全 文 ：·研究报告·
生物技术通报
B IO TECHNOLOGY　BULL ETIN 2009年第 11期
甘菊 cDNA2AFL P反应体系的优化
黄河 1 　王顺利 1, 2 　曹华雯 1 　戴思兰 1
(1北京林业大学园林学院 ,北京 100083; 2北京农学院城乡发展学院 ,北京 102206)
　　摘 　要 : 　以甘菊为试验材料 ,研究了影响 cDNA2AFLP反应体系的几个关键因素 ,建立了适宜甘菊的 cDNA2AFLP分析体
系 ,并得到了清晰可辨的 cDNA2AFLP指纹图谱。结果表明 :适用于甘菊叶片总 RNA提取的方法为改进的 Trizol法 ;酶切连接
采用一步法 , dscDNA酶切用量为 300 ng,酶切连接时间为 8 h; PCR选择性扩增反应时 ,反应体系中最佳组合为 :引物浓度 014
mM、Mg2 +浓度 1125 mM、Taq酶浓度 019 U、dNTP浓度 013 mM。
关键词 : 　甘菊 　cDNA2AFLP　反应体系优化
Optim ization of cDNA2AFLP Techn ica l System for
Chrysan them um lavandu lifolium
Huang He1 　W ang Shunli1, 2 　Cao Huawen1 　Dai Silan1
(1 College of Landscape A rchitecture, B eijing Forestry University, B eijing 100083;
2 College of U rban and Rural Developm ent, B eijing Agricultural College, B eijing 102206)
　　Abs trac t: 　After systematical studies on the factors affecting cDNA2AFLP analysis system of Chrysan them um lavandulifolium , an
op tim ized system was established which showed a distinct electrophoretogram of cDNA2AFLP. The results indicated that using the im2
p roved Trizol method can isolate RNA quickly and efficiently from Chrysanthem um lavandu lifolium ; cDNA was digested and ligated by
one step. The dosage of dscDNA was 300 ng. D igestion and ligation was performed in 8 hours; in 20μl PCR reaction system of selective
amp lification, the p rimer concentration was 014 mM; dNTP concentration was 013 mM; Mg2 + concentration was 1125 mM; Taq DNA
concentration was 019 U.
Key wo rds: 　Chrysanthem um lavandu lifolium 　cDNA2AFLP　System op tim ization
收稿日期 : 2009208217
基金项目 :国家高技术研究发展计划 (“863”计划 )重点项目 (2007AA021403)
作者简介 :黄河 (19852) ,男 ,山东济南人 ,在读硕士 ,研究方向为花卉抗逆性分子生物学 ; E2mail: 101navy@163. com
通讯作者 :戴思兰 , E2mail: silandai@ gmail. com　　甘菊 [ Chrysan them um lavandu lifolium ( Fisch. exTrautv. )Makino ] 是菊科菊属的 2倍体植物 ,为栽培菊花的近缘野生种 [ 1 ] ,广布于我国北方大部分地区 ,多生于低山区多砾石的山坡上 ,具有很强的耐寒、耐热、耐盐碱性 [ 1, 3, 4 ] ,且在逆境下表现出很强的适应性。分离甘菊中抗逆性相关基因 ,并研究其功能 ,不仅对于丰富抗性基因 ,培育抗逆性菊花新品系具有实际意义 ,而且对揭示植物抗盐碱机理研究具有重要意义 ,对其他植物的抗逆性育种研究也具有参考价值。cDNA2AFLP技术是 Vos等将 AFLP技术应用于mRNA表达差异分析的 mRNA指纹图谱技术 ,其保 留了 AFLP技术的可靠性与高效性 ,广泛应用于植物差别基因的分离与表达特性的研究 [ 4～6 ]。但是该技术对试验操作的要求高 ,步骤繁琐 ,每一步的操作成败与否直接影响下一步试验的结果 ,这就要求在进行 AFLP分析前对模板的制备、酶切连接体系、PCR反应体系等进行反复试验和筛选 ,获得最佳试验条件。目前国内外已成功地建立了水稻、黄瓜、拟南芥、杨树等植物的 cDNA2AFLP体系 ,获得了清晰可靠的基因转录图谱 [ 13～15 ]。本研究通过试验分析 ,建立并优化了甘菊 cD2NA2AFLP体系 ,为从表达水平分离和研究菊花的抗逆性相关功能基因 ,并为实现菊花品质性状的定向
2009年第 11期 黄河等 :甘菊 cDNA2AFLP反应体系的优化
改良奠定基础。
1　材料与方法
111　植物材料的培养
甘菊顶芽采自北京林业大学苗圃内 ,经 MS培
养基培养至 4对真叶时用 200 mmol/L的氯化钠溶
液模拟盐胁迫处理 ,分别处理 015 h、2 h、12 h、24 h、
48 h、6 d、12 d,每个处理 20棵甘菊 ,处理完成后采
集甘菊叶片液氮中速冻 ,超低温冰箱保存备用。
112　主要生化试剂和仪器
主要试剂 : Trizol试验购自 Inventrigen公司 ;所用
限制性内切酶 EcoR I、M se I , T4DNA连接酶购自 NEB
公司 ; 不同商品来源的 Taq DNA聚合酶分别购自大
连宝生物公司、美国 Promega公司、北京全式金生物
公司、泽星生物公司和天根生物公司 ;引物、接头由北
京奥科生物公司合成 ;其余试剂均为国产分析纯。
主要仪器设备 : DYY212型大型垂直电泳仪 (北
京六一仪器厂 ) , PTC2100PCR 仪 (B io2Rad)、Hettich
M ikro22R 离心机、PLATI/VUM500V 超低温冰箱
(LAB way science)、紫外分光光度计 (B io2Rad)、HR2 120天平 (A&D company)、Power PAC 300电泳仪 (B io2Rad)。113　试验方法11311　甘菊总 RNA的提取方法的优化 　分别采用CTAB法 [ 7 ]、Trizol法 [ 8 ]和改良 Trizol法 [ 9 ]提取甘菊叶片的总 RNA,每个处理设 3个重复 ,每个重复取样量为 1 g,得到的总 RNA经 115%琼脂糖凝胶电泳检测质量后保存于 - 70℃超低温冰箱中备用。11312　cDNA双链的合成及补平纯化 　参照 TaKa2Ra公司反转录试剂盒说明书 ,以 3μl总 RNA为材料 ,采用无 RNaseH活性的鼠源反转录酶 (M 2MLVR2Tase)结合置换合成法反转录双链 cDNA。紫外分光光度计测定双链 cDNA质量浓度 ,并经甘菊内参基因 A ctin检测其质量后保存于 - 20℃备用。11313　酶切连接　采用 M se I和 EcoR I两种限制性内切酶以及 T4 DNA连接酶 ,对 dscDNA进行双酶切连接 ,酶切温度为 37℃,酶切连接体系中用 dscDNA用量分别设置 100、300和 500 ng 3个梯度。接头和引物核苷酸序列见表 1。
表 1　cD NA2AFL P反应体系
酶切连接体系 用量 (μl) 预扩增体系 用量 (μl) 选择性扩增体系 用量 (μl)
ds cDNA 510 酶切连接产物 510 30倍稀释后预扩增产物 510
10 U /μlM se I 015 Taq酶 (3 U /μl) 014 Taq酶 (3 U /μl) 014
20 U /μl EcoR I 015 p rimerM00 (50 ng/μl) 016 p rimerE (50 ng/μl) 017
10 mg/m l BSA 0125 p rimerE00 (50 ng/μl) 016 p rimerM (50 ng/μl) 017
10 ×NEB buffer2 510 10 mM dNTP 014 10 mM dNTP 016
EcoR I adap tor(10μmol/L) 0125 10 ×PCR buffer 210 10 ×PCR buffer 510
M se I adap tor(20μmol/L) 0125 ddH2O 1110 ddH2O 1012
3 U /μl T4 DNA ligase 014
10 mM ATP 110
ddH2O 3516
11314　预扩增体系的优化 　以酶切连接产物为模
板 ,采用预扩增引物组合 E00、M00 (表 2 ) ,建立预
扩增反应体系 (表 1)。对酶切连接产物设置不同
的稀释倍数 ( 0、6、10倍 ) ,并使用不同来源的商品
Taq DNA聚合酶进行对比研究 , Taq酶分别选用了
大连宝生物的 TaKaRa Ex TaqTM、北京全式金生物
公司的 EasyTaq DNA Polymerase、美国 p romega公
司的 Gotaq DNA Polymerase、北京天根生物公司、北
京泽星生物科技公司的 5种商品 Taq DNA聚合酶
及其相应的缓冲体系。在 B iometraPTC2200型 PCR
仪上按以下程序扩增 : 72℃、3 m in, 94℃、30 s, 56℃、
30 s, 72℃、1 m in, 30个循环 ; 72℃、5 m in, 4℃保温。
预扩增产物在 110%琼脂糖凝胶上检测 , - 20℃保
存备用。
901
生物技术通报 B iotechnology　B u lle tin 2009年第 11期
表 2　cD NA2AFL P接头和引物核苷酸序列
接头和引物 碱基序列 (5′→3′)
EcoR I双链接头
CTCGTAGACTGCGTACC
AATTGGTACGCAGTCTAC
M se I双链接头
GACGATGAGTCCTGAG
TACTCAGGACTCAT
EcoR I预扩增引物 GACTGCGTACCAATTC
M se I预扩增引物 GATGAGTCCTGAGTAA
EcoR I选择性扩增引物 GACTGCGTACCAATTCATT
M se I选择性扩增引物 GATGAGTCCTGAGTAAGA
11315　选择性扩增体系优化 　针对选择性扩增反 应体系中不同成分浓度对选择性扩增的影响设计试验 ,反应体系 20μl,反应体系中试验因子为 :引物浓度、Mg2 +浓度、Taq酶浓度、dNTP浓度、预扩增产物稀释倍数 ,设计 4因素 3水平的正交试验 (表 3)。反应结束后 ,取 5μl产物用 115%琼脂糖凝胶电泳检测 ,在紫外凝胶成像仪上观察、拍照。11316　选择性扩增产物的聚丙烯酰胺凝胶电泳检测 　取扩增成功的选择性扩增产物 615μl与 315μl变性液混匀 , 94℃变性 5 m in,立即冰浴、将 6%的变性聚丙烯酰胺凝胶恒功率 80 W 预电泳至温度50℃,加 6μl冰浴变性混合液上样 ,恒定功率 80 W ,电泳至二甲苯氰距胶下缘 2 /5处停止。银染显色。在 X光胶片观察灯下 ,用目测法统计结果。
表 3　选择性扩增体系 4因素 3水平正交表
反应体系编号
Taq DNA Polymerase
215 U /μl(μl) Mg2 +25 mM (μl) dNTP10 mM (μl) Primer10 mM (μl) ddH2O (μl)
1 0125 110 014 016 8115
2 0125 112 015 018 7145
3 0125 115 016 110 6165
4 0130 110 015 110 7120
5 0130 112 016 016 7170
6 0130 115 014 018 7120
7 0135 110 016 018 7145
8 0135 112 014 110 7105
9 0135 115 015 016 7145
2　结果与分析
211　甘菊总 RNA的提取
目前提取 RNA的常用方法有 CTAB法、异硫氰
酸胍法 , Trizol试剂盒热酚法等 ,由于甘菊叶片中含
有大量的多糖和多酚等物质 ,用以上方法很难获得
高质量的 RNA。本试验采用 3种方法提取 RNA ,由
图 1可以看出 ,改良 CTAB法虽然在去除多糖方面
效果较好 ,但存在痕迹 DNA 污染 ,弥散现象严重。
Trizol试剂盒法提取的 RNA弥散现象严重 , RNA已
降解 ,而改良 Trizol试剂盒法提取的总 RNA效果较
好 ,条带清晰整齐 ,紫外分光光度计测定 ,样品总
RNA的 OD260 /OD280值介于 118～210之间 ,且产量
较高 (表 4)。
A为 CTAB法 ; B为 Trizol法提取 ; C为改良 Trizol法
图 1　甘菊叶片总 RNA电泳图
011
2009年第 11期 黄河等 :甘菊 cDNA2AFLP反应体系的优化
表 4　3种方法提取 RNA的 OD260 /OD280值及产量
提取方法 CTAB法 Trizol试剂盒法
改进 Trizol
试剂盒法
OD260 /OD280 1174 1171 1192
RNA产量 ( g/g FW ) 3115 3916 120
212　双链 cDNA的合成
本试验所获得的双链 cDNA在 100 bp～2 000
kb的范围呈均匀弥散分布 ,所得 ds cDNA利用 A ctin
引物进行 PCR扩增 ,可以获得单一性扩增片段 ,且
片段大小与所设计的 A ctin片段大小相符合 (图 2)。
可见反转录成功 ,合成的 dscDNA质量符合 cDNA2
AFLP技术要求。
图 2　A ctin PCR产物电泳检测特异性片段
213　dscDNA酶切连接用量
dscDNA的完全酶切是多态性得以检测的根本
保证 ,而影响酶切质量的一个重要因素就是 dscDNA
酶切用量。 dscDNA 用量过多 ,容易导致酶切不完
全 ;过少 ,则模板浓度太低。本研究比较了 100、
300、500 ng dscDNA在酶切连接 8 h后的效果。结
果表明 : 500 ng的 dscDNA酶切连接后经预扩增后
电泳后所得到的谱带少 ,且谱带多集中在测序胶的
上部 ; 100 ng的 dscDNA酶切连接后经预扩增后所
得谱带浓度较低 ; 300 ng的 dscDNA,能够得到浓度
合适、大小适宜的谱带 (图 4 )。故选择 300 ng的
dscDNA经 8 h酶切连接后的产物做为预扩增模板。
214　预扩增体系优化
预扩增为选择性扩增提供模板 ,并对模板起选
择性纯化作用 ,是整个 cDNA2AFLP试验流程中最为
重要的一步。其中 Taq酶的种类与质量最为关键。
AFLP标记的指纹式样通常因不同厂家的 Taq酶甚
至不同批次的酶而异 ,本试验采用不同来源的商品
TaqDNA聚合酶体系 ,结果证明 ,不同的商品 Taq
DNA聚合酶体系对 AFLP预扩增结果影响很大。由
图 3可以看出 :北京全式金公司的 EasyTaq DNA
Polymerase能够扩增出 100～600 bp的弥散条带 ,符
合 AFLP试验要求 ,而其他 4种酶的扩增结果均在
1 000 bp以上 ,甚至出现从点样孔开始向下弥散的
现象 ,不能满足下一步选择性扩增的要求。所以本
试验选用全式金公司的 EasyTaq DNA Polymerase做
为预扩增及下一步选择性扩增的 Taq酶。
M. Marker DL2000; 1. 未经盐胁迫处理的对照材料 ; 2. 重复 ; a. 美国
p romega公司的 Gotaq DNA 聚合酶 ; b. 大连宝生物的 TaKaRa Ex
TaqTM ; c. 北京全式金生物公司的 EasyTaq DNA Polymerase; d. 天根
生物公司的 Taq酶 ; e. 泽星生物公司的 Taq酶
图 3　五种 Taq聚合酶扩增出的预扩增电泳图
分别以酶切连接产物原液、稀释 6倍、10倍的产
物做为模板进行预扩增 ,经琼脂糖凝胶电泳后 ,可以
看出酶切连接产物不经稀释直接进行选择性扩增即
可获得 100～600 bp的弥散条带 (图 4) ,符合 AFLP
的要求 ,所以直接以酶切连接原液进行预扩增。
1、4、6. 100 ng dscDNA酶切连接后预扩增产物 ; 2、7、8. 300 ng dscD2
NA酶切连接后预扩增产物 ; 3、5、9. 500 ng dscDNA酶切连接后预扩
增产物 ; 1、4、7. 不同酶切时间产物连接后原液的预扩增产物 ; 2、5、
8. 不同酶切时间产物连接后稀释 6倍的预扩增产物 ; 3、6、9. 不同酶
切时间产物连接后稀释 10倍的预扩增产物
图 4　连接产物稀释不同倍数预扩增电泳图
215　选择性扩增体系
选择性扩增的条带是从扩增产物中筛选出能被
合适引物组合选择性碱基识别的片段 ,其结果需要
用高分辨的聚丙烯酰胺凝胶电泳检测。引物中选择
性碱基的数目影响着扩增反应的特异性 ,一般 cD2
111
生物技术通报 B iotechnology　B u lle tin 2009年第 11期
NA 2AFLP选择性碱基数为 P + 3,在甘菊的 cDNA 2
AFLP中 ,根据甘菊功能基因组的特点 ,本试验选
择在 2条引物的 3′2末端分别加上 2个选择性碱基
E + 2 /M + 2的引物组合 ,每对引物平均可扩增出
50～70条清晰稳定的多态性条带。对选择性扩增
程序的正交试验电泳图 (图 5)显示 :泳道 7中条带
清晰可辨 ,效果最佳。说明选择性扩增的最佳体
系为引物浓度 014 mM、Mg2 +浓度 1125 mM、Taq酶
浓度 019 U、dNTP浓度 013 mM。以此体系获得的
聚丙烯酰胺电泳图谱扩增条带数目适中、分布均
匀、分辨率高 ,适于 cDNA 2AFLP分析 (图 6)。
3　讨论
311　甘菊总 RNA的提取
cDNA2AFLP程序多且复杂 ,任何一步的疏忽都
会影响试验的最终结果。从甘菊叶片分离完整无
损、纯度高和无基因组 DNA污染的 RNA是试验成
败的关键。较早出现的提取方法是酸酚 -异硫氰酸
胍法 ,该法应用较广 ,但有些植物或组织使用此法也
有一定的困难 [ 7, 8 ] ;此后相继使用了 CTAB法、SDS
法和 Trizol试剂法 ,其中 CTAB法提取 RNA所需时
间较长 ,但产率高、去除多糖的效果好 ; SDS法提取
速度快 ,但 RNA产率较低 [ 6 ] ;而 Trizol试剂法提取
RNA既快速又高效。本研究从提高 RNA产率及减
少 RNA 降解入手 ,针对目前常用的 Trizol方法、
CTAB法进行优化改良 ,试验结果表明改进后的 Tr2
izol法适用于甘菊叶片内含物特殊性 ,提取的 RNA
纯度在 118～210之间且产量高。结果表明获得高
质量 RNA的关键有以下 3点 :
(1)加入 Trizol试剂用力振荡后 ,平放试管 ,使
得 RNA更易被抽提 ;异丙醇、无水乙醇沉淀 RNA及
70%乙醇洗 RNA沉淀都经预冷 ,增加 RNA沉淀 ,从
而提高 RNA 的产率 ,通常每 015 g植物样组织的
RNA产率为 170 ～200 μg,本方法每 015 g样品
RNA产率为 240μg。
(2)增加两次氯仿 /异戊醇抽提 ,能有效地除去
不溶性的蛋白质、多糖、多酚等大分子物质。在抽提
吸取上清过程中 ,采用小量程枪头多次吸取的方法 ,
宁少取不多取 ,尽最大可能减少蛋白等大分子与
RNA分子一起沉淀的可能性。
(3)将异丙醇沉淀时间延长至 2 h,溶解 RNA
沉淀时加入 RNase Inhibitor,延长了 RNA的保存时
间 ,操作简便 ,可直接用于后续试验。
312　PCR扩增反应
大量文献报道 ,分子标记技术的关键在于高质
量的模板制取和稳定体系的建立。在试验中最常见
的问题是 PCR扩增失败 ,即扩增不整齐 ,甚至完全
没有扩增 ,问题原因可能出在任何一个步骤中。在
cDNA2AFLP技术中 , PCR扩增反应分预扩增和选择
性扩增 ,只有预扩增片段范围较亮、较宽、而且样品
间一致性较好的双链 cDNA酶切连接片段才能作为
AFLP选择性扩增的模板 [ 18 ]。前人同类研究主要从
聚丙烯酰胺凝胶电泳和银染等方面的技术改进入
手 [ 11 ] ,忽略了对 PCR选择性扩增条件研究的重要
性。虽然 cDNA2AFLP的最终条带获得是利用聚丙
烯酰胺凝胶电泳 ,但事实上选择性扩增产物是影响
cDNA2AFLP结果的最重要因素之一 ,如果得到的选
择性扩增产物质量不高 ,聚丙烯酰胺凝胶电泳和银
染等技术再好 ,也很难尽可能多地反应出 cDNA2
211
2009年第 11期 黄河等 :甘菊 cDNA2AFLP反应体系的优化
AFLP中原始的 ESTs。本试验采用 E + 2 /M + 2的引
物组合 ,在 cDNA2AFLP两次的扩增中 ,分别对 PCR
体系中的各项因素进行了细致的摸索 ,认为酶切连
接产物稀释 6倍进行预扩增 ,再稀释 10倍进行选择
性扩增 ,扩增效果较好。
理论上讲 , AFLP的扩增结果应该与 Taq DNA
聚合酶的商品来源无关 ,而酶的活性大小也仅仅影
响扩增条带的扩增量。本研究的试验结果却表明 ,
采用不同厂家的 Taq DNA聚合酶 ,扩增结果可能完
全不同 ,其原因有待进一步研究。我们建议 ,在用
AFLP进行比较分析时 ,除了进行 PCR反应条件优
化外 ,为保证结果的可比性 ,应一次买足同一批次的
商品酶并妥善保存 ,以保证试验的正常进行和图谱
的稳定性、可比性 ,尽量减小误差。另外 ,不同公司
的 dNTP、Mg2 +对扩增结果也许会有影响 ,在试验中
要尽量保持一致。
313　反应体系的稳定性
目前在多种植物上已经建立了稳定的 cDNA2
AFLP反应体系 [ 12～16 ]。应用此技术在功能基因分
离、遗传多样性、基因的差异显示方面的研究结果表
明 , cDNA2AFLP技术是一种稳定性好 ,多态性高的
分子标记技术 [ 17 ]。虽然在应用 AFLP分析技术进
行菊属植物遗传多样性分析上前人已经有了一定的
工作 ,但之前的反应体系基本是参照 Vos等 [ 18 ]的方
法 ,没有对体系进行优化 ,最终得到的反应图谱信息
量较少、背景不清晰、稳定性不高 [ 24 ]。所以在应用
cDNA2AFLP进行遗传分析前对试验材料的反应体
系进行优化 ,建立稳定的反应体系是必要的。
周春玲等 [ 25 ]曾运用 AFLP技术对菊属植物中
与栽培菊花亲缘关系较密切的野生种进行研究 ,为
菊花起源研究提供参考资料。王顺利 [ 9 ]运用 cDNA2
AFLP技术分析了菊花与菊花白锈病菌互作过程中
的基因转录谱 ,得到了 18个具有同源序列的病原诱
导片段和 33个未知功能基因片段。其中分离得到
的大分子蛋白伴侣相关基因最多 ,推测该类基因在
菊花抗白锈病过程中具有重要作用。
本研究获得了高质量的甘菊 cDNA模板 ,建立
了甘菊的 cDNA2AFLP特异性反应体系 ,为筛选与甘
菊抗盐性功能基因和调控基因奠定了基础。
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