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生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2011 年第 8 期
绿色糖单孢菌木质素过氧化物酶的分离纯化及鉴定
丁梦璇1 刘炳梅1 张国庆2 翟楠1 谢响明1 王贺祥2
(1北京林业大学生命科学与技术学院，北京 100083;2中国农业大学生物学院农业生物技术国家重点实验室，北京 100193)
摘 要: 木质素过氧化物酶是一种重要的具有工业应用前景的木质素降解酶，但已报道真菌来源的木质素过氧化物酶
只能在酸性低温条件下发挥作用，限制了其进一步的工业应用。通过培养一株耐热耐碱放线菌———绿色糖单孢菌发酵产酶，
采用 DEAE-Cellulose，CM-Cellulose和 Superdex 75 凝胶过滤层析等分离纯化方法，得到一种具有耐热耐碱特性的木质素过氧化
物酶。经凝胶电泳检测其为单一蛋白，分子量为 41 kD。最终纯化倍数达到 20 倍，活性回收率为 6%。采用 LTQ法对纯酶进
行蛋白质归类鉴定，得到其部分氨基酸片段，为该酶的进一步分子生物学研究奠定基础。
关键词: 绿色糖单孢菌 耐热耐碱 木质素过氧化物酶 分离纯化 蛋白质鉴定
Purification and Identification of Lignin Peroxidase from
Saccharomonospora viridis
Ding Mengxuan1 Liu Bingmei1 Zhang Guoqing2 Zhai Nan1 Xie Xiangming1 Wang Hexiang2
(1College of Biologic Sciences and Biotechnology，Beijing Forestry University，Beijing 100083;
2State Key Laboratory for Agrobiotehnology and Department of Microbiology，China Agricultural University，Beijing 100193)
Abstract: Lignin peroxidase (LiP)is a promising lignase in industry application． However，the reported lignin peroxidase
excreted by fungus can show activity only under the low temperature and acid condition． This study cultures one actinomycete of
thermostability and alkali tolerance，Saccharomonospora viridis，to ferment and produce a LiP with thermostability and alkali toler-
ance． The LiP is purified respectively by DEAE-Cellulose ion exchange chromatography，CM-Cellulose ion exchange chromatogra-
phy and gel filtration (Superdex 75)using fast protein liquid chromatography (FPLC)． SDS-PAGE showed the purified LiP to be
a homogeneous protein with molecular weight of 41 kD． The purification fold reaches 20 and the recovery rate of enzyme activity
enhanced 6% ． The partial amnion acid sequence of the LiP was identified by LTQ． This work is to lay foundation on the microbiol-
ogy research of LiP．
Key words: Saccharomonospora viridis Thermostability and alkali tolerance Lignin peroxidase Purification Protein identifi-
cation
收稿日期:2011-04-13
基金项目:国家自然科学基金项目(30870028) ，北京市优秀博士论文指导项目科技项目(YB20091002201)
作者简介:丁梦璇，女，硕士研究生，研究方向:资源与环境微生物;E-mail:mengxuanD@ 163． com
通讯作者:谢响明，男，教授，博士生导师，研究方向:资源与环境微生物;E-mail:xiangmingx@ sina． com
木质素是一类由苯丙烷单元通过醚键和碳碳键
连接而成、聚酚类三维网状的天然高分子化合
物［1 － 3］，与纤维素、半纤维素一起组成植物细胞壁
的基本构架。植物细胞受到有害物质的侵扰时，纤
维素、半纤维素很容易被分解，而木质素有分子大、
结构复杂的特点，在自然环境中很难被直接分解成
小分子化合物，能保护植物细胞结构的完整和硬
度［4］。有研究表明，木质素的降解在次级代谢过
程，需要一系列的胞外分泌酶系对其作用后才能被
降解［5］。因此，木质素的降解成为生物降解过程的
关键步骤［6］。
自然界中，真菌在木质素的降解中起主导作用。
但真菌生长周期长，已知由真菌分泌的木质素过氧
化物酶一般为酸性，且不耐热，不能满足工业上高温
碱性环境的要求［7］。细菌有来源广泛、生长周期
短，特别是放线菌，不仅可以在初级代谢阶段降解木
2011 年第 8 期 丁梦璇等:绿色糖单孢菌木质素过氧化物酶的分离纯化及鉴定
质素，也可以在降解作用的后期对真菌降解木质素
产生的低分子量物质进行代谢［8］，而且放线菌产生
的木质素过氧化物酶一般为碱性，某些嗜热放线菌
还能分泌耐热耐碱的胞外木质素过氧化物酶，具有
广泛的温度及 pH 适应性，适合用于大规模工业降
解木质素条件的要求。目前对放线菌来源的木质素
过氧化物酶的研究主要集中在诱导产酶［9］、酶学性
质［10］、漂白效果［11］、作用方式和机理等方面［12］，但
对其蛋白质结构、系统发育进化分析、耐热耐碱机理
还鲜有报道。本研究在前期发酵产酶的基础上，运
用离子交换层析技术对绿色糖单孢菌的胞外木质素
过氧化物酶进一步纯化并对其进行蛋白质归类检
定，以获取蛋白质的一级结构，为分析其系统发育进
化关系，该酶今后在耐热耐碱分子基础方面的研究
及工业上的开发利用奠定基础。
1 材料与方法
1． 1 菌种来源
绿色糖单孢菌(Saccharomonospora viridis)购自
中国科学院微生物研究所菌种保藏中心，为卫生部
药品生物制品检定所从波兰引进。
1． 2 方法
1． 2． 1 木质素过氧化物酶的活性分析 在 Tunc-
er［13］的方法基础上，以 2，4-二氯苯酚(2，4-DCP，16
mmol /L)为底物，在 250 μL 反应体系中，先取 0． 1
mol /L，pH7． 2 的 Tris-HCl 缓冲液、16 mmol /L 的 4-
氨基替吡啉、样品各 50 μL，在 45℃水浴锅中预热
1 min，迅速加入 50 μL 过氧化氢(H2O2，30%)启动
反应，在 510 nm波长处检测 1 min 内反应体系的吸
光值的变化量。
1． 2． 2 蛋白质含量检测 采用紫外吸收法，根据蛋
白质中的络氨酸和色氨酸残基在 280 nm 处有光吸
收，溶液中蛋白质的含量可以由吸光值读出。
1． 2． 3 蛋白质纯化 本课题组成员杨暖等［10］对绿
色糖单孢菌胞外酶进行了发酵罐产木质素过氧化物
酶的发酵条件优化及发酵工艺等方面研究，在此基
础上采用相同方法获得绿色糖单孢菌发酵产生的培
养液。培养液经八层灭菌棉纱过滤，于 4℃、8 000
r /min离心 20 min，取上清液进行二次硫酸铵盐析。
二次盐析的沉淀为含目的蛋白混合物，用 0． 1 mol /L
的 PBS缓冲液(pH7． 2)溶解后，于 4℃去离子水中
透析 12 h，至完全脱盐。用 10 mmol /L 的 Tris-HCl
缓冲液调节 pH至 7． 2 后，上样与 DEAE-Cellulose阴
离子交换柱(2． 5 cm × 20 cm)层析，上样后先用 10
mmol /L的 Tris-HCl 缓冲液(pH7． 2)洗脱未吸附的
蛋白，再用含有 300 mmol /L、1 mol /L、1． 5 mol /L
NaCl的 Tris-HCl缓冲液进行分段洗脱。检测到 D3
峰组分的活性最大(图 1) ，合并 D3 峰有活性各管的
洗脱液，4℃去离子水中透析 12 h，超滤浓缩至 500
mL，用 10 mmol /L 的 NaAC 缓冲液调节 pH 至 5． 2
后，上样与 CM-Cellulose阳离子交换柱(1． 5 cm × 20
cm) ，再用含有 0 － 2 mol /L NaCl 的 NaAC 缓冲液进
行梯度洗脱。检测到 C1 峰组分的活性最大(图 2) ，
合并 C1 峰有活性各管的洗脱液，用同样的方法透
析，冻干后用 0． 15 mol /L 的 NH4 HCO3缓冲液解调
节 pH至 8． 0，上样于 Superdex 75 凝胶柱(1． 5 cm ×
30 cm) ，用同样的缓冲液平衡凝胶并洗脱，合并活
性峰 Q1(图 3)。
1． 2． 4 SDS-PAGE 鉴定 采用 SDS-PAGE 凝胶电
泳检测木质素过氧化物酶活性组分纯度。取 10 μL
纯化的木质素过氧化物酶样品上样于 SDS 凝胶，浓
缩胶采用恒压 80 V，分离胶采用恒压 120 V。电泳
完用考马斯亮蓝 G-250 染色液染色 0． 5 h，对比蛋白
分子量标准进行酶分子分子量的计算。
1． 2． 5 蛋白质归类鉴定 将纯化后的木质素过氧
化物酶样品浓缩冻干，取约 2 μg 的干粉溶解在 35
μL 25 mmol /L的 NH4HCO3溶液中，向其中加入 100
mmol /L的二硫苏糖醇，在 37℃水浴孵育 3 h，加入 5
μL 450 mmol /L 新鲜配制的碘乙酰胺，避光保存
0． 5 h。按照蛋白质内切酶与混合体系的比例为
1∶ 20的比例加入测序级蛋白质内切酶，在 37℃水
浴 8 － 12 h。加入 3 μL甲酸调节 pH 低于 3 后，用
100%乙腈冲 3 － 5 次脱盐回收蛋白，然后用超纯
水充分洗脱乙腈。最后用 50 μL 的复溶液充分溶
解肽段并立即进行质谱鉴定。复溶液含有乙腈、
水和甲酸，三者体积比为 2 ∶ 95 ∶ 0． 1。采用 LTQ 法
对混合肽段进行质谱分析，由上海交通大学分析
测试中心完成。
2 结果与分析
2． 1 DEAE-Cellulose阴离子纯化结果与分析
初样品经过 DEAE-Cellulose 阴离子交换层析，
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分段洗脱后得到 3 个吸收峰:D1、D2 和 D3，洗脱曲
线如图 1 所示。
图 1 LiP粗样品的 DEAE-Cellulose
阴离子交换层析洗脱曲线
由图 1 洗脱峰可知，D1 峰为经缓冲液洗脱下
来、未吸附在凝胶柱上的样品蛋白;D2 峰和 D3 峰
分别代表经洗脱分离得到的两个组分。用木质素过
氧化物酶的测酶活方法对后两个组分分别进行检
测，均有木质素过氧化物酶活性，其中 D3 峰组分的
活性最高，且 D3 峰组分的比活力明显高于 D2 峰组
分，由此分析 D3 峰组分为含有木质素过氧化物酶
的主要组分。
2． 2 CM-Cellulose阳离子纯化结果与分析
收集 D3 峰组分，进行 CM-Cellulose阳离子交换
柱层析，线性洗脱后得到两个吸收峰，洗脱曲线见
图 2。
图 2 LiP-D3 峰组分的 CM-Cellulose
阳离子交换柱层析洗脱曲线
由图 2 洗脱峰可知，经线性洗脱得到两个洗脱
峰组分:C1 和 C2，采用木质素过氧化物酶的酶活测
定方法对这两个组分分别检测，均有木质素过氧化
物酶活性，其中 C1 峰组分的活性最高，且 C1 峰组
分的比活力明显高于 C2 峰组分，由此分析 C1 峰组
分是含有木质素过氧化物酶的主要组分。
2． 3 Superdex 75 FPLC纯化结果与分析
收集 D3C1 活性组分，超滤后进行 Superdex 75
FPLC凝胶层析，洗脱后只有一个吸收峰 Q1，洗脱曲
线见图 3。
图 3 LiP D3C1 组分的 FPLC凝胶过滤层析柱洗脱图
由图 3 洗脱峰可知，经分子筛洗脱后，样品组分
单一，测定组分的酶活力及蛋白质含量，经计算得到
的比活力与前三步纯化后的相比，分子筛纯化后的
比活力最高。
2． 4 SDS-PAGE检测结果与分析
四步纯化后分离得到的木质素过氧化物酶，
经 SDS-PAGE 电泳检测 D3C1Q1 组分呈现单条带
(图 4) ，表明为单一蛋白质，分子量为 41 kD，这与
其他已报道的真菌木质素过氧化物酶的分子量
相似［14］。
图 4 LiP D3C1Q1 组分的 SDS-PAGE电泳结果
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2． 5 纯化结果分析
绿色糖单孢菌分泌的胞外酶液经硫酸铵盐析、
DEAE-Cellulose阴离子交换层析、CM-Cellulose 阳离
子交换层析和 Superdex 75 凝胶过滤，得到纯化的木
质素过氧化物酶，其纯化效率如表 1 所示。
表 1 绿色糖单孢菌 LiP的纯化效率
纯化步骤
总蛋白
(mg)
比活力
(U /mg)
总活力
(U)
回收率
(%)
纯化倍数
粗酶液 8004． 3 0． 0169 135． 7 100． 0 1． 0
DEAE-Cellulose 1290. 0 0． 0638 82． 3 60． 4 3． 8
CM-Cellulose 226． 9 0． 1639 37． 2 27． 4 9． 7
Superdex 75 24． 1 0． 338 8． 142 6. 0 20. 0
由表 1 可知，纯化后木质素过氧化物酶的比活
力增加了 20 倍，回收率为 6%。纯化后的比活力有
明显增加，但活性回收率较低，分析原因可能是绿色
糖单孢菌分泌的胞外木质素过氧化物酶的含量较
少，且在纯化过程中会有部分损耗，导致活性回收率
不高;木质素过氧化物酶的酶活测定方法不够灵敏，
所显示的比活力结果会低于真实值;由图 1 和图 2
可知，在分离纯化过程中，分离的其他组分也有木质
素过氧化物酶活性，如 D1、D2 和 C2 等组分。已有
报道表明，木质素过氧化物酶有较多的同工酶，由此
可推测其他含木质素过氧化物酶活性的组分含有木
质过氧化物的同工酶。纯化过程中未对这些组分进
行合并收集，导致活性回收率的降低。
2． 6 蛋白质归类鉴定
经上海交通大学分析测试中心分析，所鉴定的
蛋白质中含有一段带有 349 个氨基酸的多肽链，将
该氨基酸序列与已知的木质素过氧化物酶氨基酸数
据库分析，最高同源性可达到 91． 73%，由此可鉴定
混合肽中含有木质素过氧化物酶蛋白的部分肽段，
可证明纯化的酶蛋白属于木质素过氧化物酶。氨基
酸质谱分析信息如图 5 所示。
运用 Geneva 大学的 ExPASy 在线服务器(ht-
tp:/ /us． expasy． org / tool /protparam． html) ，分析 LiP
部分氨基酸片段的理化性质，结果归纳如下:LiP 片
段由 349 个氨基酸残基组成;分子质量估计为
38 071． 0;理论等电点为 6． 09;片段中带负电荷的氨
NLYNSARVLP ILALSLLASA GPLETREPVP
GIIDDILTGV LSGVGQLIKD VLSGAKSAID
DTKSNKPLTC SLLTTDKCCI WWDVSDELTK
LFVNQDLTCN DNARAAVRNG THDAGAWEQG
QTHGGADGSL LNDFGEIERP ENKGLESVRL
VLRDCQKKFK CGYADLAQYA HNHASISCPK
GPRCRTGVGR KDATQAAPKG FLPDTRSPAD
ELIALFERKG FTPHDLAALL GAHSTARQRF
VDTTPEVADK PLDTTIGVWD VEFYNDTLNN
PSGGTPSQKV FVLPSDKVLS VHPKCSDEWK
SFVGDQKHWW EDYAKAYCRM SLTGCVTKDQL
NNLVDCTKTL PASRKVFP
图 5 氨基酸质谱分析结果
基酸残基数共计 44 个，主要为天冬氨酸和谷氨酸，
带正电荷氨基酸残基共计 40 个，主要为精氨酸、赖
氨酸、组氨酸;其中含碳原子 1 675 个，氢原子 2 644
个，氮原子 470 个，氧原子 518 个，硫原子 13 个，原
子总数为 5 320;摩尔消光系数为 650 nm /Mcn;评估
的半衰期为大于 10 h(埃希氏杆菌) ;序列的 N端判
定为天冬氨酸(Asn) ;不稳定指数为 23． 58。判断该
种蛋白质归类为稳定型。
3 讨论
本研究通过对绿色糖单孢菌分泌的胞外耐热耐
碱木质素过氧化物酶进行四步纯化，得到电泳纯的
木质素过氧化物酶。但由于绿色糖单孢菌分泌的木
质素过氧化物酶含量较低，在纯化过程中会有部分
损失;木质素过氧化物酶的酶活测定方法不够灵敏;
粗酶液中的木质素过氧化物酶含有其它同工酶，在
纯化过程中分离弃去，并未收集等原因导致活性回
收率不高，使蛋白纯化工作更繁重，不能高效快速完
成。因此，针对测定碱性过氧化物酶酶活的更为灵
敏的方法，是下一步研究的关键。
本研究最终获得了绿色糖单孢菌分泌的胞外
耐热耐碱木质素过氧化物酶蛋白的部分氨基酸序
列。在此基础上运用在线软件分析其理化性质，
结果显示，片段分子量约为 38 kD，小于经 SDS-
PAGE 试验显示的分子量 41 kD，但两值较为接近，
进一步说明该木质素过氧化物酶的实际分子量大
于 38 kD，约为 41 kD。分析得到的摩尔消光系数
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为 650 nm /Mcn，可根据国际单位的计算公式来确
定酶活性，得到酶活性的一个理论值，在原有测酶
活的方法基础上进行测定条件的优化，从而获得
更精确的测定酶活方法，对后续的研究提供一个
更精确的鉴定标准。
在成功分析氨基酸片段的理化性质的基础上，
可以运用更多的在线工具分析亲 /疏水性、信号肽、
功能结构域等蛋白质一级结构信息，模拟蛋白质的
二级和三级结构、活性位点和作用机理，为研究其耐
热耐碱特性、对木质素的降解机理等提供重要的理
论依据。但鉴于所获得的氨基酸信息不完整，也可
在此基础上与已知的木质素过氧化物酶进行多序列
比对分析，设计兼并引物，通过克隆表达来获得完整
的蛋白质一级结构信息，为研究编码木质素过氧化
物酶蛋白的基因提供理论支持。
致谢:蛋白质归类试验中的质谱分析由上海交通大学分
析测试中心完成，朱娜工程师承担了大部分的分析工作，在
此谨致谢意。
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(责任编辑 马鑫)
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