全 文 ：生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN·研究报告· 2009年第 1期
收稿日期：2008-06-17
基金项目：厦门出入境检验检疫局科技项目（XK09-2003）
作者简介：孔繁德（1967-），男，博士，高级兽医师，主要从事动物疫病研究和出入境动物检疫工作；E-mail：kfdfd67@sina.com
猪瘟病毒 （Classical swine fever virus，CSFV）和
猪繁殖与呼吸综合征病毒（Porcine Reproductive and
Respiratory Syndrome，PRRSV）是导致猪繁殖障碍疾
病的主要病原体。 当前猪瘟由 H 毒株引起的急性、
典型的猪瘟病日渐减少，而由 B 型毒株引起的慢性
（非典型）猪瘟却是当今最常见病型。该病在临床表
现和病理变化上不典型， 是猪瘟病的最大传染源。
它可以引起种猪的持续性感染，造成母猪的带毒综
合症，表现为繁殖障碍，怀孕早期感染引起流产、产
死胎和木乃衣胎，中期感染产出弱仔后死亡。 经调
查，目前母猪的带毒综合征达 43%。 感染母猪所产
的小猪往往产生免疫耐受， 当外界环境发生变化，
多重 RT-PCR一步法技术同时检测猪瘟病毒和蓝耳病病毒
方法的建立以及初步应用
孔繁德 1 王荣 2 陈琼 3 吴德峰 2 徐淑菲 1
（1厦门出入境检验检疫局，厦门 361012；2福建农林大学 动物科学学院，福州 351006；
3厦门市农产品质量安全检验测验中心，厦门 361009）
摘 要： 猪瘟病毒和蓝耳病病毒均能导致猪繁殖障碍，对养猪生产影响很大。 根据猪瘟病毒（CSFV）和猪蓝耳病
（PRRS）的基因保守序列设计了 2 对针对这 2 种病毒的特异引物，并建立了多重 RT-PCR 方法，分别对其最佳反应条件、
特异性及敏感性进行了测定，结果表明能同时扩增得到 2 条与试验设计相符的 167 bp（CSFV）和 320 bp（PRRS）特异性条
带， 同时具有较好的特异性； 敏感性检测结果表明， 临床阳性的样品提取的核酸稀释 1 000 倍后仍能检测出 CSFV 和
PRRSV。 本方法的建立对于这 2种病毒病的早期快速检测具有十分重要的意义。
关键词： 猪瘟病毒 蓝耳病 多重 PCR
Establishment and Primary Application of Multiplex Polymerase
Chain Reaction for Detection of Classical Swine Fever and
Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome Virus
Kong Fande1 Wang Rong2 Chen Qiong3 Wu Defeng2 Xu Shufei1
（1Xiamen Entry-exit Inspection and Quarantine Bureau，Xiamen 361012；2College of Animal Science，Fujian Agriculture and
Forestry University，Fuzhou 351006；3Xiamen Agricultural Broduct Quality and Safety Testing Center，Xiamen 361009）
Abstract： A multiplex polymerase chain reaction （M-PCR）was established and optimized to detect swine fever
virus （CSFV）and porcine reproductive and respiratory syndrome virus （PRRSV）simultaneously. Two sets of specific
primers were designed according to the conservative sequence of CSFV and PRRSV in the GenBank.It was showed
that all sampies which contained CSFV or PRRSV could be amplified by the multiplex PCR using these two sets
primers.Two specific bands of CSFV 167 bp and PRRSV 320 bp were detected using agarose gel electrophoresis in
this multiplex PCR and accorded with designed result.It could detect 1 000 diluted nucleic acid of CSFV or PRRSV
from clinic samples. The method provides a fast and reliable way of identifying CSFV or PRRSV. The method could
prove very useful for laboratories working with early rapid identification of CSFV or PRRSV.
Key words： Classicalswine fever vivus（CSFV） Procine reproductive and respiratory syndrome（PRRS） M-PCR
2009年第 1期
常造成猪瘟病的暴发和流行。这是目前规模化猪场
猪瘟持续存在的一个重要原因。而猪繁殖与呼吸道
综合征，又称为猪蓝耳病。 1996 年初，我国也报道
了本病的发生 [6，7]。 其特征为各种年龄的猪均可感
染发病，主要临床症状为厌食、嗜睡、体温升高，繁
殖母猪受精率下降，妊娠母猪发生早产，晚期流产、
死胎、弱胎和木乃伊胎，哺乳母猪泌乳不足，严重影
响新生猪生长发育。 仔猪和育肥猪表现呼吸困难、
急促和间质性肺炎，耳部及肢体皮肤发绀等。 本病
极易继发感染（如猪瘟、猪细小病毒、伪狂犬病毒，
尤其当前流行的圆环病毒）， 加剧病症， 死亡率升
高。由于该病分布广泛，危害严重，已给许多国家的
养猪业造成了严重的经济损失 [1~6]。
2006 年夏秋季节， 我国发生猪蓝耳病疫情，呈
点状分布，遍布 19 个省，给养猪业造成较大经济损
失，很多养殖户称它为“无名高热病”，因为对疫情
原因的不了解，给养殖户造成了很大的恐慌 [8，9]。 此
病与猪瘟是猪的多发病，常呈混合感染。 目前很多
猪场都同时存在这 2 种疾病， 严重影响养猪生产。
因此，尽快建立一种快速鉴别诊断这 2 种病毒的方
法具有十分重要的意义。这 2 种疾病的诊断通常采
用常规的病毒分离的病原学和血清学检测方法 [11~21]，
这些方法往往耗时长、繁琐或敏感性差。 因此有必
要建立快速的早期诊断方法，以便尽快采取有效的
防治措施，减少这些疾病对养猪业造成的损失。 本
研究旨在利用多重 RT-PCR 技术（即指在同一反应
体系中，加入多对引物，对多个目的基因同时进行
扩增的方法）， 设计 2 对针对 HCV 和 PRRSV 的特
异引物， 建立同时检测这 2 种病毒的多重 RT-PCR
方法，以期达到快速检测的目的。
1 材料与方法
1.1 病毒株
猪瘟兔化弱毒疫苗株和蓝耳病弱毒细胞毒，由
福建生物制品厂和上海奉贤县畜牧兽医站提供。猪
瘟和蓝耳病的临床阴性和阳性样品由本实验室保
存。 猪细小病毒、猪伪狂犬病、口蹄疫等疫苗毒、牛
病毒性腹泻病毒（BVDV）及边界病病毒（BDV）种毒
诊断试剂毒由本实验室保存。
1.2 试剂
琼脂糖、Taq 酶、dNTP、RNA 酶抑制剂、 反转录
酶 、一步法 RT-PCR 检测试剂盒 、病毒核酸提取试
剂盒等购自大连宝生物有限公司，DEPC 水由本实
验室制备。
1.3 仪器
PCR 仪为美国 ABI9700；凝胶成像分析系统为
以色列公司产品。
1.4 引物设计与合成
根据已报道的猪瘟和蓝耳病病原全基因序列
（GeneBank 中的 HCV-AF333000 和 PRRS- AF06618
3），猪瘟病毒选择保守性较强的 5 端非编码区（位
置在 1~450 bp）； 蓝耳病病毒选择开放阅读框架
ORF6 编码基质蛋白区和 ORF7 编码核衣壳蛋白区
（14 336~15 261 bp）， 借助 ABI 公司提供的计算机
引物设计软件 Prime2.0 设计了 3 对 HCV 和 PRRS
的引物组合。将设计好的引物委托大连宝生物有限
公司协助合成这两种病原的引物。经实验验证确认



 53  。。。。
HCV-10-1F CCACCTCGAGATGCTATGTGGA 211~232 167 bp
HCV-10-1R CCATGTGCCATGTACAGCAGAG 356~377
PRRS-16-1F CCAGAGTTTCAGCGGAACAATG 14 357~14 378 280 bp
HCV-PRRS 1
PRRS-16-1R TGAGTACACCCCCCAAAGGAGT 14 615~14 636
HCV-10-1F CCACCTCGAGATGCTATGTGGA 211~232 167 bp HCV-PRRS 2
HCV-10-1R CCATGTGCCATGTACAGCAGAG 356~377
PRRS-16-1F CCAGAGTTTCAGCGGAACAATG 14 357~14 378 320 bp
PRRS-16-2R AACGGCATCTGGAGGTGATGA 14 656~14 676
HCV-10-1F CCACCTCGAGATGCTATGTGGA 211~232 167 bp
HCV-10-1R CCATGTGCCATGTACAGCAGAG 356~377
PRRS-16-3F CAGAGTTTCAGCGGAACAATGG 14 358~14 379 402 bp
HCV-PRRS 3
PRRS-16-3R ATTTGCCGCAATCGGATGA 14 741~14 759

表 1 多重 RT-PCR 一步法引物组合
孔繁德等：多重 RT-PCR一步法技术同时检测猪瘟病毒和蓝耳病病毒
方法的建立以及初步应用 113
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2009年第 1期
组合 2 为最佳组合。本研究以此引物组合开展研究
工作。
1.5 病毒核酸提取
RNA 病毒和 DNA 病毒核酸的提取，参照 TaK-
aRa 公司生产的 TaKaRa MiniBEST Viral RNA/DNA
Extraction Kit Ver.3.0 提取试剂盒说明书进行。
1.6 多重 RT-PCR 一步法技术同时检测 CSFV 和
PRRSV 方法的建立
以病毒 RNA 核酸为模板进行 RT-PCR 扩增 。
反应体系为 50 μl， 其中 10 ×PCR Buffer 5 μl，25
mmol/L MgCL2 8 μl，10 mmol/L dNTP 1 μl，200 U/μl
反转录酶 1 μl，5 U/μl Taq 酶 1 μl，200 U/μl RNA
酶抑制剂 1 μl，20 μmol/L CSFV 上下游引物各 1 μl，
20 μmol/L PRRSV 上下游引物各 1.5 μl CSFV 和
PRRSV 核酸 RNA 模板各 2 μl，补充灭菌水至 50 μl。
扩增程序为 ：50℃ 30 min，94℃ 2 min，1 个循环 ；
94℃ 30 s，58℃ 30 s，72℃1 min，35 个循环 ；72℃延
伸 10 min。 取 4 μl 扩增产物进行琼脂糖电泳检测
扩增结果。
1.7 最佳反应条件的测定
分别利用 2 对引物进行 2 种病毒多重 RT-PCR
方法最佳引物浓度、最佳镁离子浓度和最佳退火温
度的测定， 然后根据实验结果进行多重 PCR 方法
最佳循环次数的测定。
1.8 敏感性测定
将提取的阳性临床样品 CSFV、PRRSV 核酸
RNA，采用一步法进行多重 PCR 进行扩增，以检测
其敏感性。
1.9 特异性测定
分别对猪瘟病毒兔化弱毒株 、PRRSV 弱毒苗
及 FMDV、PRV、PPV、BVDV 进行 DNA、RNA 提取 、
反转录 ， 利用所选择的最佳条件分别进行多重
PCR，以检测其特异性。
2.0 多重 PCR 的初步应用
2.0.1 已知样品的检测 将已知的 PRRS 弱毒疫
苗株、CSFV 不同厂家疫苗样品随机组合，等量进行
混合，分别进行 RNA 提取、反转录和多重 PCR。
2.0.2 临床样品的检测 将本室保存的 CSFV、
PRRSV 临床疑似样品进行 RNA 提取、 反转录 、多
重 PCR。
2 结果
2.1 多重 RT-PCR 一步法最佳反应条件的测定
2.1.1 最佳引物浓度的测定 从电泳图 1 可以清
晰地看出， 多重 RT-PCR 一步法引物浓度为在 50
μl 的反应体系中，引物组合 1~5 均可以，其中以组
合 1 最佳。
2.1.2 最佳镁离子浓度的测定 从电泳图 2 可以
清晰地看出，多重 RT-PCR 一步法镁离子浓度为在
50 μl 的反应体系中 ，25 mmol/l MgCL2 的剂量 10、
8、6 μl 均可，其中以 8 μl 最佳。




1 2 3 4 5 6
HCV-10F 1.0 µl 1.0 µl 1.0 µl 0.5 µl 0.5 µl 0.5 µl
HCV-10R 1.0 µl 1.0 µl 1.0 µl 0.5 µl 0.5 µl 0.5 µl
PRRS-16F 1.5 µl 1.0 µl 0.5 µl 1.5 µl 1.0 µl 0.5 µl
PRRS-16R 1.5 µl 1.0 µl 0.5 µl 1.5 µl 1.0 µl 0.5 µl

表 2 多重 RT-PCR 一步法引物浓度组合
图 1 多重 RT-PCR 一步法最佳引物浓度的测定
M 为 100 bp λDNA Marker；1~6 为加不同剂量的引物组合 ；
320 bp 条带为 PRRS；167 bp 条带为 HCV
图 2 多重 RT-PCR 一步法最佳镁离子浓度的测定
M 为 100 bp λDNA Marker；1~5 为 50 μl 反应体系中所加
的 25 mmol/L MgCL2 的剂量依次为 10、8、6、4 和 2 μl；320
bp 条带为 PRRS；167 bp 条带为 HCV
114
2009年第 1期
2.1.3 最佳退火温度的测定 从电泳图 3 可以清
晰地看出， 多重 RT-PCR 一步法退火温度为 52℃~
60℃均可，其中以 52℃和 58℃最佳。
2.1.4 最佳循环次数的测定 利用最佳引物浓度、
最佳镁离子浓度、 最佳退火温度对多重 PCR 方法
进行了最佳循环次数的测定 ， 结果表明循环次数
30~35 次均可，结果见图 4。
从电泳图 4 可以清晰地看出，多重 RT-PCR 一
步法循环数 30~35 个均可。
2.2 敏感性的测定
将临床检测 HCV 或 PRRS 阳性的样品分别进
行核酸 RNA 提取，10 倍系列稀释后采用一步法进
行多重 RT-PCR 检测 ， 从电泳图 5 可以清晰地看
出，此多重 PCR 灵敏度分别为 CSFV 10-3 和 PRRSV
10-3。
2.3 特异性测定
利用所设计的引物及所确定的最佳反应条件
分别对猪瘟病毒兔化弱毒株 、PRRSV 疫苗毒 、PRV
疫苗毒 、PPV 弱毒疫苗株 、FMDV 疫苗毒和 BVDV
疫苗毒进行多重 PCR，结果 5 个毒株中只有猪瘟病
毒兔化弱毒株和 PRRSV 疫苗毒能扩增出相应的片
段，大小分别为猪瘟病毒兔化弱毒株为 167 bp（预
期的为 167 bp）、PRRSV 疫苗毒为 320 bp （预期的
为 320 bp），而其它均未扩增出相应的片段。说明本
研究建立的方法特异性好。
2.4 临床样品的检测结果
从电泳图 6 可以清晰地看出 ，1 显示 HCV 强
阳 ，3 和 4 较弱 ，2 显示 PRRS 阳性 。 多重 RT-PCR
一步法完全可用于临床检测。
分别对 3 份猪瘟和 1 份蓝耳病疑似样品利用
多重 RT-PCR 进行测定，结果均扩增出了相应的目
的片段，而另外 10 份猪瘟和 10 份蓝耳病阴性样品
图 3 多重 RT-PCR 一步法最佳退火温度的测定
M 为 100bp λDNA Marker；1~5 为 52℃、54℃、56℃、58℃和 60℃
的退火温度；320 bp 条带为 PRRS；167 bp 条带为 HCV
图 4 多重 RT-PCR 一步法最佳循环次数的测定
M 为 100 bp λDNA Marker；1、2 为 52℃ 30 min，94℃ 2
min，1 个循环 ；94℃ 30 s，58℃ 30 s，72℃1 min，30 个循环
（1）和 35 个循环（2）； 72℃延伸 10 min；320 bp 条带为 PRRS；
167 bp 条带为 HCV
图 5 多重 RT-PCR 一步法敏感性的测定
M 为 100 bp λDNA Marker；1 ~3，5 ~7 为临床样品核酸
10-6~10-1；320 bp 条带为 PRRS；167 bp 条带为 HCV
图 6 多重 RT-PCR 一步法检测临床样品
M 为 100 bp λDNA Marker；1~4 为临床样品 ；1、3 和 4 为疑
似 HCV；2 为疑似 PRRS；320 bp 条带为 PRRS；167 bp 条带
为 HCV
孔繁德等：多重 RT-PCR一步法技术同时检测猪瘟病毒和蓝耳病病毒
方法的建立以及初步应用 115
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2009年第 1期
则没显示特异性条带 ， 此结果与所采集的生猪
HCV 抗体和 PRRS 抗体检测结果完全相符（采用金
标试纸条检测）。
3 讨论
聚合酶链式反应 （PCR）技术已渗透到生命科
学的各个领域。使原本诊断十分困难的某些传染病
和遗传病在分子水平上得到了确诊。随着该技术的
广泛应用， 由基本的 PCR 原理衍生出的改进方法
不断出现，其中多重 PCR 技术（Multiplex PCR）对临
床诊断的潜力是十分巨大的。多年来人们梦想能有
一种高度特异敏感和简便的方法能同时将需要鉴
别诊断的传染病或遗传病一次性地得到确诊，多重
PCR 技术的出现，使之成为了可能。 作为各种生命
遗传物质的核酸序列是完全不同和高度保守的，其
特异性决定了各物种的特殊性。在各生物体基因组
中存在 20~30 个连续的互补或相同的碱基 （bp）的
概率的可能性几乎不存在。 同时 DNA 聚合酶具有
极高的复制准确活性， 所以多重 PCR 反应体系中
各引物交叉结合而非特异性扩增的可能性十分小，
这样就保证了多重 PCR 的特异性和敏感性。 理论
上只要条件合适，引物对的数量可以不限，目前有
扩增 9 条片段的记录。 多重 PCR 不但可以同时扩
增几条目的基因，而且也节省了试剂，减少了污染
的机会。 自从 1988 年 Chamberlain[10]首先报道用多
重 PCR 诊断 DMD （Duchenne 型肌营养不良症 ）以
来，近年来有关文献已有百篇以上。
本研究建立的多重 RT-PCR， 能在一次反应中
对所怀疑的由 HCV 和 PRRSV 2 种病原体引起的传
染病进行病原诊断，且特异、敏感、快速、简便，具有
广阔的应用前景。 在进行多重 RT-PCR 的研究中，
引物的设计至关重要。 本研究设计的 2 对引物，一
方面它们的 GC 含量和 Tm 值相近 ， 而且通过
DNAstar 和 NCBI 网站进行了同源性 、二级结构、特
异性等分析，另一方面扩增片段长度的不同（CSFV
167 bp、PRRSV 320 bp）， 使得 HCV 和 PRRSV 在相
同条件下能同时得到很好的扩增，且由于电泳后扩
增条带相差 153 bp，能很好区分开 ，使该多重 RT-
PCR 在结果判定时更简便、直观和实用。
猪繁殖障碍是目前困扰集约化猪场生产的原
因之一，而造成繁殖障碍的疾病很多，包括细菌病、
病毒病等等。猪瘟和猪蓝耳病是目前国内许多猪场
的常见的造成猪繁殖障碍的最重要的两种病毒病，
且一旦出现混合感染将影响这 2 种疾病疫苗的免
疫效果，从而出现所谓的持续感染，对疾病的控制
和消灭都将造成严重的影响。因此这 2 种疾病的早
期诊断对于这 2 种疾病在一些猪场的净化尤为重
要。
本研究中由于猪瘟和猪蓝耳病均为 RNA 病
毒，而 RNA 又容易降解，为了避免繁杂步骤 ，防止
污染， 本实验采用反转录和 PCR 扩增同时在一管
里进行的方法，而且对临床混合感染的样品 ，只要
一次同时提取它们的 RNA 核酸， 只就大大节约可
时间和试剂， 也避免了反转录再 PCR 多个环节造
成污染的机会。
本方法的建立，尤其对于这 2 种疾病的早期诊
断具有十分重要的意义，这对于控制和消灭这两种
疾病和加强口岸检疫都必将发挥重要作用。
参考文献
1 陆承平主编，兽医微生物学（第 4 版）[M].北京：中国农业出版
社，2007，443~464.
2 费恩阁主编，动物传染病学[M].长春：吉林科学技术出版社，
1995，176~180.
3 殷震，刘景华主编 .动物病毒学（第 2 版）[M].北京：科学出版
社，1997，652~664.
4 Narita M，Kawashima K，et al. Vet Pathol，2000，37：402~408.
5 Meng XJ，et al. J Gen Virol，1995，76：3181~3188.
6 郭宝清，陈章水，等.中国畜禽传染病，1996，17（2）：1~5.
7 郭宝清，陈章水，刘文兴，等.中国兽医科技，1996，26（3）：3~5.
8 杨建功，王秀君. 湖北畜牧兽医，2007，7：33.
9 彭克高. 云南畜牧兽医，2007，5：6~8.
10 Chamberlain JS. Nucleic Acids Research，1988，16：11141~11156.
11 胡慧，邱昌庆.中国兽医科技，2004，34（6）：33~38.
12 李晓成，张志，洪军，等.中国动物检疫，2007，24（2）：45~47.
13 韩国全，郭万柱，陈俊.四川畜牧兽医，2006，33（1）：34~35.
14 孔繁德，黄印尧，等.中国动物检疫，2003，20（11）：27~29.
15 黄印尧，张长弓，方莹，等.福建畜牧兽医，2002，24（1）：3~4.
16 孔繁德，等.中国兽医科技，2005，35（1）：36~40.
17 陈博文，孙颖杰，等. 中国兽医杂志，1996，22（5）：6~8.
18 娄高明，李雪梅，殷震.中国兽医杂志，1998，24（2）：40~43.
19 张鹤晓，王彩兰，等.中国兽医科技，1997，27（1）：8~10.
20 董永毅，姜平，等. 中国动物检疫，2000，17（4）：24~26.
21 姜平，简中永，等.南京农业大学学报，1996，19（8）：1~8.
116