全 文 ：较多 ,且可产生耐药性 。呼吸道合胞病毒是一种 RNA
病毒 ,属副黏液病毒科 ,为婴幼儿下呼吸道感染最重要
的病毒病原 ,主要治疗药物为利巴韦林 ,但该药小剂量
时不能达到治疗作用 ,大剂量时可引起贫血和其他毒
副作用 ,故对其治疗价值尚有争议 [ 2] 。因此开发新的
有效药物对上述两种疾病的治疗和控制十分必要。
中药复方制剂在病毒性疾病的治疗中占有重要地
位 ,特别是呼吸道病毒目前中药治疗在我国仍处于主导
地位 。中药抗病毒机制与西药作用专属性不同 ,系从中
医整体观点出发 ,一方面调节脏腑功能 ,提高机体免疫
能力 ,另一方面直接作用于病毒 ,发挥抗病毒作用 。本
研究所用复方抗病毒制剂是根据国内外文献报道和中
医专家经验研制的复方抗病毒制剂中药方剂。其方中
多味中药已被证实有明显的抗病毒活性。如杨海霞
等 [ 3]报道板蓝根提取液在鸡胚实验中 ,能明显灭活流感
病毒 ,体内实验亦证实能明显降低感染小鼠的死亡率 ,
减轻其肺脏病变 ,并使其免疫细胞增多。田文静等[ 4]研
究表明 ,连翘对细胞培养中的呼吸道合胞病毒有强有力
的抑制作用 ,且治疗指数达 48.33。贯众亦显示对疱疹
病毒 、肠道病毒等多种病原有抑制或杀灭作用[ 5, 6] 。
本研究表明 , 复方抗病毒制剂浓度 >0.15
mg·mL-1时即显示明显的抗流感病毒和呼吸道合胞病
毒作用 ,且其对 MDCK和 Hep-2细胞在 1.5 mg· mL-1
时才出现毒性 ,说明本复方有较好的抗病毒作用 ,且治
疗指数较高 ,安全性较好 ,有进一步开发研究的价值 。
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大青叶提取物抗单纯疱疹病毒 Ⅱ型的体外实验研究
喻淑庆 1 , 陈湘漪 2 , 余　凌 1
(湖北省妇幼保健院 1.麻醉科;2.妇产科 ,武汉　430071)
[摘　要 ] 　目的　检测大青叶提取物体外抗单纯疱疹病毒Ⅱ型(HSV-Ⅱ)的作用。方法　以 Vero细胞为宿主细
胞 , 阿昔洛韦为阳性对照药物 , 通过观察细胞病变效应(CPE)和改良 MTT比色法来测定药物的细胞毒性 、药物对 HSV-Ⅱ
的直接灭活作用 , 以及药物抗 HSV-Ⅱ对细胞的吸附和对 HSV-Ⅱ在细胞内复制增殖的抑制 , 算出药物抗 HSV-Ⅱ的治疗
指数。结果　大青叶提取物在体外对 HSV-Ⅱ无直接灭活作用 , 也无抗 HSV-Ⅱ吸附细胞的作用 , 但能抑制 HSV-Ⅱ在细
胞内的复制增殖 , 其治疗指数达 3.56。结论　大青叶提取物在体外有一定的抗 HSV-Ⅱ感染效果 ,主要是通过抑制病毒
在细胞内的复制增殖而发挥作用。
[关键词 ] 　大青叶;抗病毒作用;单纯疱疹病毒Ⅱ型
[中图分类号 ] 　R285.5　　　[文献标识码 ] 　A　　　[文章编号 ] 　1004-0781(2008)04-394-03
Anti-HerpesEffectsoftheExtractfromIndigowoadLeafinVitro
YUShu-qing1 , CHENXiang-yi2 , YULing1(1.DepartmentofAnesthesiology;2.DepartmentofGynaecology
andObstetrics, HubeiHospitalofWomenandChildren, Wuhan430071, China)
ABSTRACT　Objective　Tostudyefectsoftheextractfromindigowoadleafonherpessimplexvirus(HSV)-Ⅱinvitro.
　Methods　UsingVerocelashostcellsandacycloviraspositivecontrol, thecytotoxicitiesoncelsbytheherbs, thedirect
virusdestroyingandinhibitiononvirusproliferationwereinvestigatedbyadoptingMTTassayandobservingcytopathiceffect
(CPE).　Results　 ItwasshowedthattheherbshadnodirectinactivationonHSV-Ⅱ invitro, noinhibitiononvirus
absorptioneither.However, theherbscouldinhibitHSV-Ⅱ biosynthesisandmultiplication.Thetreatmentindex(TI)was
3.56.　Conclusion　Theextractsfromindigowoadleafshowsomeanti-HSV-Ⅱ efectsinvitrobysuppressingvirusreplication
incels.
KEYWORDS　Indigowoadleaf;Anti-viralefects;HerpessimplexvirusⅡ
·394· HeraldofMedicineVol.27 No.4 April2008
　　单纯疱疹病毒(herpessimplexvirus, HSV)属疱疹
病毒科 ,为 DNA病毒 。它有两个主要的血清型 , 即
HSV-Ⅰ和 HSV-Ⅱ 。其中 HSV-Ⅱ主要引起生殖器与肛
门感染 ,可以通过胎盘屏障 ,受 HSV-Ⅱ感染后患生殖
道疱疹的产妇可能会将病毒传给新生儿 ,新生儿疱疹
病情严重者可致死 [ 1, 2] 。还有研究表明 HSV-Ⅱ感染
是宫颈癌发生的高危因素之一 ,可见 HSV-Ⅱ感染所致
的疾病有着极大的危害。
大青叶为十字花科植物菘蓝的干燥叶 ,其根即板
蓝根。传统医学认为大青叶功能清热凉血 ,为解毒要
药 ,在临床上应用广泛 。与之有关的实验研究也很多 ,
文献报道大青叶具有抗病毒 、抗菌 、抗内毒素等多种作
用 ,对乙型肝炎病毒 ,乙型脑炎病毒 、腮腺炎病毒和流
感病毒等均有抑制作用 。但对于其抗 HSV-Ⅱ的作用
笔者未见报道。笔者在本研究中对大青叶在体外对
HSV-Ⅱ的作用进行了初步检测 。
1　材料　
1.1　药物　水提醇沉法制备的大青叶提取液 ,由武汉
生物化学制药厂研究院提供 , 生药液浓度为 200
mg·mL-1 ,抽滤除菌后 -20 ℃保存 ,实验用时以细胞
维持液稀释成不同应用浓度。阳性对照药物阿昔洛韦
(ACV)注射用灭菌粉末 ,每支 0.125 g,武汉生物化学
制药厂生产 ,批号 2005090926 。
1.2　细胞　非洲绿猴肾细胞(Vero细胞),武汉大学
临床病毒学研究所提供 。细胞生长液:MEM培养基
(Hyclone产品),加 10%新生小牛血清(杭州四季青生
产),常规加 100 U· mL-1青霉素 , 100 μg· mL-1链霉
素 , 1%谷氨酰胺。细胞维持液:除血清降为 2%外 ,其
余同生长液 。
1.3　病毒　HSV-Ⅱ 333病毒株 ,由湖北省预防医学科
学院病毒所提供 。病毒经 Vero细胞活化增殖 ,细胞病
变效应(cytopathogenicefect, CPE)>75%(+++～
++++)时收获 。
2　方法与结果　
2.1　病毒感染性的测定　参照文献 [ 3] ,将细胞悬液
稀释成 1×105个 ·mL-1 ,每孔 0.1 mL接种 96孔细胞
培养板 ,置 37 ℃、5%二氧化碳(CO2)培养箱中培养 ,
长满成单层后 ,弃去上清 ,将 HSV-Ⅱ病毒液 10倍递次
稀释成 10-1 , 10-2 , … 10-8 ,每孔 0.1 mL,分别加入细胞
悬液内 ,每个稀释度设 4孔 ,同时设不加病毒液的正常
[收稿日期 ] 　2007-07-23
[作者简介 ] 　喻淑庆(1973 -), 男 , 湖北十堰人 , 主治医
师 , 学士 ,从事麻醉科临床工作。 电话:027-87648649, E-mail:
yushuqinchen@sohu.com。
细胞对照。 37℃吸附 1.5 h,弃上清 ,换细胞维持液 ,
每孔 0.1 mL,置 37 ℃、5%CO2的培养箱中继续培养。
每日观察细胞病变程度 (CPE)并记录 ,待 CPE稳定
(3 ～ 4 d)后判定结果 ,按参考文献 [ 4]计算病毒的半
数感染量(TCID50)。 CPE记录方法:“ -”为无细胞
病变;“ +”为 <25%的细胞出现病变;“ + + ”为
25% ～ 50%的细胞出现病变;“ + + +”为 ～ 75%的
细胞出现病变;“ + ++ +”为 ～ 100%的细胞出现病
变 。结果:实验测得 HSV-Ⅱ 333株的 TCID50 =10– 6.30。
2.2　药物的细胞毒性测定　方法同 “ 2.1”。在 96孔
板上培养细胞 ,长满成单层后弃去生长液 ,换用含药维
持液继续培养。药液浓度分别为 0.25, 0.50, 1.00,
2.00, 4.00, 8.00, 16.00, 32.00 mg· mL-1 ,每一浓度均
重复 4孔 ,同时设正常细胞对照及阳性药物对照(ACV
组 , 1.0 μg· mL-1)。每日观察 CPE并记录 ,待各组
CPE稳定(约 3d)后用改良 MTT法检测各孔细胞存活
率 。改良 MTT法操作步骤 [ 5 ～ 7] :每孔加入 MTT(5
mg·mL-1)20μL, 37 ℃继续培养 4 h;轻吸弃各孔内上
清液 ,每孔加入 DMSO150 μL,振荡混匀 10 min,使结
晶充分溶解;测定 570 nm波长处吸光度(A值)。细胞
存活率 (%)=药物组 A值 /正常细胞组 A值 ×
100%。用直线回归法算出药物对细胞的 50%毒性浓
度(TC50)。结果:实验测得大青叶提取物对 Vero细胞
具有一定毒性作用 ,最大耐受浓度约为 4.0mg· mL-1 ,
TC50为 19.46mg· mL-1。见表 1。
表 1　改良 MTT法测得大青叶提取物的细胞毒性结果　
浓度 /
(mg· mL-1)
细胞存活率 /
%
浓度 /
(mg· mL-1)
细胞存活率 /
%
0.5 100.0 8.0 78.4
1.0 100.0 16.0 58.1
2.0 100.0 32.0 21.2
4.0 99.2 阳性药物对照 100.0
(1.0μg· mL-1)
2.3　药物对 HSV-Ⅱ的直接灭活作用 　将 100倍
TCID50的病毒液与药液等体积混合 ,药物终浓度在
“ 2.2”测得的最大耐受浓度以内 , 分别为 0.125,
0.250, 0.500, 1.000, 2.000, 4.000 mg· mL-1 ,每一浓
度均重复做 4份 ,在 CO2培养箱中于 37 ℃下温育 2 h
后 ,将 4份同浓度样品混匀 ,用维持液进行连续 10倍的
递次稀释。按 “ 2.1”项中方法测定病毒的 TCID50。结
果:不同浓度药物组病毒株的 TCID50值与病毒对照组差
异无显著性。说明药物对 HSV-Ⅱ无直接灭活作用 。见
表 2。
2.4　药物对病毒吸附细胞的阻断作用　待 96孔板内
的细胞长满成单层后 ,弃上清液 ,加含药维持液 ,每孔
·395·医药导报 2008年 4月第 27卷第 4期
0.1mL,药物终浓度同 “ 2.3”,每一浓度均重复 4孔 ,
同时设未用药液的病毒对照及正常细胞对照 。置
37 ℃培养 24 h后 ,吸出上清液 ,用 Hank s液洗 3次 ,
然后接种 100倍 TCID50病毒 ,每孔 0.1 mL, 37 ℃吸附
1.5h,再弃上清液 ,换维持液继续培养细胞。每日观
察 CPE并记录 。结果:不同浓度药物组的 CPE记录与
病毒对照组均为 “ ++++” ,差异无显著性 。说明药
物对 HSV-Ⅱ吸附细胞的过程无阻断作用。
表 2　大青叶提取物对 HSV-Ⅱ的直接灭活作用结果　
药物浓度 /(mg· mL-1) CPE 细胞存活率 /%
0.125 ++++ 10.8
0.250 ++++ 11.5
0.500 ++++ 11.9
1.000 ++++ 10.8
2.000 ++++ 9.9
4.000 ++++ 12.0
病毒对照 ++++ 10.3
　　TCID
50
=10–6.30 , “ ++++”表示 75% ～ 100%细胞出现
病变
2.5　药物对病毒在细胞内复制增殖的抑制作用　待
96孔板内的细胞长满成单层后 ,弃上清液 ,接种病毒 ,
每孔 0.1 mL, 37℃吸附 1.5h,再弃上清液 ,换用不同
浓度含药维持液 。药物终浓度在半数中毒浓度以内 ,
分别为 0.25, 0.50, 1.00, 2.00, 4.00, 8.00 , 16.00
mg·mL-1。每一浓度均重复 4孔 ,同时设阳性药物对
照(ACV组 , 1.0 μg· mL-1)、未用药液的病毒对照及
正常细胞对照。待病毒对照组 CPE达 “ +++”时用
改良 MTT法测各孔活细胞的含量 ,操作同 “ 2.2”。算
出病毒抑制率。病毒抑制率(%)=(药物组 A值 -病
毒对照组 A值)/(正常细胞对照组 A值 -病毒对照组
A值)×100%。并用直线回归法计算药物对 HSV-Ⅱ
在细胞内复制增殖的 50%抑制浓度(IC50),并计算药
物治疗指数(TI=TC50 /IC50)。结果:实验药物能抑制
HSV-Ⅱ的生物合成 ,其 IC50为 5.47 mg· mL-1;TI为
3.56。见表 3。
3　讨论　
病毒性疾病是当今人类最主要的感染性疾病之
一 ,有关病毒性疾病治疗药物的研究有着极为重要的
意义 ,但这方面一直进展缓慢 ,现有的主要是化学合成
表 3　改良 MTT法测得大青叶提取物抗病毒合成增殖的结果　
浓度 /
(mg· mL-1)
病毒抑制率 /
%
浓度 /
(mg· mL-1)
病毒抑制率 /
%
0.25 7.1 4.00 45.0
0.50 6.5 8.00 64.1
1.00 15.2 16.00 70.3
2.00 31.8 阳性药物对照 93.2
(1.0μg· mL-1)
类药物 ,容易产生较重的不良反应和耐药性 ,临床效果
难尽人意。而传统中药具有不良反应低 、无耐药性等
优点 ,因此高效低毒的抗病毒中药的筛选成为抗病毒
研究的热点之一 。
大青叶作为清热解毒类中药应用于临床多年 ,其
对病毒感染性疾病的疗效得到了长期的实践检验。本
实验初步研究了大青叶抗 HSV-Ⅱ的作用效果及机制。
通过本研究发现 ,大青叶在体外不能直接杀灭病毒 ,也
不能阻止病毒吸附与进入细胞 ,但是能抑制已经进入
细胞内的病毒的复制增殖 ,且在一定范围内呈现药物
剂量效应依赖性 ,即随着药物浓度的增高 ,对病毒的抑
制作用也增强。
根据实验数据 ,算得大青叶在体外 Vero细胞模型
上的抗 HSV-Ⅱ病毒治疗指数达 3.56。说明大青叶有
抗 HSV-Ⅱ病毒作用。但是其抗病毒复制增殖的具体
作用机制及其有效成分尚待进一步的实验研究 。
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