全 文 ：·研究报告·
生物技术通报
B IO TECHNOLOGY　BULL ETIN 2009年第 12期
萼脊兰 ACC氧化酶基因片段的克隆及其
反义基因表达载体的构建
崔波 1, 2 李长看 2 马杰 2 张仙云 2 袁秀云 2 叶永忠 1
(1河南农业大学生命科学学院 ,郑州 450002; 2郑州师范高等专科学校生物工程研究所 ,郑州 450044)
　　摘 　要 : 　根据已报道的几种不同属的兰科植物 ACO基因序列 ,设计并合成了一对特异引物 ,以萼脊兰的基因组 DNA为
模板 ,用 PCR扩增方法克隆出萼脊兰 ACO基因的部分片段 ,将其连接到 pMD192T质粒载体上进行测序。结果显示 ,该片段的
长度为 333 bp,序列和蝴蝶兰 ( Phalaenopsis hybrid)、卡特兰 (Cattleya in term ed ia)、两棱蕾丽兰 (L aelia anceps)的相应 ACO片段
的同源性分别达到达到 9917%、92149%和 92119% ;和大花蕙兰 (Cym bidium hybrid)、石斛兰 (D endrobium crum enatum )的同源
性分别是 89149%和 89119%。将此片段反向插入植物表达载体 pB I221的 CaMV35S启动子和 NOS终止子之间 ,成功构建了
萼脊兰 ACO的反义基因植物表达载体 pB I2antiACO。
关键词 : 　萼脊兰 ACC氧化酶 克隆 反义载体
Clon ing and Construction of Antisense Plant Expression
Vector of ACC Oxidase of Sedirea japon ica
Cui Bo1, 2 L i Changkan2 Ma Jie2 Zhang Xianyun2 Yuan Xiuyun2 Ye Yongzhong1
(1 College of L ife Science, Henan Agricultural University, Zhengzhou 450002;
2 Institute of B ioengineering, Zhengzhou Teacher’s College, Zhengzhou 450044)
　　Abs trac t: 　A pair of specific p rimers were designed and synthesized according to the reported DNA sequences of the ACC oxidase
gene of Phalanopsis, Cattleya, Laelia, Cym bidium , D endrobium. The partial DNA of ACO was obtained from genom ic DNA of Sed irea ja2
ponica by PCR. Then the DNA fragment was linked to T2tailing pMD192T vector for cloning and sequencing. The results showed that the
obtained sequence was made up of 333 bp and the homologous rateswere 9917% , 92149% , 92119% , 89149% and 89119% compared
with the relevant fragments of reported ACO sequences of Phalaenopsis hybrid, Ca ttleya in term ed ia, L aelia anceps , Cym bid ium hybrid
and D endrobium crum enatum. The antisense exp ression vector was constructed by inserting the fragment of ACO into pB I221 between
the CaMV35S p romoter and NOS term inator in antisense orientation.
Key wo rds: 　 Sedirea japon ica　ACC oxidase　Cloning Antisense vector
收稿日期 : 2009208217
基金项目 :河南省科技攻关项目 (092102110128)
作者简介 :崔波 (19622) ,河南泌阳人 ,研究员 ,现从事生物技术研究工作 ; E2mail: laocuibo@163. com
通讯作者 :叶永忠 (19572) ,男 ,博士生导师 ,长期从事植物学的研究与教学工作　　乙烯是植物激素之一 ,广泛地存在于植物器官组织中。在植物的生长发育过程中 ,乙烯能够促进果实成熟、离层的形成和植物器官的脱落、加速植物的衰老和次生物质的排泌等 ,还能作为信使物质参与植物的胁迫反应并能提高植物的抗逆性 [ 1 ]。乙烯在植物体内的合成途径为 Met (蛋氨酸 ) → SAM( S2腺苷蛋氨酸 ) → ACC ( 12氨基环丙烷羧酸 ) →乙 烯 [ 2, 3 ]。其中乙烯直接前体 ACC的合成及氧化为产生乙烯的限速环节 ,催化 SAM 向 ACC转化的酶是ACC合成酶 ( 12am inocyclop ropane212carboxylate syn2thase, ACS)。催化乙烯合成的最后一步 ,即催化ACC转化成乙烯是 ACC氧化酶 ( 12am inocyclop ro2pane212carboxylate oxidase, ACO ) [ 4, 5 ]。应用反义基因技术以降低植物体内乙烯的生成 ,是控制或延
2009年第 12期 　　　崔波等 :萼脊兰 ACC氧化酶基因片段的克隆及其反义基因表达载体的构建
缓植物衰老、果实成熟和器官脱落等的有效手段
之一。近年来 ,该技术在多种作物上已有成功的
应用 [ 6～10 ] 。
植物内源乙烯根据其生成量和性质 ,分为微量
乙烯 (系统 2I乙烯 )和大量乙烯 (系统 II乙烯 ) [ 11 ]。
根据果实和花朵中乙烯大量生成与否 ,通常把植物
分为跃变型和非跃变型两大类 [ 12 ]。多数兰科、石竹
科和锦葵科等科的植物 ,其开花和衰老与乙烯关系
密切 ,为跃变型花卉。而菊科、百合科、天南星科等
科的植物通常其开花与衰老对乙烯不敏感 ,为非跃
变型花卉 [ 13 ]。跃变型花卉在跃变前期只产生微量
乙烯 ,即系统 2I乙烯。当系统 2I产生的乙烯达到一
定程度时 ,诱导系统 II开始产生乙烯 ,启动整个衰
老过程。非跃变型花卉在正常开花和衰老进程中只
生成微量乙烯 ,即系统 2I乙烯 ,但是在遇到各种胁迫
时 ,也会产生系统 2II乙烯 ,进而影响开花衰老进程。
对于跃变型花卉 ,用 ACO反义基因技术延迟花朵凋
谢 ,在香石竹已有成功的报道 [ 8～10 ]。
本试验以萼脊兰的 DNA 为模板 ,从中克隆
ACO的基因片段 ,经测序后以反方向插入载体中 ,
构建了 ACO反义基因的植物表达载体 ,为下一步研
究其对萼脊兰花期和生长的影响打下了基础。
1 材料和方法
1. 1 材料
萼脊兰 Sed irea japon ica (L inden et Rchb. f. ) Ga2
ray et Sweet由郑州师范高等专科学校温室提供。
限制性内切酶、TaqDNA 聚合酶、T4 DNA 连接酶、
DNA M arker等工具酶均为宝生物工程 (大连 )有
限公司产品 ;新型植物基因组 DNA提取试剂盒、
质粒小提试剂盒、普通琼脂糖 DNA回收试剂盒、
IPTG、X2Gal、dNTP为天根生化科技 (北京 )有限公
司产品。其它试剂均为国产分析纯。所用质粒
pMD192T、pB I221和大肠杆菌 DH5α由本实验室
保存。
1. 2 萼脊兰基因组 DNA的提取及引物设计与合成
取萼脊兰新鲜叶组织 100 mg,加入液氮充分研
磨 ,参照新型植物基因组 DNA提取试剂盒的使用说
明 ,提取萼脊兰的基因组 DNA。
由于目前尚未见有萼脊兰 ACO基因序列的报
道 ,只能根据已报道的蝴蝶兰、石斛兰和卡特兰等其
它兰花的 ACO基因保守序列 ,用 Primer2BLAST设
计了 1对特异性引物。为便于克隆 ,分别在引物 P1
和 P2的 5′端加上 S ac I和 X ba I两个酶切位点 (下划
线部分 ) ,由北京博尚生物技术公司合成。
P1: 5′2ACGAGCTCCTGGATCTGTTGTGCGAAGA23′
P2: 5′2CATCTAGACACCACCCTATGCAACACAC23′
1. 3　PCR扩增及其产品回收
以萼脊兰基因组 DNA为模板进行 PCR扩增。
反应体系 : 10 ×buffer 210 μl, dNTP ( 215 μmol/L )
210μl, P l、P2 ( 10μmol/L )各 014 μl, TaqDNA 酶
(10 U /μl) 012μl,模板 DNA015μl,定量补足 ddH2
O至 2010μl。反应条件 : 95℃预变性 3 m in, 95℃变
性 30 s, 55℃复性 40 s , 72 ℃延伸 40 s, 30个循环 ,
最后 72℃延伸 5 m in。PCR产物经 110%琼脂糖凝
胶电泳后 ,切下目的带 ,用普通琼脂糖 DNA回收试
剂盒回收。
114 目的片段的克隆及序列测定
将回收的目的片段与 pMD182T载体连接 ,转化
大肠杆菌 DH5α感受态细胞 ,在 X2Gal/ IPTG培养基
上挑取白色菌落 ,用质粒小提试剂盒抽提质粒 ,菌落
和质粒进行 PCR鉴定 ,井进行电泳鉴定和限制性内
切酶分析。将结果为阳性并能切出约 333 bp片段
的阳性克隆菌株送北京博尚生物技术公司测序。得
到的克隆命名为 pM D192antiACO。
115 含 ACO基因片段的反义植物表达载体的构建
将含有 ACO基因片段的的 pMD192antiACO经
限制性内切酶 S ac I/X ba I双酶切后 ,回收、纯化小片
段。反向连接到也经 Sac I/X ba I双酶切的 pB I221
上 ,构建成反义植物重组表达载体 (图 1)。连接反
应参照 T4连接酶说明书。转化大肠杆菌 DH5α感
受态细胞、质粒小提试剂盒提取质粒 ,进行 Sac I/
Xba I双酶切图谱分析验证后 ,反义载体命名为 pB I2
antiACO。
图 1　ACC氧化酶反义植物表达载体 pB I2an tiACO结构
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生物技术通报 B iotechnology　B u lle tin 2009年第 12期
2　结果与分析
2. 1 PCR产物的克隆及筛选
利用合成的一对引物 , DNA 进行 PCR 扩增 ,
PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳分析 ,结果显示 ,在
333 bp附近有一亮带 ,与预期的目的基因片段相
符 (图 2)。将此片段回收后与 pMD19 2T vector相
连 ,获得重组质粒 pMD192antiACO。转化大肠杆菌
DH5α感受态细胞 ,经蓝白菌落筛选后 ,菌液和质粒
PCR鉴定 ,均有目标条带出现 ,证明挑选的菌斑为
阳性。pMD192antiACO经 X ba I和 Sac I双酶切 ,得到
两个片段 ,分别为 333 bp和 2 692 bp (图 3)。检测
结果显示萼脊兰 ACO基因片段已插入 pMD192T载
体中。
图 2　ACC氧化酶片段的 PCR扩增
图 3　Sac I/Xba I酶切重组质粒 pMD192an tiACO
2. 2 目的基因片段序列分析
将酶切检测为阳性的克隆测序 ,测序结果表明 ,
克隆到的基因片段长 333 bp。序列用 NCB I2B last和
DNAMAN等软件分析 ,基因片段序列和蝴蝶兰
( Pha laenopsis hybrid )、卡 特 兰 ( Ca ttleya in term e2
d ia)、两棱蕾丽兰 (L aelia anceps)的 ACO片段的同
源性分别达到达到 9917%、92149%和 92119% ;
大花蕙兰 ( Cym bid ium hybrid )、石斛兰 (D end robium
crum ena tum )的同源性分别是 89149%和 89119%
(图 4)。
图 4　萼脊兰 ACO片段与兰科其它 5种植物片段序列的比较
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2009年第 12期 　　　崔波等 :萼脊兰 ACC氧化酶基因片段的克隆及其反义基因表达载体的构建
2. 3　植物重组表达载体的构建和鉴定
将经测序的含有 ACO基因片段的的 pMD192T
和 pB I221经 Sac I/X ba I双酶切后 ,回收 333 bp片段
和 pB I221酶切后的 3 767 bp大片段 ,连接后转化大
肠杆菌感受态细胞 ,将在含 Amp的 LB培养基上生
长的菌落培养 ,提取质粒。以 F1和 F2引物进行
PCR,扩增出一条 333 bp的目的条带 ,证明目的基
因已正确插入。该质粒用 Sac I/X ba I双酶切也得到
了一条约 333 bp 的目的基因和一条 3 767 bp 的
pB I221载体片段 (图 5) ,与预期的大小相符 ,表明
蝴蝶兰 ACO基因反义载体 pB I2antiACO构建成功。
图 5　Sac I/Xba I酶切植物重组表达载体 pB I2an tiACO
3 讨论
ACO基因不同于 ACS基因 , ACS基因是一个大
的基因家族 ,而 ACO在所报道的植物中 ,其基因彼
此之间的核苷酸序列和氨基酸序列的同源性较高
(氨基酸序列在 80%以上 ) ,而且同源的区域集中在
多肽的中部 [ 14 ]。鉴于此 ,参考已报道的兰科植物其
他属 ACO序列 ,采用同源序列克隆方法 ,从基因组
DNA中克隆到 ACO基因片段。该片段与蝴蝶兰属
( Phalaenopsis)、卡特兰属 (Ca ttleya)、蕾丽兰属 (L ae2
lia)植物的相应的 ACO片段同源性达 90%以上 ;和
大花蕙兰属 (Cym bid ium )、石斛兰属 (D endrobium )相
应 ACO片段的同源性也接近 90%。
反义基因技术就是将特定基因的 DNA片段反
向连接在已启动子上 ,然后转化植物 ,使植物能产生
与该基因的 mRNA互补的 RNA链 ———反义 RNA,
可使植物中相应的 mRNA水平大幅降低 ,进而使该
基因受到部分抑制或完全抑制。一般认为反义
RNA与靶 RNA具有特异互补性 ,通过碱基配对结
合的方式在复制、转录、翻译等过程中起负调节作
用。应用反义基因技术抑制乙烯生成的两个关键酶
ACO和 ACS的表达 ,进而控制乙烯生物合成 ,是一
条培育耐贮藏和抗衰老转基因植物的经济、安全、有
效途径。萼脊兰为兰科萼脊兰属植物 ,因其花色清
丽 ,香味芬芳 ,养护简单且耐寒 ,深受人们的喜爱。
克隆萼脊兰 ACO基因片段 ,构建其反义表达载体 ,
可为培育超长花期的萼脊兰打下基础。
参 考 文 献
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