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研究报告

生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2010年第 8期
蒙古冰草MwLEA3基因植物表达载体的构建
石凤敏1  云锦凤 1  赵彦 1, 2  逯晓萍 1
( 1内蒙古农业大学 生态环境学院,呼和浩特 010018; 2内蒙古农牧业科学院, 呼和浩特 010031 )
  摘  要:  以植物双元表达载体 pCAM B IA2300为基础, 设计分别带有酶切位点 X ba I和 P st I的一对引物, 从克隆载
体 pGM
T
MwLEA3中扩增到目的基因 MwLEA3。用 X ba I和 P s t I双酶切该目的基因及表达载体 pCAM B IA2300, 回收
后利用 T
4
DNA连接酶连接 , 获得植物表达载体 pCAM
MwLEA3。通过冻融法将所获得的植物表达载体重组质粒导入
根癌农杆菌 LBA4404菌株中, 为该基因的功能鉴定及通过农杆菌介导法将 MwLEA3基因导入植物提高相关抗性奠定
了基础。
关键词:  蒙古冰草  MwLEA3基因  植物表达载体
Construction of P lant Expression Vector of the
M ongolianWheatgrassMwLEA3 Gene
Shi Fengm in
1  Yun Jinfeng1  Zhao Yan1, 2  Lu X iaoping1
(
1
College of Environm ent, InnerM ongolia Agricultural University,H uhhot 010018;
2
InnerM ongolia A cademy of Agriculture and AnimalH usbandry Sciences,H uhhot 010031)
  Abstrac:t  M ongo lian w hea tg rass Late Em bryogenesis Abundan t g ene(MwLEA3) w as amp lified us ing specific prim ers conta in ing
restr iction enzym e site ofX ba I and P st I. PCR products and the b inary expression vector pCAMBIA2300 w ere d igested by the co rre

spond ing restricted enzym es respective ly, and linked by T4DNA ligase. The resulting construc tion w ith MwLEA3 w as nam ed pCAM

MwLEA3. The pCAM
MwLEA3 w as transferred intoAgrobacterium tumefaciens stra in LBA4404 w ith freeze
thaw m ethod fo r the fo llow

ing
up research, such as gene functiona l identification and gene transform ation fo r o ther plan ts stress to lerance im provem ent.
  Key words:  M ongo lian w heatg rass MwLEA3 gene P lant expression vector
收稿日期: 2010
03
09
基金项目: 973!项目子课题 ( 2007CB108901
1 ),国家自然科学基金资助项目 ( 30760159 ),内蒙古草业重大专项 ( 20071923
1
1 )
作者简介:石凤敏,女,在读博士生,研究方向:牧草分子遗传学; E
m ai:l shifengm in318@ 163. com
通讯作者:云锦凤,女,教授,博士生导师,主要从事牧草遗传育种研究; E
m ai:l csgrass@ v ip. 163. com
晚期胚胎丰富蛋白 ( late embryogenesis abundant
pro tein, LEA蛋白 )是胚胎发生后期种子中大量积累
的一系列蛋白质 [ 1 ]。LEA蛋白广泛存在于高等植
物中, Dure等 [ 2]首先在棉花中发现这类蛋白。随后
在拟南芥、水稻、小麦、大麦、胡萝卜等几十种植物中
分离出 LEA基因 [ 3
7] , 通过对这些基因及其蛋白质
的分析表明 LEA蛋白共同的结构特征是偏性氨基
酸组成的高度亲水性的多肽。 1993年 Bary[ 9 ]根据
其氨基酸序列的同源性及一些特殊的基元序列,把
LEA蛋白划分为 6组。其中第 3组 LEA基因具有
结构特征最明显、序列保守性强等优点,受到人们的
广泛关注。
蒙古冰草 (Agropyron mongolicum K eng)是冰草
属多年生丛生禾草, 具有极强的抗逆性 (抗旱、抗
寒、耐盐等 ),可以为作物改良提供优良的抗性基因
资源 [ 10, 11 ]。本课题组通过同源序列 PCR扩增技术,
已从蒙古冰草中分离出 LEA3基因, 并命名为
MwLEA3
[ 12]
, 为通过基因工程培育抗旱新品种提供
了基因资源。
在本课题组已经成功地从蒙古冰草中克隆到
MwLEA3基因的基础上, 本研究构建了该基因的植
物表达载体, 并采用冻融法将其导入根癌农杆菌
LBA4404, 以用于下一步的遗传转化及 MwLEA3基
因的功能验证。
生物技术通报 B iotechnology  Bulletin 2010年第 8期
1 材料与方法
1. 1 试验材料
1. 1. 1 菌株和载体  含有 MwLEA3基因的克隆载
体 pGM
T
MwLEA3由本实验室保存。农杆菌
LBA4404由内蒙古大学生命科学学院张鹤龄教授
惠赠, 双元表达载体 pCAMB IA2300由内蒙古农业
大学逯晓萍教授惠赠, 大肠杆菌 (E. coli ) TOP 10感
受态购自天为时代生物工程公司。
1. 1. 2 酶及试剂  限制性内切酶购自大连宝生物
( TaKaRa)工程公司, DNA回收试剂盒、连接试剂盒
购自天为时代生物工程公司, 卡那霉素、氨苄青霉
素、利福平、链霉素均为国产试剂, 其他试剂均为分
析纯。引物合成及目的基因测序由上海生工生物工
程公司完成。
1. 1. 3 培养基  LB培养基 (胰蛋白胨 10 g /L、酵母
提取物 5 g /L、N aC l 10 g /L, pH7. 0)、YEB培养基
(胰蛋白胨 5 g /L、酵母提取物 10 g /L、牛肉膏 5 g /
L、MgSO4 0. 5 g /L, pH7. 0) ,固体培养基另加琼脂粉
(A gar) 15 g /L。
1. 2 方法
1. 2. 1 PCR引物设计  根据本课题组克隆的蒙古冰
草 MwLEA3基因序列,应用 Prmi er Prem ier 5. 0软件分
析设计一对特异引物。上游引物 TXL序列: TCTA

GAACTGAGGAGAAGACAGGGCA;下游引物 TPR序列:
CTGCAGGCGAACGACCAAACGAGTAA。划线部分为
上、下游引物引入的 Xba I和 Pst I酶切位点。
1. 2. 2 MwLEA3基因的扩增  以克隆载体 pGM
T

MwLEA 3所提质粒 DNA作为模板, TXL和 TPR为
引物, 进行 PCR扩增。 PCR扩增反应体系: cDNA
1. 0
L, TaqM ix 12. 5
L, 上下游引物各 1. 0
L, ,
加 ddH 2O至 25
L。PCR扩增反应程序: 94∀ 预变
性 5 m in; 94∀ 变性 30 s, 65∀ 复性 30 s, 72∀ 延伸 60
s, 35个循环; 72∀ 延伸 10 m in, 4∀ 保存。
1. 2. 3 植物表达载体构建  用 Xba I和 P st I双酶
切所扩增的 MwLEA3 基因和表达载体 pCAM

B IA2300,回收目的片段并用 T4 DNA连接酶连接,
得到重组质粒 pCAM
MwLEA3(图 1)。转化大肠杆
菌 TOP10,在含有 50
g /mL的卡那霉素的 LB培养
基上筛选重组子。提取重组质粒,进行 PCR检测和
酶切鉴定 [ 13]。
1. 2. 4  农杆菌的转化及 PCR鉴定  采用冻融
法 [ 14]将植物表达载体 pCAM
MwLEA3转化至根癌
农杆菌 LBA4404感受态细胞中,将菌液涂布于含有
卡那霉素、利福平和链霉素的 YEB固体培养基上,
于 28∀ 条件下培养 2- 3 d, 挑取单菌落摇菌, 提取
质粒并进行 PCR检测。
图 1 pCAM
MwLEA3植物表达载体的构建
2 结果与分析
2. 1 目的基因 MwLEA3克隆
以克隆载体 pGM
T
MwLEA3所提质粒 DNA为
模板,利用所设计的引物 TXL和 TPR进行目的基因
的 PCR扩增产物, 经 1. 5%琼脂糖凝胶电泳,获得大
小约为 580 bp的扩增条带 (图 2 ) , 与预期大小
一致。
1. 100 bp DNA Ladd er; 2- 4.基因 MwLEA3的 cDNA
图 2 MwLEA3 PCR扩增
2. 2 目的基因 MwLEA3基因表达载体的构建
同时对扩增的 PCR产物及表达载体 pCAM

B IA 2300进行 X ba I和 P st I双酶切, 然后利用 T4
DNA连接酶进行连接, 再将连接产物转入大肠杆菌
中。对重组质粒进行 PCR检测获得约 580 bp的片
段 (图 3) ,进行双酶切得到片段长度约为 10 000 bp
的 pCAMB IA2300载体片段和 580 bp的 MwLEA3片
段 (图 4)。另外, 测序结果也表明,重组质粒插入的
126
2010年第 8期 石凤敏等 :蒙古冰草 MwLEA3基因植物表达载体的构建
外源片段与目标基因序列一致。上述结果证实,
MwLEA 3基因已经成功构建到表达载体 pCAM

B IA2300中,命名为 pCAM
MwLEA3。
2. 3 农杆菌 LBA4404转化植物表达载体 pCAM

MwLEA3
采用冻融法将构建的表达载体 pCAM
MwLEA3
转入农杆菌 LBA4404, PCR检测重组质粒, 经琼脂
糖电泳检测,获得与克隆载体一样的大小约 580 bp
的目的条带 (图 5) ,证明含有目的基因 MwLEA3的
表达载体已成功转入农杆菌中。
LEA蛋白基因是种子成熟和发育阶段表达的
基因, LEA蛋白在干旱过程中对植物能够起到一定
的保护作用,当水分亏缺时, 能够保持细胞膜系统,
使生物大分子免受破坏 [ 15]。众多研究表明第 3组
LEA蛋白的积累与植物包括转基因植株的耐旱能
力相关 [ 16
19 ] ,因此运用 LEA3基因进行植物遗传改
良以提高其抗逆性是可行的。
1, 2.重组质粒 pCAM
MwLEA3的 PCR; 3. M aker I
图 3 重组质粒 pCAM
MwLEA3
的 PCR检测
1. DL15000 DNA M ark er; 2.
100bp DNA Ladd er; 3
5. P st# 和
X ba # 酶切重组质粒 pCAM

MwLEA3
图 4 重组质粒 pCAM

MwLEA3的酶切鉴定
1. DL15000 DNA M arker; 2. 100bp DNA Lad

d er; 3. 对照 (水 ) ; 4. 对照 (载体 pCAMB IA
2300) ; 5. 对照 ( pGM
T
MwLEA3 ) ; 6, 7.农
杆菌中 pCAM
MwLEA3质粒
图 5 pCAM
MwLEA3表达载体转化
农杆菌 LBA404重组质粒的 PCR检测
3 讨论
在构建表达载体时, 首先要考虑的是基因片段
的定向克隆问题,即将目的 DNA片段以正确的方向
插入启动子和终止子之间, 要保证基因转录的方向
与启动子驱动的方向一致, 而设计带有酶切位点的
引物可以实现基因的定向插入。在设计引物的过程
中,除考虑引物长度、G + C含量、是否形成引物二
聚体和有无发夹结构等基本因素外, 还应对目的基
因碱基序列以及相应的植物表达载体的酶切位点的
分析, 选取目的基因内部不存在的限制性酶切位点,
按照质粒载体上启动子方向及限制性酶切位点排列
顺序设计引物,以保证目的基因片段定向克隆到双
元表达载体质粒中。另外, 由于在扩增过程中 Taq
酶的保真性不能够保证 100%, 会存在错配的情况,
对通过 PCR、酶切验证的构建成功的表达载体要进
行测序验证。
本试验将蒙古冰草 MwLEA3基因与 pCAM

B IA 2300质粒连接, 成功构建了植物表达载体
pCAM
MwLEA3, 然后成功地将此表达载体转入根
癌农杆菌 LBA4404中。下一步的试验是将其导入
其他植物中使该基因表达, 从而对该基因进行功能
验证,可望达到提高植物相关抗旱能力的目的。
参 考 文 献
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