全 文 ：生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN·研究报告· 2009年第 1期
收稿日期：2008-06-17
基金项目：厦门出入境检验检疫局科技计划项目（XK09-2003）
作者简介：王荣（1982-），男，福建长汀人，硕士研究生，主要从事动物疫病及其防治研究
通讯作者：孔繁德，Tel：0592-5675955，E-mail：kongfd67@163.com
猪瘟（Hog cholera，HC），又称“烂肠瘟”，是由猪
瘟病毒（Hog cholera virus，HCV）引起的猪的一种热
性、高度接触性传染病，其流行广泛 、发病率高、死
亡率高，对养猪业影响颇大 [1~4]。 1984 年，国际兽疫
局（OIE）将其列入 A 类传染病，我国目前将其定为
一类传染病 [5]。 猪繁殖与呼吸综合征（Porcine Repro
ductiveand Respiratory Syndrome，PRRS）是由猪繁殖
与呼吸综合征病毒 （PRRSV）引起的一种严重危害
养猪业的病毒性传染病， 以母猪妊娠后期流产、死
产、产木乃伊胎、弱仔数明显增加、分娩率下降和再
发情延迟、哺乳仔猪高病死率及断奶仔猪严重的呼
吸道症状为特征 [6]。 1987 年美国首先报道了该病的
发生 [7]，目前该病已被国际兽疫局 （OIE）列为需要
通报的 B 类传染病。 近几年，这两种传染病在我国
的流行呈上升的趋势，给广大养殖户的带来巨大的
损失，也使我国养猪业的持续健康发展面临严峻的
挑战。
目前检测这两种病的方法有免疫过氧化物酶
斑点免疫金渗滤法同时检测猪瘟和猪繁殖与呼吸
综合征抗体的研究
王荣 1，2 孔繁德 1 吴德峰 2 徐淑菲 1
（1厦门出入境检验检疫局，厦门 361012；2福建农林大学动物科学学院，福州 351006）
摘 要： 在猪瘟、猪繁殖与呼吸综合征单重斑点免疫金渗滤法的基础上，建立能同时检测 HC 和 PRRS 的双重斑
点免疫金渗滤法。 将提纯的 HC 和 PRRS 抗原同时包被在硝酸纤维膜上， 利用胶体金标记 SPA显色， 当猪血清中含有
HC、PRRS抗体时，则相应的点会显现红色（呈红色斑点），结果易于判断。 且操作简单，耗时短，与猪细小病毒、口蹄疫和
猪伪狂犬病毒阳性血清不发生交叉反应。
关键词： 斑点免疫金渗滤法 猪瘟 蓝耳病 胶体金 检测
Studies on Dot Immunogold Filtration Assay for Detection of
Antibody of Hog Cholera Virus and Porcine Reproductive and
Respiratory Syndrome Simultaneously
Wang Rong1，2 Kong Fangde1 Wu Defeng2 Xu Shufei1
（1Xiamen Entry & Exit Inspection and Quarantine Bureau of P.R.C，Xiamen 361012；2College of Animal Science，Fujian
Agriculture and Forest University，Fuzhou 351006）
Abstract： On the basis of single dot immunogold filtration assay （sDIGFA）for detection of antibody of HC or
PRRS，double DIGFA which could detect HC and PRRS antigen simultaneously was established. The purified antigens
of HCV and PRRS were coated on nitrocellulose （NC）membrane，and staphylococcal protein A （SPA）labelled with
colloidal gold was used for reaction reagent. As swine sera contain both HC and PRRS antibodies，the color of the
positive dots （red dots）were so bright that the results could be easily and quickly determined. Furthermore，this method
had a better specificity without cross-reaction with positive sera to PPV、FMD and PRV.
Key words： Dot immunogold filtration assay（DIGFA） HC PRRS Immunogold Detection
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2009年第 1期
单层试验 （IPMA）、间接荧光抗体试验 （IFA）、反转
录-聚合酶链式反应（RT-PCR）、酶联免疫吸附试验
（ELISA）等，这些方法都有准确、特异性高等特点，
不过由于专业化程度太高以及检测成本昂贵，只有
配备专门的仪器和技术人员才能开展工作，所以不
适合在生产上得到推广。 斑点免疫金渗滤（dot im-
munogold filtraton assay，DIGFA） 技术是以硝酸纤维
膜为固相，以金溶胶为标记物，通过渗滤或毛细管
作用使抗原抗体间快速反应的一种固相免疫学方
法，它的操作简便，成本较低，检测时间短，无须专
门的仪器设备，而且结果易于判断，比较适合在生
产上使用 [11，12]。
本研究是在 HC 和 PRRS 单重斑点免疫金渗滤
法的基础上 [13~15]，利用 SPA 金的特性 ，研究能同时
检测 HC 和 PRRS 抗体的斑点免疫金渗滤法。
1 材料
1.1 试剂和仪器
氯化金（分析纯 ，上海市试剂总厂化学试剂一
厂）、柠檬酸三钠（分析纯）、碳酸钾（分析纯）、牛血
清白蛋白 （BSA，华美生物工程公司 ）、冻干葡萄球
菌 A 蛋白 （SPA，以色列 PROSPEC 公司 ）；洗涤液
（含 0.05％Tween-20 的 0.01 mol/L pH7.2 的 PBS 缓
冲液）、 封闭液 （含 1％BSA，0.5％Tween-20 的 0.01
mol/L pH7.2 的 PBS 缓冲液）、胶体金稀释液（含 1％
BSA，0.05％PEG20000，5％蔗糖 ，0.05%Tween-20 的
0.01 mol/L pH7.2 的 PBS 缓冲液 ）；硝酸纤维膜 （德
国 Schleicher&schuell 公司产品 ，0.45 μm）、 吸水纸
（德国 Whatman 公司产品）；Suprafuge22 高速冷冻离
心机 （德国 Heraeus 公司提供 ）；Toledo PG603-S 电
子分析天平 （瑞士 Mettler 公司提供）；DF-1 集热式
磁力搅拌器。
1.2 HC 和 PRRS 抗原
由本实验室制备保存的细胞疫苗毒。
1.3 已知猪血清
猪抗 HC 和 PRRS 的阳性血清和阴性血清 ，各
20 份， 共 80 份， 猪抗 HC 和 PRRS 均为阳性的血
清，10 份，为由本实验室采集的经疫苗免疫并经过
IDEXX 公司的 ELISA 试剂盒检测确认为阳性或阴
性的血清；猪伪狂犬病免疫阳性血清、猪细小病毒
病免疫阳性血清和猪口蹄疫免疫阳性血清各 8 头
份。
2 方法
2.1 HC 和 PRRS 抗原提纯
将 HC 和 PRRS 弱毒细胞培养液分别反复冻融
3 次，5 000 r ／min 离心 30 min， 取上清液装入透析
袋中 ， 置于 0.01 mol/L pH7.4PBS 缓冲液中透析过
液，其间换液数次，直到细胞培养液透明清亮为止。
然后用紫外分光光度计测其在 260 nm 和 280 nm
处光密度。 根据经验和公式计算出 HC 和 PRRS 病
毒蛋白液的蛋白含量分别为 2.73 mg/ml 和 0.8947
mg/ml。 分装-20℃冻存备用。 若浓度太稀，可用聚乙
二醇 6000 等进行浓缩。
2.2 胶体金的制备
按柠檬酸三钠还原法制备金溶胶： 取 1%氯金
酸 1 ml 加入到 100 ml 超纯水中， 所得氯金酸溶液
浓度为 0.01%，置于带冷凝装置的烧瓶中加热至沸
腾， 磁力加热搅拌下快速加入 1%柠檬酸三钠水溶
液 2.8 ml，继续加热直至溶液呈葡萄酒色为止。 经
紫外分光光度计测其吸收峰在 520 nm 处， 得到的
胶体金颗粒直径约为 20 nm 左右，冷却后置于棕色
瓶中 4℃冰箱保存。
2.3 SPA 胶体金的制备
取需制备量的胶体金溶液， 用 0.1 mol/L K2CO3
调其 pH 至 6.0。 然后按每 ml 胶体金溶液加入 15 μg
SPA， 磁力搅拌混合均匀 ，30 min 后加入 10%BSA
至终浓度 1%， 继续搅拌，15 min 后再加入 5%PEG
（MW20000）至终浓度 0.1%，再继续搅拌 15 min，最
后放置 4℃冰箱，静置过夜。
次日将标记好的 SPA金 5 000 r/min离心 10 min，
取上清液 15 000 r/min 离心 30 min，弃上清。沉淀用
重悬缓冲液 （含 1%BSA，0.05%PEG20000，0.05%
Tween-20，0.01 mol/L pH7.2 的 PBS 缓冲液 ）恢复至
原体积。 15 000 r/min 离心 30 min，弃上清。 沉淀用
胶体金稀释液 （含 1％BSA，0.05％PEG20000，5％蔗
糖的 ，0.05%Tween-20，0.01 mol/L pH7.2 的 PBS 缓
冲液）恢复至原体积的十分之一，置 4℃冰箱备用。
2.4 DIGFA 法
2.4.1 反应盒的准备 反应盒为塑料方形小盒，大
小为 4.8 cm×3 cm×0.7 cm，分底和盖两部分 ，盖面
有直径 0.5 cm 圆孔，盒内有两层，朝盖的为硝酸纤
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维素膜（NC 膜），NC 膜下紧贴着特制的吸水纸垫。
2.4.2 DIGFA 操作步骤 在圆孔内 NC 膜上点三
点，一点为 HC 抗原 1 μl，一点为 PRRS 抗原 1 μl，
它们作为检测点， 另一点为猪血清 1 μl 作为质控
点；室温干燥后加入 100 μl 封闭液 ，渗入后加入待
检血清 100 μl；渗入后加入洗涤液 100 μl，渗入后
加 SPA 胶体金 100 μl； 渗入后加入洗涤液 100 μl，
洗去未结合的 SPA 胶体金。 5 min 内若在膜上出现
红色斑点即为阳性，否则为阴性。 质控点为试验有
效的标志，应出现红色斑点，否则该膜无效，应重新
点膜。
3 结果
3.1 DIGFA 最适条件的选择
3.1.1 NC 膜的选择 将实验室现有的做 DIGFA
的 NC 膜按厚薄分为两组，分别做 HCV&PRRS 双重
斑点免疫金渗滤法的效果实验，对比图 1 和图 2 的
实验效果来看薄 NC 膜上包被的抗原在封闭、洗涤
过程中容易被冲掉 ，包被效果不好 ，而厚的 NC 膜
没有出现上述情况， 所以在本实验中应选择厚 NC
膜。 根据图 1 中对比不同厚 NC 膜的实验效果，可
以看出德国 Schleicher&schuell 公司的 FT045 的效
果最好。 在实验过程中，发现 NC 膜的孔径对实验
影响也比较明显， 一般 0.2 μm 孔径的膜渗透速度
较慢，特别是遇到比较浓稠的血清时会出现难渗透
过去现象，而 0.6 μm 孔径的膜则渗透速度过快，会
造成封闭效果不佳或血清与抗原的反应不完全 ，
0.45 μm 孔径的膜相对于上述两种膜比较不会出
现那些情况，所以应选 0.45 μm 厚膜用于 DIGFA。
3.1.2 HC 和 PRRS 最佳点样抗原浓度的选择 分
别以 0.72、0.34、0.17、0.085、0.043、0.022 mg/ml 6 种
浓度的 HC 抗原 0.6 μl 点样， 纯化 HC 抗原的最低
检测量为 0.022 mg/ml， 抗原量最小而斑点颜色
最清晰的为 0.085 mg/ml 的点样处 ， 所以浓度为
0.085 mg/ml 的 HC 抗原点样 0.6 μl，为最佳包被量
（图 3）。 分别以 0.8947、0.4424、0.2212、0.1106、0.0553
和 0.0277 mg/ml 6 种浓度的纯化 PRRS 抗原 0.6 μl
点样 ，结果显示 ，纯化 PRRS 抗原的最低检测量为
0.0553 mg/ml， 抗原量最小而斑点颜色最清晰的为
0.2212 mg/ml 点样处 。 所以将 0.6 μl 0.2212 mg/ml
PRRS 抗原作为 PRRS 抗原最佳包被量（图 3）。
图 1 厚 NC 膜的效果比较实验
1．孔径 0.45 μm，型号 FT045(Schleicher&schuell 公司 )；
2．孔径 0.22 μm，型号 FT045(Schleicher&schuell 公司 )；
3．孔径 0.6 μm，型号 FT060(Schleicher&schuell 公司）；
4．孔径 0.45 μm（whatman 公司）
图 2 薄 NC 膜的效果比较实验
1.孔径 0.6μm，型号 Protran BA90(Schleicher&schuell 公司 )；
2．孔径 0.45μm(whatman 公司 )；
3．孔径 0.45μm，型号 FT045(Schleicher&schuell 公司 )；
4．商品名震旦；
5．孔径 0.2μm（PALL 公司）；
6．孔径 0.22μm（MILLIPORE 公司）
图 3 HC 和 PRRS 最佳点样抗原浓度的选择
1 号、2 号板是 HC 最佳点样抗原浓度的选择
（1、2 号板中对应相同编号的抗原包被量相同 ，1 号板检测的是
HC 阳性血清 ，2 号板检测的是 HC 阴性血清 ； 中间一点为浓度
0.72 mg/ml HC 抗原 ；1 ~5 依次为浓度 0.34、0.17、0.085、0.043
和 0.022 mg/ml HC 抗原；C.对照）
3 号、4 号板是 PRRS 最佳点样抗原浓度的选择
（3、4 号板中对应相同编号的抗原包被量相同 ，3 号板检测的是
PRRS 阳性血清，4 号板检测的是 PRRS 阴性血清；中间一点为浓
度 0.8947 mg/ml PRRS 抗原 ；1 ~5 依次为浓度 0.4424、0.2212、
0.1106、0.0553 和 0.0277 mg/ml PRRS 抗原；C．对照）
王荣等：斑点免疫金渗滤法同时检测猪瘟和猪繁殖与呼吸综合征抗体的研究 109
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2009年第 1期
3.1.3 封闭液的选择 点抗原的 NC 膜分别用含
1% BSA 的 0.01 mol/L pH7.2 PBS、 含 0.05%Tween-
20 的 0.01 mol/L pH7.2 PBS、含 0.5% BSA 和 0.05%
Tween-20 的 0.01 mol/L pH7.2 PBS、 含 1% BSA 和
0.05%Tween-20 的 0.01 mol/L pH7.2 PBS、 含 0.5%
BSA 和 0.5%Tween-20 的 0.01 mol/L pH7.2 PBS 和
含 1% BSA 和 0.5%Tween-20 的 0.01 mol/L pH7.2
PBS 进行封闭 ，结果用含 0.5% BSA 和 0.5%Tween-
20 的 0.01 mol/L pH7.2 PBS 与 用 含 1% BSA 和
0.5%Tween-20 的 0.01 mol/L pH7.2 PBS 封闭的效
果比较好，斑点显色清楚，背景颜色浅（图 4）。
3.1.4 HC 和 PRRS 抗体同时检测的效果实验 分
别以 0.4424、0.2212、0.1106 mg/ml 3 种浓度的 PRRS
纯化抗原和 0.34、0.17、0.085 mg/ml 3 种浓度的 HC
纯化抗原 0.6 μl 点样， 然后检测 HC 和 PRRS 抗体
都呈阳性的猪血清，结果显示，双重 DIGFA 在同时
检测 HC 和 PRRS 抗体时能达到单重 DIGFA 同样
的检测效果。
3.2 特异性试验
用猪蓝耳病阳性血清 20 头份， 猪瘟阳性血清
9 头份 ，猪瘟 、蓝耳病都为阳性血清 10 头份 ，猪蓝
耳病阴性血清 3 头份，猪瘟阴性血清 3 头份 ，猪伪
狂犬病阳性血清、猪细小病毒病阳性血清和猪口蹄
疫阳性血清各 8 头份，进行 DIGFA 检测，结果用蓝
耳病阳性血清则包被蓝耳病抗原的点显色，包被猪
瘟抗原的点不显色；用猪瘟阳性血清则包被猪瘟抗
原的点显色，包被蓝耳病抗原的点不显色；用猪瘟、
蓝耳病都为阳性血清则两点都显色。其余血清两点
都不显色。
3.3 重复性实验
取人工免疫的猪伪狂犬病血清 3 份、临床采集
经检测猪瘟和蓝耳病都呈阳性和阴性猪血清各 5
份，与同一批 SPA 胶体金同时重复做 3 次。 试验结
果阳性的全为阳性，阴性的全为阴性。
3.4 稳定性试验
将点抗原的 NC 膜干燥后封口放入干燥剂和
SPA 胶体金冻干， 置于 4℃冰箱保存，3、6、9、12 和
15 个月后重复检测， 测定结果颜色与重复试验结
果一致，效果良好。
4 讨论
4.1 斑点免疫金渗滤技术的原理和操作步骤与
ELISA 相似。 加血清样品于固定有配体的硝酸纤维
素膜上，通过渗滤在膜中形成抗原-抗体复合物，洗
涤渗滤后，再加液体的胶体金标记抗体（这里加的
是 SPA 金）。 当结果为阳性时，在膜上固定有抗原-
抗体-胶体金标记标记抗体复合物而呈现红色斑
点；当结果为阴性时，则不形成红色斑点。
4.2 当前猪病的趋势是以混合感染为主， 因此多
重检测方法的建立和应用也将成为一个趋势，特别
是快速、准确、特异的多重检测方法的建立将提高
猪病的诊断效率， 从而能及时制定相关的防治措
施，以降低猪病给养猪业带来的损失。
4.3 目前用于 HC 和 PRRS 检测的方法主要有间
接血凝试验、 免疫荧光试验和酶联免疫吸附试验
（ELISA）等，ELISA 是比较常用的方法，因为它具有
图 4 封闭液的选择
1. 0.01 mol/L,pH7.2 PBS， 含有 1%BSA 和 0.5%tween-20；
2. 0.01 mol/L,pH7.2 PBS，含有 1%BSA 和 0.05%tween-20；
3. 0.01 mol/L,pH7.2 PBS，含有 0.5%BSA 和 0.5%tween-20；
4. 0.01 mol/L,pH7.2 PBS， 含有 0.5%BSA 和 0.05%tween-
20；5. 0.01 mol/L,pH7.2 PBS， 含有 1%BSA；6. 0.01 mol/L,
pH7.2 PBS，含有 0.05%tween-20
图 5 HC&PRRS 双重 DIGFA 检测的效果实验
1~3 为包被 PRRS 抗原的点，抗原浓度依次为 0.4424、0.2212 和
0.1106 mg/ml ；4~6 为包被 HC 抗原的点 ， 抗原浓度依次为
0.34、0.17 和 0.085 mg/ml HC 抗原；中间一点为对照
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快速 、敏感 、特异等优点 ，但斑点免疫金渗滤法与
ELISA 相比 ，具有操作简便 、成本低 、耗时短的优
势，更有利于在生产上得到推广。 本研究的 HC&P-
RRS 双重斑点免疫金渗滤法是基于本实验室已成
功建立 HC 和 PRRS 单重斑点免疫金渗滤法法的基
础上创建的，本方法在保持与单重斑点免疫金渗滤
法同样检测效果的同时 ， 可以同时检测 HC 和
PRRS 两种抗体 ，而且特异性高、重复性好，可以进
一步优化后做成试剂盒在生产上推广，这样将大大
提高 HC 和 PRRS 的检测效率。
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