全 文 ：·综述与专论·
生物技术通报
B IO TECHNOLOGY　BULL ETIN 2009年第 11期
木素过氧化物酶的研究进展
姜杰 杨暖 丁梦旋 汪文静 王子元 谢响明
(北京林业大学生命科学院 ,北京 100083)
　　摘 　要 : 　木素过氧化物酶是一种能降解木素 ,由微生物分泌的胞外酶 ,广泛应用于生物制浆、纸浆的酶法漂白、有机污
染物的降解和环境的生物修复等方面。介绍了木素过氧化物酶的来源、结构与性质、催化机理以及基因工程方面的研究成
果 ,并对其可能带来的工业应用前景以及今后的研究方向进行了展望。
关键词 : 　木素过氧化物酶 放线菌 耐热耐碱性 基因克隆与表达
Research Advance in L ign in Peroxidase
J iang J ie Yang Nuan D ing Mengxuan W ang W enjing W ang Ziyuan Xie Xingm ing
( College of L ife Science, B eijing Forest University, B eijing 100083)
　　Abs trac t: 　 L ignin peroxidase (L iP) is the most common lignin2modifying peroxidase which could be app lied in biotechnological
app lications, such as in biopulp ing , biobleaching, biodegradation of organ2pollutants, and bioremediation. The source, the structure
and enzyme p roperties of L iP, catalytic mechanism and its advances in gene cloning were introduced, respectively. The potential app li2
cation in the industry of L iP was also reviewed.
Key wo rds: 　L ignin peroxidase　Actinomyces　Thermostability and alkali2tolerance　Gene cloning and exp ression
收稿日期 : 2009204203
作者简介 :姜杰 (19872) ,在读硕士 ,研究方向 :微生物与资源环境 ; E2mail: jiangjie1017@126. com
通讯作者 :谢响明 (19652) ,男 ,博导 ,研究方向 :资源与环境微生物学 ,微生物生态学 ; Tel: 010262336074, E2mail: xingm ingx@ sina. com
自然界中 ,木素 ( lignin)是仅次于纤维素的最为
丰富的碳素资源 [ 1 ] ,是由苯丙烷结构单元组成的复
杂的、近似球状的芳香族高聚体 ,由对羟基肉桂醇脱
氢聚合而成 ,它包围着纤维素 ,和半纤维素一起填充
于微原纤维之间 ,与细胞壁成分紧密结合。木素的
复杂结构制约其生物降解 ,从而严重影响了纤维素
和半纤维素的降解和利用 ,木素的降解成为自然界
中碳素循环的限速步骤 [ 2 ] ,因此对木素生物降解的
研究成为当今世界环境污染治理和生物物质利用的
热点 [ 3, 4 ]。
木素过氧化物酶 ( lignin peroxidase , L iP)主要
是由真菌分泌 ,含有亚铁血红素辅基的过氧化物酶 ,
是由 Kirk等于 1983年首次从白腐真菌黄孢原毛平
革菌 ( Phanerochaete chrysosporium B ursds ) 中发现
的 [ 5～7 ]糖基化细胞外蛋白酶 ,其分子量范围为 38～
47 kD,具有多种同工酶。该酶与漆酶 ( laccase)、锰
过氧化物酶 (manganese2depended peroxidase)构成木
素降解酶体系 ,研究表明 , L iP是该酶系的主要成
分 ,在木素降解中起关键性作用 ,其重要特点是对底
物没有特异性要求 ,因此该酶在生物制浆 ,芳香化合
物降解及环境污染控制等方面具有很大的应用
潜力 [ 8～11 ]。
目前 ,已经报道了部分真菌 L iP的分子结构、同
功酶的氨基酸序列及其催化机理。在木素过氧化物
酶的模式菌黄孢原毛平革菌的不同菌株中 ,超过 20
个基因 cDNA克隆已经被分离测序 [ 12～14 ] ,并对 L iP
的异源表达做了初步研究。目前报道的 L iP无法满
足实际工业应用的要求 ,但随着分子克隆技术的不
断发展 ,尤其是蛋白质外源表达技术的进步 ,利用基
因工程的方法异源表达目的基因蛋白 ,而获得大量、
专一的表达产物 ,不仅为构建工程菌株 ,实现异源表
达奠定基础 ,同时也为进一步利用木素过氧化物酶
提供了新的方法。
相对于真菌、细菌、放线菌类具有生长速度快、
不易污染、营养条件简单、易培养等特点 ,尤其是放
线菌来源的 L iP产量高 ,耐热、耐碱性强 ,在实际应
2009年第 11期 姜杰等 :木素过氧化物酶的研究进展
用方面具有显著的潜力 ,逐渐得到研究者的关注。
在近些年 ,吴玉英等 [ 15 ]在绿色糖单孢菌胞外酶预漂
白烧碱蒽醌麦草浆机理的初步研究中指出 ,绿色糖
单孢菌胞外酶粗酶液在 pH6. 0、60℃条件下处理 So2
da2AQ麦草浆后 ,可使漂白纸浆白度 ( ISO )提高 17.
4% ,与产自真菌的酸性真菌酶相比 ,绿色糖单孢菌
胞外酶具有一定的优势。潘文音等 [ 16 ]利用绿色糖
单孢菌胞外酶漂白麦草 NaOH2AQ 浆 ,研究表明此
方法可较为明显地提高纸浆的白度和黏度 ,降低
Kappa值 ,改善纸浆的可漂性。
1　木素过氧化物酶的结构
木素过氧化物酶是一系列含有一个 Fe (Ⅲ)、卜
啉环 (Ⅸ)和血红素辅基的同功酶 ,排列紧密且高度
保守。研究者用拉曼共振 (RR )、核磁共振 (NNR )、
电子自旋共振 ( ESR )、电子共振波谱吸收分析
( ERP)、X2衍射分析等技术揭示 L iP的结构。其晶
体结构确定为血红素 (Heme)埋在蛋白质内 ,可连接
至少一个藜芦醇 (VA ) ,木素大分子不能接近该酶
的活性中心 ,其结合位点是一段有序的糖残基 ,位于
接近活性中心通道表面的裂缝中 [ 17 ]。
2　木质素过氧化物酶的催化机理
在 L iP催化的分子机理研究方面 ,光谱学研究
表明 L iP有 5种氧化状态 ,自然状态的 L iP含有高
度自旋的 Fe (Ⅲ) ,被过氧化氢氧化失去两个电子形
成 L iPⅠ (氧带铁卟啉环自由基含 Fe4 + ) , L iPⅠ经单
电子还原形成 L iPⅡ (氧带铁卟啉环含 Fe4 + ) ,再经
过一次单电子还原回到自然状态 ,完成催化循
环 [ 18 ]。H is82在活性中心通道表面的裂缝的开口处 ,
Trp170在酶蛋白表面 ,其电子传递可能有两个不同的
途径 : 底物 2H is82 2A la83 2A sn84 2H is47 2Heme 或底物 2
Trp170 2Leu171 2Heme[ 19 ]。由于 L iP依赖 H2 O2 ,因此比
其它过氧化物酶具有更高的氧化势 ,其催化循环可
以藜芦醇为还原底物表示催化反应过程 :
L ip + H2 O2 →CompⅠ + H2O
CompⅠ + VA→CampⅡ +VA +
CompⅡ + VA→L iP +VA +
L iP催化木素分子间的β2O24键 ,催化β2O24模
型化合物的主要反应是 Cα 2Cβ断裂形成 VA和 22甲
氧基苯酚 [ 18 ]。
3　木素过氧化物酶的酶学性质
3. 1 酶的热稳定性
酶是一种大分子物质 ,蛋白质肽链具有特定的
空间结构 ,当酶吸收了过多的能量时 ,维持蛋白质空
间结构的次级键解体 ,导致热变性 ,随着变性的明显
化 ,反应速度自然降低 [ 20 ]。每一种酶都有其最适反
应温度及作用温度范围。随着作用温度的升高 ,酶
的活性随之加强 ,当达到最适温度后 ,随着温度的升
高 ,酶的活性随之下降 ,直至失活。酶的最适温度愈
高 ,这种酶的热稳定性相对就愈强。不同的反应温
度下 L iP表现的酶活力不同。
在真菌来源 L iP方面 ,徐淑霞等 [ 21 ]报道黄孢原
毛平革菌的 L iP最适反应温度为 40℃,在低于 45℃
时显示较高的酶活 ,但 55℃时酶活被完全抑制。
Tuisl等报道的黄孢原毛平革菌的 L iP同工酶 H2在
pH2. 5时最适温度 25℃并随反应 pH 值升高而升
高。杨金水等 [ 22 ]在研究斜卧青霉菌 P6木素过氧化
物酶中发现 , P6的 L iP具有相对较高的温度稳定
性 ,其最适温度为 45℃,但在 55℃时 ,其相对稳定性
仅有 62. 5%。
在细菌方面 ,杨金水等 [ 23 ]对假单孢菌 PKE117
木素过氧化物酶的研究中指出 , L iP最适反应温度
为 30℃左右。该酶在 25～40℃具有较高的酶活 ,但
当温度继续上升时酶活急剧下降 ,相对酶活基本维
持在 10% ～20%。放线菌方面 ,樊军等对绿色糖单
孢菌胞外酶研究 (待发表 )中发现 ,在 50～65℃条件
下处理 1 h后 ,剩余酶活在 70%左右 ,在 70～80℃
条件下处理 1 h后 ,剩余酶活仍有 44%。
根据报道 ,不同微生物来源的木素过氧化物酶
其耐热性不同 ,大部分真菌、细菌分泌的木素过氧化
物酶的最适反应温度偏低 ,不适合实际应用中的要
求。而部分放线菌类分泌的木素过氧化物酶热稳定
性高 ,在实际应用中具有更大潜力。
3. 2　酶的 pH值稳定性
不同的 pH值环境 , L iP表现出的酶活力不同。
真菌中 ,徐淑霞 [ 21 ]研究黄孢原毛平革菌发现其 L iP
在 pH2. 2～5. 2范围内剩余酶活在 90%以上 ,高于
pH5. 2,酶活逐步丧失 ,至 pH7. 6时几乎完全失去酶
活 , L iP最适 pH值为 2. 8。而 A itken5[ 24 ]研究的黄孢
原毛平革菌来源的 L iP最适 pH是 4,在 pH3. 0以下
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生物技术通报 B iotechnology　B u lle tin 2009年第 11期
极不稳定 [ 25 ]。杨金水等 [ 22 ]报道假单孢菌 PKE117的
L iP最适 pH为 5. 0左右。在 pH4. 0时 ,其相对酶活
只有 31. 6% ,至 pH7. 0左右酶活急剧下降 ,最低时
只有 21%。在其研究的另一种酶斜卧青霉菌 P6的
L iP其最适 pH为 4. 0[ 23 ]。上述研究报道表明真菌
分泌的 L iP不同同功酶间的 pH值存在差异 ,且均属
于严格的偏酸环境。而樊军等对绿色糖单孢菌胞外
酶发酵条件优化及其生物漂白的研究 (待发表 )中
指出 ,酶在 pH9. 0仍有近 61%的活性。放线菌类的
绿色糖单孢菌分泌的木聚糖酶和过氧化物酶具有耐
碱性和热稳定性高的特点 ,符合工业上应用碱法化
学浆氧化脱木素后纸浆的碱性高温条件 ,及对纸浆
漂白等都具有很重要的意义。
4 木质素过氧化物酶的基因克隆、表达及
调控
目前对真菌木质素过氧化物酶同工酶的分子生
物学、基因克隆等已得到详尽的研究和报道。分子
生物学的研究表明 ,在木素降解培养的胞外培养液
中被检测的 L iP同工酶超过 10个 ,分别命名为 H1～
H10[ 26 ] ,每种基因编码一种木素过氧化物酶蛋白。
位于活性位点残基附近的基因序列 (远侧和近侧的
组氨酸及远侧的精氨酸 )对于木素过氧化物酶的活
性影响是至关重要的 ,这些基因序列不仅存在于木
素过氧化物酶中 , 也存在于其它过氧化物酶
中 [ 27, 28 ]。在对 L iP基因家族单个基因成员进行转录
分析时 ,由于这些基因都有很高的同源性 ,因此比较
困难。在技术上要区别它们的转录产物 ,必须具有
特异的、灵敏的检测方法。目前常用的方法有
Northern杂交、Southern杂交和 RT2PCR等技术。
近些年国内外对白腐菌及其分泌的胞外酶在木
质纤维和有机污染物的降解机理、相关酶的酶学特
性及代谢调控、基因克隆与表达等基础研究有大量
的报道。已经从 P. chrysosporium 中克隆到编码 L iP
同工酶的 cDNA和基因 [ 29 ]。黄孢原毛平革菌的单
倍体基因组大小约为 4. 4 ×107 bp,其中包括 20% ～
30%的 rDNA 和线粒体 DNA, A + T的含量约为
41%。编码区的核苷酸序列具有较高的同源性 ,其
中包括一些等位基因。木素过氧化物酶基因编码的
成熟蛋白包括 343～345 aa, N端有 27～28 aa的分
泌信号肽 [ 30 ]。L iP同工酶的 C端氨基酸明显存在
一个保守序列 IPPPPDA,其功能不清楚。L iP基因
均含有 8或 9个内含子 ,大小约 49～76 bp; mRNA
剪接位点与其它真核基因一样 ,具有高度保守性。
L iP基因的 5′端非编码区核苷酸序列包括典型的启
动子保守盒 , TATA盒位于翻译起始点上游 66～81
bp, CAAT盒位于 107～228 bp的调节范围 ,还发现
与真核基因类似的顺式调控元件短序列 [ 12, 31, 32 ]。
胡国库 ,颜永红等 [ 33 ]对黄孢原毛平革菌酵母双杂交
cDNA文库的构建中对蛋白 2蛋白相互作用方面做了
研究 ,指出 142323蛋白为钓饵筛选 3 d cDNA文库 ,
在 142323蛋白在黄孢原毛平革菌中能以蛋白 2蛋白
相互作用的形式发挥功能。
从其他木素降解真菌中也得到了 L iP的 cDNA
序列。如杨金水等 [ 22 ]在对斜卧青霉菌 P6产生的
L iP进行了拟分离、纯化并对其相对分子质量、N2末
端氨基酸序列等进行测定 ,该试验借助 N2末端序列
测定设计特异性引物 ,利用 RT2PCR方法扩增 ,测得
其 N2末端序列为 VLLPADEKNA ,通过比对证明 P6
L iP与不同种菌株产生的过氧化物酶具有不同的同
源性。说明不同菌株间产生的过氧化物酶差异较
大 ,增加了研究者通过寻找 L iP保守序列进行引物
设计的困难。
国外学者在木质素过氧化物酶的异源表达方面
进行了一些工作。有人在杆状病毒中进行木素过氧
化物酶基因的异源表达 ,但表达水平较低。L ipH8
基因在大肠杆菌中表达所得到的是不具有生物活性
的包涵体 ,其活性在离体后才获得 [ 34, 35 ]。也有人将
黄孢原毛平革菌的木质素过氧化物酶基因在黑曲霉
中进行表达 ,其利用植物胭脂碱的启动子和终止
子 [ 36 ]。目前 ,这些木质素分解酶在纸浆工业的生物
漂白应用方面还有很多难题需要解决 :如来源于真
菌的一些氧化酶 (L iP,MnP, Laccase)对热的稳定性
不高 ,最适作用 pH值一般在酸性范围内 ,不能适应
碱法化学浆氧脱木素后纸浆的碱性高温条件。此
外 ,白腐菌同时也分泌纤维素酶 ,其产生的胞外酶需
经过提纯才能用于纸浆漂白。关于在天然条件下尤
其在木质中 L iP基因表达研究较少。由于木质过氧
化物酶在生物制浆及纸浆的生物漂白中的重大应用
前景 ,研究白腐真菌在不同的木材中培养生长出的
木质素过氧化物酶的基因转录调控是非常必要的。
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2009年第 11期 姜杰等 :木素过氧化物酶的研究进展
5　展望
木素过氧化物酶作为木素降解酶体系的主要成
分 ,在纸浆的生物漂白、有机污染物的降解和环境的
保护等方面具有极高的工业应用潜力。但由于其底
物的多样性及酶本身结构、基因编码、调控表达的复
杂性 [ 37 ] ,国外在 L iP分子克隆、外源基因的高效表
达体系的构建等研究尚有待深入 ,国内的研究正处
于起步阶段。因此 ,提高酶活性 ,构建 L iP基因的高
效表达 ,为实现 L iP的工业化生产 ,不但可以加快木
素生物降解的进程 ,而且对实现生物能的绿色转化
具有重要意义 ,为生物治理环境等开辟了新途径。
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