全 文 ：生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN·综述与专论· 2008年第3期
收稿日期:2007-12-28
作者简介:李珺(1979-),女,宁夏银川人,硕士,主要从事基因工程的教学与研究工作
植物生物反应器是指通过基因工程途径,以常
见的农作物作为“细胞工厂”,通过大规模种植生产
具有高附加值的医用蛋白、疫苗、工农业用酶、特殊
碳水化合物、生物可降解塑料、脂类以及其它一些
有益的次生代谢产物。植物作为生物反应器与微生
物和动物细胞发酵相比具有许多潜在的优势:①植
物具有完整的真核细胞表达系统,表达产物能进行
正确的折叠装配和修饰,使重组蛋白保持与天然蛋
白一致生物活性;②植物细胞具有全能性,培养条
件简单,成本低廉,易于规模化生产;③已经建立了
收获和贮存植物材料的方法。外源蛋白在植物贮
存器官中较为稳定,如马铃薯块茎表达的 scFv抗
体在块茎中贮存一年半后,仍具有收获时活性的
一半[1];④表达产物安全可靠,具有无毒性和无副
作用,无残存 DNA和潜在致病致癌性;⑤不涉及伦
理道德问题。尽管植物生物反应器具有上述许多优
点,植物上游生产成本也比其他系统都低,但为了
使植物生产的外源蛋白在商业化及产业化进程更
具竞争力,亟待解决的问题就是提高外源蛋白的表
达量及降低蛋白提取和加工等下游技术的成本。产
量是任何商业化及产业化生产的重要参数之一,蛋
白表达量低,一方面无法达到商业化生产剂量,另
一方面给分离纯化带来了困难,尤其是植物富含色
素及各种碳水化合物,外源蛋白极易降解,而使用
特异性启动子及将外源蛋白定位于植物细胞器中
是解决问题的有效途径,这不但有利于蛋白的分离
纯化还可提高蛋白的表达量,利于储存运输,从而
成为植物生物反应器研究领域中新的热点。
1 叶绿体植物生物反应器
1.1 叶绿体植物生物反应器的特点
叶绿体是地球上独特的将光能转化为化学能
的细胞器,其遗传方式为细胞质遗传。叶绿体作为
一种新型的植物生物反应器具有一些显著的优势:
①拷贝数高 叶绿体基因在每个植物细胞中拷贝数
高达 500~1000个,外源基因转入叶绿体中其表达
量往往是在核基因组中表达的几百倍[2];②原核基
因无需改造可直接表达 叶绿体起源于蓝绿藻,是
高等植物细胞中一种特殊的具有原核特性的细胞
器,这为原核基因在高等植物中的表达提供了一个
理想场所。许多有实用价值的目的基因均来自于原
几种新型细胞器植物生物反应器的研究
李珺
(内蒙古科技大学生物与化学工程学院,包头 014010)
摘 要: 细胞器植物生物反应器因有效提高外源蛋白的表达量及降低蛋白提取和加工等下游技术的成本,在现在
商业及产业化进程中更具竞争力而成为植物生物反应器研究领域中新的热点。对叶绿体、油体、淀粉体细胞器植物生物
反应器的特点及研究进展进行阐述。
关键词: 细胞器生物反应器 叶绿体 油体 淀粉体
ResearchofSeveralNewPlantCelBioreactor
LiJun
(SchoolofBiologicalandChemicalEngineering,InnerMongliaUniversityofScienceandTechnology,Baotou014010)
Abstract: Duetotheefectiveincreaseofforeignproteinexpresion,reducingproteinisolationanddownstream
biotechnologycosts,plantcelbioreactorisnewresearchhotspotsinbusinesandindustryforcompetitive.Inthispaper,
chloroplast,oil,starchgranuleshavebeenexpoundedinthecharactersandresearchprogres.
Keywords: Plantcelbioreactor ChloroplastOilStarchgranules
2008年第3期
核生物,它们无需改造即可在叶绿体中高水平表
达。③生物安全性高 叶绿体转基因具有母性遗传
的特点,不会经花粉向近缘植物水平渐渗,生物安
全性高,对环境的影响能够达到最小;④无基因沉
默现象 叶绿体转化是使用两个旁翼序列,通过同
源重组将外源 DNA插入叶绿体功能基因之间实现
靶基因的精确定位,从而消除了位置效应(position
efect),且无基因沉默现象;⑤成本低廉 叶绿体能
够使真核蛋白质正确折叠并形成二硫键。叶绿体中
存在分子伴侣(chaper-onin)能够在原核和真核蛋白
质的折叠和装配中行使功能。表达的外源蛋白质正
确折叠和装配能够减少因为体外加工而需要的昂
贵成本;⑥无抗生素标记基因便于实行分子操作。
1.2 叶绿体植物生物反应器研究现状
李轶女等[3]利用 bar作为筛选标记基因,获得
了抗除草剂 PPT的叶绿体转化水稻植株;王玉华
等[4]首次通过叶绿体遗传转化将 mcl-PHAs合成途
径的关键酶导入烟草的叶绿体,实现 mcl-PHAs在
烟草叶绿体的定位合成;侯丙凯等[5]首次在国际上
实现了抗虫基因 cry1Aa对油菜叶绿体基因组的定
点整合,并获得了具有抗虫性的油菜叶绿体工程植
株;Staub等[6]将人的生长激素基因导入烟草叶绿体
中,其表达量占总可溶性蛋白的 7%,比同样基因的
核基因组表达高出了 300倍;RufS[7]首次将霍乱毒
素 B亚基基因(CT-B)成功整合到番茄叶绿体基因
组上,其表达量占叶片总可溶蛋白的 4.1%,是同时
利用核基因组表达的大肠杆菌肠毒素 B亚基基因
(LT-B)表达量的 410倍。DeGray等[8]将抗菌肽 MSI-
99导入转基因烟草叶绿体中,其表达量积累到
21%,且不会影响到转基因植物的正常生长和发
育。DeCoSa[9]报道了 Bt蛋白基因在烟草叶绿体中
的表达量高达 46.1%;Tregoning等[10]将破伤风病毒
的 C片段(TetC)转化烟草的叶绿体细胞,结果表达
量最高达可溶蛋白的25%。Daniel等[11]将CaF1-LcrV
鼠疫耶森氏菌抗原基因导入烟草叶绿体基因组,融
合蛋白表达水平最高可达总可溶蛋白的14.8%。
2 油体植物生物反应器
2.1 油体蛋白的特性
近几年来在植物种子中表达外源蛋白倍受人
们的关注,主要是因为植物种子是最廉价的蛋白
源。植物种子中贮存的脂类物质大多以三酰甘油
(truacylglycerds,TAG)的形式存在,种子中 TAG分
子之间不是彼此聚合的,而是分散成许多小的稳定
的亚细胞微滴,被称为油体。油体是生物体中最小
的细胞器。在油体上装配有一种称作油体蛋白
(oleosin)的特异蛋白质。油体蛋白(oleosin)具有疏
水和亲脂双重特性,在植物种子中以膜嵌入方式覆
盖在油体表面[12]。因此,将外源蛋白编码基因插入
油体蛋白(oleosin)编码基因的 3端,以 oleosin启动
子驱动外源蛋白与 oleosin一起在转基因植物的油
体中特异表达,获得转基因植物种子后,利用油体
亲脂疏水的特性,将转基因植物种子经粉碎-液体
抽提-离心处理,回收上层油相即可将外源蛋白与
细胞内其它组分分开,可去除 90%以上的种子蛋
白。从而显著降低外源蛋白的分离纯化成本;且在
种子成熟过程中,大约有 95%的水分会主动失去,
细胞中的水解酶活性降低,外源蛋白可以在种子内
长期、稳定地贮存而不会被降解。
2.2 油体植物生物反应器的研究现状
由于油体蛋白特性,油体作为一种新型的植物
生物反应器,为最终利用转基因植物生产外源蛋白
提供了新的途径。Parmenter等[13]将 β-葡萄糖苷酸
酶(GUS)基因与油体蛋白(oleosin)基因的启动子及
部分编码序列融合,在转基因芸苔中 80%的 GUS
分布在油体上。oleosin-GUS融合蛋白在转基因油
菜种子中 4℃贮存 1年以上,也不降解。利用该融
合表达系统生产的水蛭素已成为第一个商业化产
品[14]。Lee等[15]首次报道将玉米的 oleosin转入油菜,
玉米 oleosin的 mRNA仅在转基因植物成熟种子中
存在,表达量为种子总蛋白的 1%,表达产物 90%
定位在油体上。Liu等[16]利用植物油体表达体系在
转基因油菜中成功地表达了来自瘤胃真菌的木聚
糖酶;Verwoerd等[17]将黑曲霉的植酸酶基因转入油
菜,植酸酶表达可以稳定遗传下去,第 15代的种子
仍含有最初的植酸酶表达水平。贾士荣等[18]利用油
菜油体蛋白 oleosin启动子与芝麻 oleosin结构基因
构建了在油菜种子中高效表达的 oleosin-msCT(鲑
鱼降钙素突变基因)融合蛋白基因的植物表达载
体。融合蛋白表达量占种子总蛋白的 6.47%,其生
物活性远远超过天然鲑鱼降钙素和人降钙素;
李珺:几种新型细胞器植物生物反应器的研究 31
生物技术通报Biotechnology Buletin 2008年第3期
MarkleyNA[19]利用红花油体表达系统生产的胰岛素
占植物总蛋白的 1.2%,达到商业生产标准。
3 淀粉体植物生物反应器
淀粉体是贮藏组织中淀粉合成的场所。其表现
为形成团粒结构-淀粉粒,淀粉粒形态大因植物种
类差异很大,具有种的专一性,是决定不同内源淀
粉性质的重要因素之一。淀粉粒表面或内部紧密结
合一种蛋白质-淀粉粒结合蛋白(StarchGranuleAss-
ociatedProteinSGAPs),淀粉粒结合蛋白影响商业
淀粉的黏度、气味、品质、色泽、口感等多种性质。大
多数淀粉都可以分离出 10种以上 SGAPs,而目前
研究较为深入的是 Friabilin和颗粒结合型淀粉合
成酶Ⅰ(granule-boundstarchsynthaseIGBSSI)。Fri-
abilin与谷物的胚乳品质密切相关,影响其制粉和
用途。郭世华等[20]研究表明 Friabilin蛋白的表达量
与籽粒硬度呈显著负相关。GBSSI编码的与淀粉粒
结合淀粉合成酶是唯一决定合成直链淀粉的基因,
GBSSI启动子驱动的基因特异表达于块茎中,
EdwardsA等[21]研究表明 GBSSIC末端 20氨基酸
(F2G)构成的多肽使得它能够结合在淀粉粒上,行
使糖苷键的形成和直链淀粉延伸的功能,这在其它
淀粉合成酶中是不存在的。季勤[17]把马铃薯 GBSSI
基因编码序列与荧光素酶(LUC)基因融合,并转入
无直链淀粉合成酶的马铃薯突变体 amf植株中。结
果表明:萤光素酶在淀粉的生物合成过程中定位到
淀粉粒中,并保持它的活性,但由于 GBSSI蛋白质
的分子量较大(60kD)使所构建的重组蛋白在折叠
过程中产生变化进而功能减弱使得萤光素酶与淀
粉粒的亲和性以及荧光素酶的活性均有所下降。介
于此本实验室从马铃薯块茎总 RNA中分离获得
GBSSIC末端 20个氨基酸(FCG)编码序列,构建了
GBSSI启动子-FCG-GUS融合表达载体并转入马铃
薯植株中使其外源蛋白进一步定位在马铃薯淀粉
粒中,且降低了 GBSSI分子量的大小。由于目前对
GBSSI的研究主要集中在提高淀粉含量和改良淀
粉品质,而将淀粉体作为植物生物反应器生产高附
加值外源蛋白还有待于进一步研究。
4 讨论与展望
利用细胞器植物生物反应器表达系统已成功
地表达了多种外源蛋白,对重组蛋白进行理化特性
和生物活性分析,在动物实验和人体实验方面也已
取得了重要进展,植物细胞器也不仅仅局限于叶绿
体、油体、淀粉体,在液泡、内质网和线粒体中都有
一些相关的报道,所有这些研究表明植物生物反应
器表达系统的研究令人鼓舞。但是,作为一个表达
系统,植物系统还处于发展阶段,还有许多问题尚
待解决,如可利用的宿主植物,有待于进一步开发。
在重要经济作物中建立细胞器转化体系,已成为迫
切需要解决的问题。这主要是因为大多数植物的细
胞器基因组序列不清楚,因此无法确定用于载体构
建外源基因的插入位点;外源蛋白转入植物细胞器
中还存在影响植株的正常生长如出现植株矮化、叶
片卷缩、不能开花结实等。在大规模生产过程中,如
何更好地解决环境问题仍需关注。随着研究的不断
深入,细胞器植物生物反应器也将不断走向成熟,
为外源蛋白的生产和应用开辟更加广阔的道路。
参考 文献
1 ArtsaenkoO,etal.MolecularBreeding,1998,4:313.
2 DanielH,DhingraA.CurOpinBiotech,2002,13:136~141.
3 李轶女,孙丙耀,苏宁.中国农业科学,2007,40(9):1849~1855.
4 WANGYuhua,etal.ChineseScienceBuletin,2005,50(11):
110~112.
5 侯丙凯,陈正华.遗传,2001,23(1):39~40.
6 StaubJM,etal.NatBiotechnol,2000,18:333~338.
7 RufS,HermannM,BergerIJ,etal.NatBiotechnol,2001,19,870~875.
8 DeGrayG.MolGenGenet,2001,127:852~862.
9 DeCosaB.NatBiotechnol,2001,19:71~74.
10 TregoningJS,etal.NucleicAcidsRes,2003,31(4):1174~1179.
11 DanielH,Carmona-SanchezO,BurnsB.Chloroplastderivedanti-
bodies,biopha-rmaceuticalsandediblevaccines.InMolecularFarm-
ing,S.Schilberg,VCHWiley,eds(Aachen,Germany:Verlagpublish-
ers),2004,113~133.
12 HuangAHC.AnnuRevPlantPhysiologyPlantMolBiol,1992,43:
177.
13 ParmenterDL,etal.PlantMolecularBiology,1995,29:1167.
14 SharpJM,DoranPM.BiotechnologyandBioeng,2001,73:338~346.
15 LeeWS,etal.ProcNatlAcedSciUSA,1991,88:6181~6185.
16 LiuJH,etal.MolBreeding,1997,3(3):463~470.
17 VerwoerdTC,etal.PlantPhysiol,1995,109:1199.
18 JiaSR,LiuYH.Asalmoncalcitoninanalogueandthemethodofits
expressioninplantoilbodysystem.China,01144257.3,2001-12-1.
19 MarkleyNA,NykiforukCL,BootheJ,etal.Biopharm,2006,34~46.
20 郭世华,何中虎.中国农业科学,2003,(9):991~995.
21 EdwardsA,MarshalJ,etal.PlantJ,1995,8:283~294.
22 季勤.然科学进展,2006,16(6):679~683.
32