全 文 ：收稿日期:2007-10-16
基金项目:南华大学硕士启动项目(5-03-XJQ-03-016)
作者简介:朱允华(1976-),女,湖南慈利人,在读博士研究生,讲师,从事植物生化与分子生物学研究
菜心(BrassicaParachinensisBailey)又名菜薹,是我国南方特色蔬菜之一,品质柔嫩,风味独特,被誉为
“蔬品之冠”。菜心生长迅速,一年四季均可生产,在蔬菜周年供应上,尤其是淡季供应上占有重要地位。但
菜心是常异交植物,天然杂交率高,在育种中获得一个纯系需要 5～6年时间。通过花药培养方法获得双单
倍体(DoubleHaploid;DH)植株,可大大节省纯化时间和工作量[1]。自 Kameya[2]首次从甘蓝花药培养中获得
单倍体植株至今,已有甘蓝型油菜、花椰菜等芸薹属蔬菜花药培养获得单倍体植株[3,4]报道,但未见菜心花
药培养报道。对影响菜心花药培养的有关因子进行了研究,旨在探讨菜心小孢子胚胎发生的培养条件,从
而为芸薹属蔬菜用于单倍体育种提供一些前期的理论基础和依据。
1 材料与方法
1.1 试验材料
以特早 50、青梗菜心、四九菜心(19)为供试材料,材料于种植在湖南省农科院蔬菜所的试验田中,常
菜薹花药培养诱导胚状体的研究
朱允华 1,2 刘清 3 吴朝林 4 刘明月 5
(1湖南衡阳南华大学生命科学院,衡阳 421001;2湖南农业大学生化与发酵工程实验室,长沙 410128;3湖南省植物激素与生长发育重
点实验室,长沙 410128;4湖南省农业科学院蔬菜研究所,长沙 410125;5湖南农业大学园艺园林学院,长沙 410128)
摘 要: 分别以特早50、青梗菜心、9872和四九菜心(19)为供试材料,进行了基因型、温度、碳源等因素对菜心花
药培养诱导胚状体影响的研究。结果表明:不同基因型菜薹花药诱导率的差异显著,在改良B5固体培养基上特早50、
9872、四九菜心(19)的诱导率依次降低,而青梗菜心诱导不出胚状体;不同温度的前处理对 9872花药的诱导率也存在影
响,其中以4℃低温预处理幼花序1～2d和33℃高温预培养24～48h的处理效果最佳;碳源对胚状体的诱导也有较大影
响,其中蔗糖效果好于麦芽糖,且质量浓度为13%的蔗糖对特早50诱导率最高,而13%的麦芽糖诱导不出胚状体。
关键词: 菜心 花药培养 胚状体 诱导率
StudyonEmbryoidInductionofBrassicaParachinensisBailey
AntherCulture
ZhuYunhua1,2 LiuQing3 WuChaolin4 LiuMingyue5
(1DepartmentofLifeScience,HunanNanhuaUniversity,Hengyang421001;2LaboratoryofBiochemicalandFermentation
Engineering,HunanAgriculturalUniversity,Changsha410128;3HunanProvincialKeyLaboratoryofPhytohormonesand
GrowthDevelopment,Changsha410128;4InstituteofVegetable,HunanAcademyofAgriculturalScience,Changsha410125;
5DepartmentofHorticulture,HunanAgriculturalUniversity,Changsha410128)
Abstract: Themainfactorsofstalkantherculturesuchasgenotype,low temperatureofbuds,hightemperature
cultureandcarbonsourcewerestudied。Theresultsshow thatgenotypeplaysadecisiveroleinantherculture,the
inductionfrequencyofembroidsamongdiferentplantsdiferedsignificantly,low temperatureofbudscanobviously
improvetheinductionfrequencyofembroids;and1~2dayshightemperatureatthebeginningculturewerebeneficialto
thesuccesfuldevelopmentofculturedmicrosporesintoembryos。Thecarbonsourcewasalsoinfluencedonthe
embryoidInduction,andtheefectofsugarwasbeterthanmaltose.
Keywords: BrassicaParachinensisBailey Antherculture Embryoid Inductivefrequency
生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN·研究报告· 2008年第2期
2008年第2期
规方法栽培管理。
1.2 试验方法
1.2.1 取材 于菜心开花期,选取初花后植株的主花序或主侧枝上的幼花序。
1.2.2 花蕾的消毒 先用 70%酒精浸 30s,再在 0.1%升汞中消毒 10min,然后用无菌水洗涤 3～4次。
1.2.3 接种 选取多数花药小孢子处于单核期的花蕾(一般蕾长 2～3mm),剥出花药,接种于直径为 6cm
装有 Keler改良 B5固体培养基的培养皿中,用 Parafilm封口膜封口。每培养皿接种 8～10个花蕾,每个处理
接种 5皿,重复 3次。
1.2.4 培养 将接种好花药的培养皿先在黑暗下进行高温预培养,再转至 25℃继续暗培养 14d,然后转至
25℃下进行光照培养,3周后统计形成的胚状体数。产生的子叶形胚状体转入含 2%蔗糖的 B5固体培养基,
在 25～28℃14～16h光照下培养诱导分化成苗。
1.3 试验处理
1.3.1 低温处理 将从田间采集菜心的花序置于 4℃冰箱中给予不同时间的处理(1、2、3和 4d),以不进
行处理作对照。
1.3.2 热激处理 将接种好花药的培养皿在黑暗下进行不同温度(25、30、33和 36℃)与不同时间(0、24h、
48h和 72h)两因素试验。
1.3.3 培养基试验 分别以蔗糖的不同浓度和和麦芽糖与蔗糖的不同质量配比进行梯度试验。
2 结果与分析
2.1 花药培养的效果
花药接种在培养基上 3～5d,逐渐由黄绿变成褐色,能形
成胚花药体积逐渐增大,2周后在花药壁开裂处产生可见胚
状体,之后一些绿色球形、心形、鱼雷形和子叶形胚不断产
生,脱落在培养基上。将子叶形胚及时转移到含 2%蔗糖的
B5固体培养基中分化出小植株(图 1、图 2、图 3、图 4)。
2.2 不同基因型材料胚状体诱导频率的差异
对供试 4个材料在固体培养中进行花药培养结果于表
1,不同材料间胚状体诱导频率差异很大,有 3个获得了胚
状体,其中特早 50诱导频率最高,平均每花蕾产胚 1.5个,
9872诱导频率次之,平均每花蕾 0.6个,四九菜心(19)胚产
量较低,平均每花蕾只有 0.2个,而青梗菜心经多次重复培
养也未能诱导出胚状体。
2.3 低温处理对胚状体诱导的影响
对供试材料 9872从田间采取花序进行了不同
时间低温预处理,结果表明 4℃低温预处理能提高
胚状体诱导率,其中处理以 1～2d效果最好,平均每
花蕾产胚 1.4～1.5个,比未处理每花蕾提高了 0.7～
0.8个胚,随着处理时间延长,其诱导率有所降低,
但仍比未处理诱导率高(表 2)。
2.4 热激处理对胚状体诱导的影响
对供试材料 9872组织培养前进行热激处理,
25℃恒温培养为对照,结果表明在起始培养 1～2d内
表 1 不同材料胚状体诱导频率的差异
表 2 低温(4℃)处理对胚状体诱导的影响
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生物技术通报Biotechnology Buletin 2008年第2期
给予 33℃高温处理有利于胚状体诱导,但温度过高或处理时间过长均不能促进胚产生(表 3)。33℃处理
24～48h,胚产量可达 1.4～1.5个;36℃高温处理效果比 33℃差,胚产量有所下降;30℃处理 24h,虽有小孢子
分裂和原胚形成,但数量上明显低于 33℃处理,而对照 25℃恒温处理没有发生胚状体分化。从处理时间上
看,经 24h处理分化频率最高,48h处理后胚分化频率稍微下降,而处理 72h则不能诱导胚状体的产生。
2.5 培养基中的碳源对胚状体诱导的影响
本试验采用蔗糖、蔗糖与麦芽糖配合作碳源,试验结果见表 4。不同蔗糖浓度试验中,13%蔗糖浓度处
理胚状体诱导率最高,每花蕾胚产量为 1.6,16%处理胚产量明显降低,只有 0.2,10%和 19%蔗糖浓度处理
均没有产生胚状体。在蔗糖与麦芽糖配合试验中,随着蔗糖浓度减少,麦芽糖浓度增加,胚状体产量逐渐下
降,当麦芽糖浓度达到 13%,完全抑制了胚产生。
表 3 不同高温处理对胚状体诱导的影响 表 4 碳源和蔗糖浓度对胚状体诱导的影响
3 讨论
芸薹属蔬菜花药培养研究虽取得很大进展,但应用上仍存在许多问题,其中最主要问题是诱导频率和再生
率不高,加上培养存在基因型差异、受到供体植株生长状态和其它因素影响。
3.1 基因型与胚状体的诱导
不同基因型材料间胚状体诱导频率有很大差异,这在作物花药培养中是普遍存在现象[5,6]。以菜心4个品种
为试材,结果有3个能诱导出胚状体,但诱导频率有明显差异,说明基因型在胚状体诱导中起决定性作用。
3.2 低温预处理与胚状体的诱导
低温预处理不仅可缓解接种时间集中,工作强度大矛盾,且对大多数基因型花药诱导率和绿苗率具有良好
促进作用。结果还表明,菜心花药接种前,将其花序在4℃下处理1～2d,有利于胚发生,处理时间过长,花序发育
缓慢,大多数花粉过了最佳接种期,产生了负效应。其可能作用机制是,一段时间低温环境改变了花药内IAA、
iPA含量,阻断花粉原来发育方向,使其由配子体发育途径转向孢子体发育途径,从而在培养过程中表现为诱导
频率提高[7]。Sunderland认为低温处理花序可提高花药过氧化物酶活性和内源ABA浓度。Vergne等研究发现低
温处理能引起花药产生新特异性蛋白质带[8]。而Nitsch和Takahashi等研究发现,低温能改变纺锤体轴向,且还
能破坏纺锤体的管蛋白,从而阻止纺锤体的形成,使有丝分裂的常过程被打乱,进而导致去分化过程的产生。另
外,Seiki等报道,低温预处理后处在单细胞晚期小孢子百分率下降,具有两个相同大小的核的双细胞小孢子比
例增加,从而促进胚产生[9]。
3.3 热激处理与胚状体的诱导
花药接种后或小孢子分离纯化后,在正常温度培养之前,先放在高于正常培养温度下培养一段时间处理,
称之为高温预处理,亦为热激。高温处理可大大促进胚发育,但不同基因型间存在一定差异。在菜心花药培养前
给予不同温度和不同时间处理,结果表明,33℃处理24～48h最为适宜,处理温度过高或时间过长,对诱导胚胎
发生不利。其原因可能是:第一,高温破坏了药壁与小孢子间发育关系;第二,高温对大多数小孢子是致死
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2008年第2期
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(上接第135页)
地看出 CsEXP10蛋白有四个 α-螺旋。这与图 2蛋白质的二级结构预测结果相一致。
3 讨论
生物信息学是一门由分子生物学和信息科学技术相结合的交叉学科。随着人类基因组计划的完成,生
物科学的发展已从基因组时代步入蛋白质组时代。利用国际互联网资源对蛋白结构和功能预测分析不仅
有效地利用了生物信息资源,且大大缩短了实验周期,现已成为生物学研究领域的热点和方向之一。目前
为止,CsEXP10蛋白的结构和功能方面的研究,还未见报道。利用生物信息学资源对 CsEXP10蛋白的结构
和功能进行预测,为今后对该蛋白的结构和功能的研究提供理论参考依据,同时也为该蛋白在植物体内的
作用机制及基因的表达调控提供一定的线索。
参考 文献
1 McQueen-MasonSJ,CosgroveDJ.ProcNatlAcadSciUSA,1994,91:6574~6578.
2 McQueen-MasonSJ,DurachkoDM,CosgroveDJ.PlantCel,1992,4(9):1425~1433.
3 孙涌栋,张兴国,杜小兵,等.植物生理与分子生物学学报,2006,32(3):375~380.
4 翟中和,王喜忠,丁明孝.细胞生物学[M].北京:高教出版社,2000,79~240.
的,这样可减少成活小孢子数目,减少它们之间竞争;第三,高温是小孢子发育同步化,增加处于发育周期
中诱导敏感阶段小孢子数;第四,高温损害非单倍体,促进单倍体生长。
3.4 碳源与胚状体的诱导
花培中,糖不仅是作为渗透稳定剂,维持细胞和培养基渗透压,而且还是重要碳源,其种类和浓度大小
对胚状体诱导有很大影响。油菜花药培养中,Dunwel和 Thurling报道蔗糖浓度对小孢子活力及胚状体发生
有影响,并认为高浓度蔗糖对小孢子启动是必需的,但随后又阻碍小孢子进一步发育。陈军等[10]也表明,高
浓度蔗糖在培养起始最重要作用之一是维持小孢子活力,但随后又影响小孢子进一步膨大,从而影响其发
育。以蔗糖和麦芽糖为碳源,试验结果发现,菜心花药培养以 13%的蔗糖浓度效果最好,在 10%和 19%的
蔗糖浓度中没有产生胚,说明一定浓度蔗糖可促进胚产生,但浓度过低或过高均不能诱导出小孢子胚。
麦芽糖等其它碳源已用于小麦等作物的花药培养中[11],但在蔬菜花药培养上还未应用。余凤群等[12]用
13%的麦芽糖代替蔗糖,没有诱导出胚。采用蔗糖与麦芽糖配合使用,结果表明,培养基中随着蔗糖浓度减
少,麦芽糖浓度增加,胚状体诱导频率逐渐下降,当麦芽糖浓度为 13%时,无胚产生,说明麦芽糖不适合用
作菜心花药培养碳源。
参考 文献
1 CaoMQ,LiuF,LiY,etal.ActaHorticulture,1995,392:27~38.
2 王晓佳.中国蔬菜,1988,(2):59.
3 钟维瑾,方光华.上海农业学报,1990,6(2):7~14.
4 王怀名,G米克斯-瓦格钠,杨艳丽.华北农学报,1992,7(4):61~67.
5 钟维瑾,方光华.上海农业学报,1990,6(2):7~14.
6 寸守铣,万萌,邱仕芳,等.西南农业学报,1994,7(3):32~35.
7 徐武,李鸣,张敬,等.遗传学报,1997,24(2):165~169.
8 VergneP.Progressinplantcelularandmolecularbiology.London:KluwerAcademicPublisher,1990,416~421.
9 SeikiSato,NorioRatah.BreadingScience,2002,52(1):23~26.
10 陈军,陈正华,刘澄清,等.遗传学报,1995,22(4):307~315.
11 陈耀峰,朱庆麟.作物学报,1993,14(4):401.
12 余凤群,刘后利,傅丽霞.华中农业大学学报,1995,14(6):522~526.
朱允华等:菜薹花药培养诱导胚状体的研究 139