗涤 两次 , 按一 定 的 M O I
( 感染倍数 ) 加入病毒 , 3 6 ℃吸 附 1 小 时
后 , 实验组和对照组分别加入含药物和无药
物的维持液 , 静置培养一定时间 ( 13 或 48 小
时 ) 后 , 初步观察结果 〔以 H S V 一 2 所 致
的特征性细胞病变作为观察指标 , 药物能保
护细胞不出现病毒特征性病变 ( 病毒对照组
全8小时病变完全 ) 则判断具有抑制作用〕 。
然后将培养物置于 一 40 ℃冰箱中保存并经冻
融三次 , 以释放病毒 。
( 2 ) 将培养物中的病毒悬液技 10 倍稀
释成 1-0 `一 1 0 “ 8的不同稀释度 ( 稀 释 过 程
在冰浴中进行 ) ,每种稀释度接种 4 管V e r 。
一
E 。细胞 , 每管接种 o . l m l病毒悬液 , 加维
持液后于 36 ℃静置培养 , 连续观察一 5 一天 , 并 ,
技R 。 e d 及M o e n c h 氏的方法计算病毒 的 滴
度即 T C I D 5 o的量 。
实 验 结 果
( 一 ) 田基黄水煎剂对细胞无毒浓度:
的测定 : 用维持液将田基黄水煎剂稀释成 10
1 1 19 / m l
、
7
.
5坦 g / m l 、 5 m g / m l 、 3 。 3
坦 g / 。 l 、 : . 石m g / m l 、 1 . 2 5m g / m 豆等 不
同浓度 , 分别加入已长满单层的V er 。 一 E 6
细胞培养瓶中 , 每种浓度加 2 瓶 , 每瓶加 2
。 1。 同时设不加药物的正常细 .胞作为对照 一 ,
置 3 6 ℃连续观察 4 天 , 以药物浓度最大而不
出现细胞退变为无毒性 , 结果见表 , 。
田 共 黄 水 煎 荆 对 扭 .
无 毒 浓 度 的 洲 定
对 月 组
田蕃黄
水熊剂
浓度
( m g /m l )
结 果
10 T
.
5 ` 台 . 3 2 .` 1 .器 一
十 一 一 一 一 一
注 : “ + ” 表示对细胞有毒性作用 “一 ” 表示对细脚
无毒性作用
由实验结果可见 , 田 基黄水旅荆在浓度
为 10 m g / m l , 对细胞有毒性作用 , 表现 细
胞变圆 、 折光性增强 、 堆积 、 断层脱落见图`
1
。
7
.
s m g / m l对 V e r 。 一 E 。细咆无毒性 作用 ,
继续传代证实 , 细胞形态良好 , 垦多角形 ,
排列规财 , 单层均匀见图 2 。
( 二 ) 田基黄最小抑病毒浓度的溯定:
用维持液将田基黄稀释成各种低于无毒浓度
即 3 . 3m g / m l 、 2 . s m g / m l 、 l 。 2 5m g / 也 l 、
0 , 6 2 5 0 9 / 。 1、 0 . 3 1 2皿 g / m l 、 0 ` 1吞6单蛛/
皿l等。 每种浓度用 4 管细胞进宝孔泌沁。 先用含药物的维持液 0 . 令琢工, 分别洗根应的细
胞管 。 每管细胞接种 0 . l m l的病毒急浪 ( 内
含久 0 0 1M Q I ) 吸附 1小时属 分浏加含不同浓度田基黄的维持液 , 每管 1二 ! , 静堆 -
培养 6 天 。 用 H a n k ` 。浪代替药液作病毒 对
照 , 并设细胞对照 。 实验组以不出现细胞病
变的最小浓度为最小有效抑制病毒复制的浓
度 。 结果见表二 。
由表二的结果可见 H S V 一 2 复制受抑 制
的程度 ( 即在实验组中不出现 C P B ) 与母
基黄水煎剂 的浓度呈正相 关 . 浓 度 大 时·
( 3
.
3 m g / ` l 、 2 . 5二 g / 二 l) 病毒的 复机
完全受抑制 , 细胞不出现 C p E 。 在士. % 一血`
/ 二 l时仅出现少数的传染灶 。 在。 . 行肠二 g / `
2 8 6
裹 二 田 基 黄 水 煎 荆 最 小 有 效 抑 演 弃 浓 度 的 侧 定
分 组 实 验 组 对 照 组
田 基 黄 水 煎 剂
浓 度 ( 口 g/ m) l
结 果
.
5 1
.
2 5
一 十
0
.
8 2 5
十十
0
.
312
+ + +
0
.
156
+ + + +
病 毒 对 照
+ + + +
细 胞 对 用
注 : 七 ” 表示无细胞病变 ( C PE) 病毒的复制完全抑制
“
+ ” 表示有少量的传染灶 , 在实验组中表示病毒的复制明显受抑制
` 十 十 + ” 表示 C P E 明显 ` 病毒的复制未受抑制
m l时 , C P E 已接近于病毒对 照 。 因此 , 证
实 H S V 一 2 受抑制与田 基黄水煎剂 中 的有
效成份有关 , 其最小有效抑病 毒 浓 度 为
2
。
s m g / m l
。
( 三 ) 田基黄抑病毒指数的测定 : 将已
长满单层的 4 c0 m “ 的细胞培养瓶 , 用测微器
进行细胞计数 , 计算出按 0 . IM O I 感染时所
需的病毒量 。 用维持液将田基黄水煎剂稀释
成 3 . 3二 g / m l 、 2 . s m g / m l 。 各取 4 tn l 洗
实验组细胞培养瓶一次 。 同样用无田基黄维
持液洗病毒对照细胞培养瓶一次 , 倒掉多余
液体 ,沥干 。 每瓶按 o . I M O I ,接种病毒吸附 l
小时后 , 分别加入多. 3 m g / m J 、 2 . 6 m g / m l
田基黄维持液和不含田基黄的维持液 , 一静置
培养 4 8小时易 冻化三次, 进行病毒滴度的
测定 。 测定药物处理组及病毒对照组滴度之
对数差 , 指数值为 2或> 2表示有抗病毒作
用 。 结果见表三 。
表 三 田 甚 黄 水 煎 荆 抑 制 H S V 一 2 复 制 指 数 的 浦 定
田基黄水煎荆
浓度 ( nI g / m l )
H SV一 2接种最
( M O I )
病毒滴度 (对数值灭 )
药物组 病毒对照组
抑制
指数
2
.
6 0
.
1 3
.
2 9士0 . 5 3 2 6. 5 4士0 ` 0吕 3 . 2 5 兴狱
3
.
3 0
.
1 2
.
6 6士 0 . 5 6 2 8 . 5 4土0 . 1 4 2 3 .公8 狱浓
城 均数及标准差是 4 次实验数据经统计学处理所得的结果④ .
兴兴 经配对 t检脸 P < 0 . 01 .
由表三可见 , 抑制病毒指数相差为 3 . 25
和 3 . 8 . 经配对 T 检验 P < 0 . 01 , 药 物组与病
毒对照组有 非常显著意义 , 表明 田 基 黄 对
H S V 一 2 在 V e r 。一 E 。细胞中的复制有明显
的抑制作用 。
( 四 ) 田基黄对 H S V 一 2 的 直 接 灭
活作用 , 取定盈的田基黄水煎剂 ( 浓 度 为
s m g / 。 1 ) 与等量的病毒悬液 ( 滴 度 为
1 0
6 ’ 7 ”
T C I D 5 o / o
.
zm l ) 混合 , 使药液的
最后浓度为 2 . s m g /。 1 , 在 35 ℃下作用 30 分
钟 , 然后取混合液 o . 4m l加 H a o k 产 S 液 1 . 6
。 1 , 为 10 一 ’ , 再依次稀释成 1 0一 “ 至 1 0一 。
每种稀释度接种 , 4 管 V e r 。 一 E 6细胞 , 每
管接种 。 。 . l ml 病毒急海加笋搜断鲜培
2忍7
表 日 田 基 黄 对 H S V 一 三的 直 搜 灭 活 作 用
田基黄水煎剂
的浓度 ( , 名 / . 1 )
H SV e Z 室温作用 病 毒 子裔 度
滴度 时间 药物组 病毒对照组
2
.
5 10 . ” ` 2 0 1 0. 10 6
养 5 天 。 同时用 H a n k ` S液代替药液作病毒
对照 。 比较药物组与病毒对照组病毒滴度的
差别 。 结果见表四 。
由表二的结果可见 , 药物组与病毒对照
组的病毒滴度均为 10 6 T CI D 50 。 由此证实 ,
田基黄在 2 . 5m叮 m l的浓度下 , 对 H S V 一 2
无直接灭活作用⑥ 。
(五 ) H S V 一 2 在其复制周期中对 田基
黄敏感阶段的测定 : 为了确定田基黄那一阶
段抑制 H S V 一 2 的复制 , 主要按照 I s ih t : u
k a 等⑥ ① 的方法迸行以下实验 , 即 用 M O 土
为 2 的病毒剂量感染细胞 , 分别于 0 , 15 、
3 0
、
6 0 分 钟 , 2 、 4 、 6 、 8 、 1 0 、 12 小
时加 入浓度为 3 . 3二 g !川 灼田基黄维持液 ,
各白培养 1 3小时 又 O 分钟的操 作 顺 序为 ,
先招含田基黄的维持液 先泽川 ! , 然 后 加
入 定 量 的病毒悬液并立即加入 含田基黄的
维持液 , 1 5 、 3。 、 60 分钟的顺序为 , 加入定
量的病毒悬液 , 分别 吸 附 15 、 30 、 6 0 分 钟
后 , 加入含田基黄的维持浓 ; 2 、 4 、 6 、
8
、
1 0
、
12 小时的 , 加入定量的病毒悬浪 ,
吸附 1小时后 , 加维持液培养 , 再 分 别 于
2
、
4
、
6
、
8
、
1艺小时更换含田基黄时维
持液 ) 。 然后分别取去冻化三次 , 以测定药
物不同时间的病毒滴度 。 每一时间均设有病
毒对照 , 结果见表五 。
衰 五 H S v 一 2 在复翻周期中对 田基黄敏感阶段的浏定
T C ID` 0 演度 抑制
对教差
nU工b
:
实验组
二 肠
2
.
0
2
.肠0
病毒对用组
,
,
6 0
3
.
6 0
3
.
86
4
.
0
68拍12一
一 城房毒作用不圈时阅后 . 加药培莽均为 13 小时由表五的结果可见 , 病毒复制受抑制是
在 0 小时 。 15 分钟后 , 加入药物不能完全抑
侧病毒的复制 . 这一始果表明田基黄水煎剂
主要是在病毒复制周期中的早期即病毒的吸
附一一穿入阶段抑制 H S V 一 2 的复制 。
(六 ) 田基黄与环胞昔 、 泡疹净抑制病毒
8 28
表 六
药 物
田基黄与环自昔 、 雍奋净抑病妞胜的此较
~
曰. , . , 、 一 卜一 ~ J . . . , . . . . . . 口 . . . . . 口几, 月` , , . J ` , ` .户
病毒滴度 对数差
名 称 实脸组 病毒对照浓度
2 6 m g / m l
6 u g / m l
1 0 0 u g /m l
一 r 了 一 -一 , . 闷 .翻 , , , , r , 护 , , . . . . , . ,
作用的比较 , 丫 e r u 一 七 6细胞长成单层后 ,
接种 o . i M O I 的洒每 , 以 .“1丁 1小时肩 , 每瓶
分别加入含 s u g /m l 的环胞甘 , z o o u g /m l
泡疹净 ( 以上 l4J 种浓度均力文献中报导的有
效抑制 H S V 一 匕的浓度 , 及 : . o m g /m l田 基
黄维持液 10 m l 。 同时谈不那药物的病 毒 对
照 , 静置墙乔 4吕小时肩 , 冻化三次 , 取出一
部分进行病毒响 度的侧足 , 以比较二种约物
抑制病毒的拍奴 。 结呆见衣六 。
由表六 日U拍采 叫见 , 田基共在艺. 。。 g/ m l
的浓度下抑 l初脚每伯奴力 乙. 匕。 , lu 坏袍甘在
浓度为 s u g /二 1时 ( 长土志玉等四 很寻有效
浓度 ) 抑制们每 刘伯戴刀 u . 谷吕。 泡渗净仁浓
度为 1 0 Ou g / ; : 、 ` 。 J , 于甲市。洒每佰浓刀 王。 衣
明住上述爪反 卜国绝界小 烈刑刚孤 n o V 一 2
的作用不业寸妙昭甘勺似渗净 。
讨 佗
田基只刀赚只科恤初 , 南隽删夫 、 腻醒
等。 本品仕味百 目 、 你 、 订浦烈利血 、 消肿
解毒功能 。 仁试官门盯十组菊 俄什国 、 肿火
球菌 、 金只 巴葡甸环国 、 被坏国 、 拍霍乱沙
门氏自相皮从县 自有个 回住没俐 抑 制 作 用
⑧ L 。 腼冰』玉安用于治厅忘仕声 逗 型 肝
炎。 本头拉让明匕刘 n o V 一 名的复制 有 明
的抑制作用 。 务敢小何效浓度力 么。 s m g / m l
冶疗指数 ( 放大无毒浓度 /最小有效浓 度 )
为 3 。 抑制 H S Y 一 2 的作用与亘接灭 活 无
夭 . 药物处理细胞后 、 再感染 Z M O I 的 病
毒 , 加药墙养 1 3小时 , 在 O分 钟 , 无 七F 乞
产生 , 共传染性滴度为 0 . 5 ,而在 1 5分钟后 ,
加药培养 , 不能完全抑制 C尸 E的产 生 , 共
传染性滴度为10 2 ` 。 。 说明药物可能封 闭 细
胞受体 , 从而主要阻止病毒复制周期中吸附
气 , 穿入阶段 , 而呈现抗病毒活性 。
王志玉等卿报导环胞背在 2 。 。。盯。 l时
减 轻 H S V产生 C P E的程度 , 在大于感等于
5 u g / m l
,
一可完全抑制 H S V产庄 C尸厄。 本
次买脸采用 5 0 9 / m l环胞背像有达到元金押
制 H S V 一 2 复制的目的 , 这是否与所使用
的病毒剂盈不同有夫 , 着者所使用的剂邃为
O
。 IM U I
, 而王志玉等所侠用的剂盘为 10 丁一七
ID的 ( 未往明病毒与细胞的比例 ) 。
根据常规用疤疹净振定核酸夹型 ( 妇八
A ) 与 ( R加 A ) , 其剂最力 。 O~ 1 0 0 u ` / m l
田基策水熬刑比较抑病 毒 指 数 , 初 石 刀
乞。 “ , 后省力 1 , 表明在上述浓度 卜山 巷
衷抑制 h 。 丫 一 乙作用不业于环胞甘勺 鹅 渗
净 。
本实脸仅反映在细胞靖养中田绍丙对 比
S V 一 2 的抑制作用 。至于这种药物在饥 体内
的作用如何 ,有待动物失 脸 和临床进一护证
买 。 另外对其有效成分提纯 , 分子结构 的 确
定 , 值得进一步择系 。 对 于 H S V 一 2 同属
的病今如巨细胞病毒和 艺B病毒的作用 , 也
值得探家 ( 衷心感谢导师一一宋家兴教授对
不工作的精心指导 ) 。
`本文图 1 ~ 2见第 3 6 a 页 )
2名 9
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奋 考 文 献
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t h a t t h e i n h i b i t i o n
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( P 2 8 4 )
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T R E S S S Y N D R O M E IN D O G B Y
A L L O G E N IC B O N E M A RR O W
IN J E C T IO N
H u p 主 e t a l P h y s i o l o g y D e p a r tm e n
8 10 8 9 (第 38 5夭 )腺胃大弯后艘胃体近界比脊处见灰白色斑块 〔箭头 ) .小弯胃窦粘膜颗粒状肿物 , 芝麻 、
绿亘大小 十 二指肠近幽门处有帅块突出浆膜 , 粘膜而 见椭圆形溃疡 .
8 11 3 州 第 5D 6天 ) ’浪胃小弯拈膜变黄 . 胃幽门前 后璧各见椭圆形肿块 与边缘隆起的盘形肿块 , 其上方胃窦
见斑块 、 颗粒状 。 前胃乳一头状肿物示鳞癌 ,
81 1 3 3 ( 第50 9天 ) 腺胃枯腺平坦 、 灰黄 , 大少后壁近界峙处有椭圆形肿物 。 小弯侧有芝麻大小突 起 . 胃
幽 门处有盘形肿块 。 前胃菜花形肿物示 鳞癌 。
81 1 3 4 ( 第叭 O天 ) 腺胃前壁肿块巨大 , 表面凸凹不平 , 暗红 , 占据整个大弯前壁 , 腺胃后壁肿块向胃腔突
出。
8 1 O02( 第 7天 ) 再生性增生腺体向粘腺表面外生性生长 , 形成息肉。 H . E ( 4 X S )
8 1 0 0 4 ( 第 1 4 天 )示腺瘤病灶 。 H . E ( 4 又 5 )
8 1 0 3 2( 第84 天 )示粘膜内癌 。 癌变腺体已破坏粘膜肌 , 尚未完全穿过 , 附近群膜及粘膜下层大量淋巴细
胞浸润 。 H E ( 1 o x 3 3 )
图 7高倍观 , 高分化腺癌 . 示 明显异型的癌变腺体 , H . E ( 4 o x 3 . 3 )
8 1 051 ( 第 1 68 天 ) 高分化腺癌 , 癌变腺体已穿过粘膜肌进入粘膜下层 , 发展为早期浸润癌 , H E ( 1 O x
2
.
5 )
8 10 6 5一 6 ( 第 2 1了天 ) 示粘膜肉癌 , 印戒细胞癌。 H E ( 盛0只 3 . 3 )
8 1 0 6 5一 6示早期浸润癌 , 粘液腺癌 。 H . E ( 40 x 3 . 3 )
81 肠 5一 5 示腺瘤癌变 , 侵及肌层发展为浸润癌 . 高分化腺癌 。 H ` E ( 4 x s )
81 1 0。 ( 第 3 92 天 ) 示息肉癌变 , 癌性腺体穿过粘膜肌形成早期浸润癌 , 高分化腺癌 . H . E ( 10 x 3 . 3 )
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图 8
图 9
图 1 0
图 1 1
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田基黄水煎剂对五型单纯疙疹病毒复制的抑制作用
〔正 文 见第2 8 4页〕