全 文 ：技术与方法
生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2009年第 5期
白三叶生物技术研究进展
李继平 1 徐春波 1 赵来喜 1 王勇2 赵海霞 1
( 1 中国农业科学院草原研究所,呼和浩特 010010; 2 内蒙古农业大学生态环境学院,呼和浩特 010018)
摘 要: 白三叶 ( T rifo lium repens L )是品质优良、易于栽培的一种重要豆科牧草。随着分子生物学和植物基因工程的
发展, 在分子水平上对白三叶进行遗传改良的研究已经取得了部分成果。综述了近 20年来生物技术在白三叶研究领域的
应用。
关键词: 白三叶 生物技术 研究进展
Progress of Biotechnology inWhite Clover
L i J iping
1 Xu Chunbo1 Zhao Laixi1 W ang Yong2 ZhaoH a ix ia1
(
1
G rassland Research Institute, ChineseA cademy of Agr icultural Sciences, H uhho t 010010;
2
College of Ecology
and Environm ent, InnerM ongo lia A gricultural University, H uhhot 010018)
Abstrac:t As an im po rtant legume forage p lant, w hite c love r possesses fine quality o f nutrition and eas ily to be planted. W ith the
developm ent o fm o lecular bio logy and genetic eng ineer ing of the p lant, som e achievem ents about gene tic improvem ent o f wh ite clover
have been obta ined on m olecu lar leve .l Over last twenty years, resea rch on b iotechno logy in the filed o f thew hite c loverw as summ arized
in this paper.
Key words: W hite clov er B io techno logy Progress
收稿日期: 20081029
基金项目:中央级公益性科研院所基本科研业务费专项资金 (中国农业科学院草原研究所 )资助项目 ( 2006001) ,牧草植物种质资源标准化整
理、整合及共享试点平台资助项目 ( 2005DKA21007 )
作者简介:李继平 ( 1981) ,女,河北保定人,在读硕士,主要从事牧草遗传资源研究
通讯作者:徐春波, Em ai:l xcb972002@ 163 com
白三叶是优质的豆科牧草,具有品质优良、营养
丰富、适口性好等特点,主要用作反刍动物的饲草饲
料 [ 1, 2]。此外,在提高土壤肥力、增加地面覆盖、控
制杂草生长、保持土壤温度、减少土壤侵蚀和防风固
沙等方面白三叶同样具有重要的作用 [ 3]。长期以
来,人们围绕经济有效地提高白三叶产量、质量、抗
逆和抗病虫害等目标进行了不懈的努力, 但传统的
育种方法时间长、成本高, 且可利用的种质资源也有
一定局限性,已不能满足育种目标的多样化。随着
现代生物技术的日新月异, 采用转基因技术将外源
基因人工整合到受体基因组中,从而获得转基因植
物已成为可能,并得到越来越广泛地推广应用 [ 4 ~ 6 ]。
就近 20年来国内外有关白三叶组织培养和转基因
方面的研究进行了较全面的阐述。
1 白三叶组织培养研究进展
白三叶组织培养的研究是从上世纪 80年代开
始的,自此大量有关白三叶组织培养的研究工作得
以开展。到目前为止,白三叶的组织培养已经取得
了很大的进展,下面就近 20年来国内外关于白三叶
组织培养的研究做一介绍。
1980年 Cheyne等 [ 7]报道了以 B5为基本培养
基, 白三叶的茎尖为外植体形成愈伤组织,并得到再
生植株。G resshoff等也在 1980年用白三叶进行悬
浮培养细胞,获得愈伤组织后通过分化芽再生植株。
1982年 Dos Santos等 [ 8]以白三叶的叶为外植体, 获
得愈伤组织后通过分化芽再生植株。 1983年, Bho
jw ani等 [ 9]以 MS为基本培养基,以白三叶叶肉原生
质体为外植体,得到了愈伤组织及植株。同年, Par
rott等 [ 10]以 L2、ML8为基本培养基, 以幼苗切段、
茎尖为外植体, 也同样得到了再生植株。 1984年,
生物技术通报 B iotechnology Bulletin 2009年第 5期
Grant
[ 11]以白三叶幼苗切段及悬浮培养细胞为外植
体,以 Ee6为基本培养基, 获得愈伤组织与再生植
株。同年,又以白三叶的幼胚为外植体,以 Ee6为基
本培养基,获得了胚状体及再生植株。 1987年, De
rek等 [ 12]报道了以 MS为基本培养基, 以白三叶茎
段为外植体,获得了再生植株。 1991年, Parrot[ 13]认
为在白三叶草的组织和细胞悬浮培养中, 如不及时
降低 2, 4D的浓度,球形胚就会产生次生胚,而不能
正常发育成成熟的体胚。 1994年, Vo isey等 [ 14 ]在研
究白三叶再生时,发现子叶叶柄部是较好的快速再
生的外植体来源。 1994年, Derek等 [ 15]以 MB为基
本培养基,白三叶的子叶为外植体,通过直接分化获
得了再生植株。
国内开展白三叶组织培养的研究较晚。 1992
年,安利佳等 [ 16]研究了白三叶的愈伤组织的诱导和
植株的再生的方法和技术。 1995年, 周建明 [ 17]进
行了白三叶成熟胚再生不定芽的研究, 在低浓度的
植物生长素和高浓度的细胞分裂素条件下, 成功地
再生了白三叶的不定芽。同年,从白三叶细胞悬浮
培养物诱导不定芽, 用来自白三叶未成熟胚的愈伤
组织建立了细胞悬浮培养系。以后, 利用白三叶的
悬浮细胞系进行农杆菌介导的转基因研究, 已经获
得了载有外源基因的不定芽,但是没有报道完整植
株的形成 [ 18]。 1998年, 黄红等 [ 19 ]用白三叶的叶片
为外植体,筛选出最佳的胚性愈伤组织诱导培养基,
并获得了胚性细胞悬浮系。张德炎等 [ 20, 21]分别于
1998年和 1999年的报道中建立了白三叶的胚性细
胞悬浮系。杨丽莉等 [ 22, 23 ]在 2002、2003年报道了
以白三叶子叶和下胚轴为外植体,进行直接再生,发
现下胚轴的分化率高于子叶的, 可达到 65%以上。
2007年,谷俊涛等 [ 24]的研究表明, 白三叶在适宜的
遗传转化和植株再生的条件下,外植体在选择培养
基上诱导的芽数和植株的数量很高, 诱导的芽率和
外植体再生植株率可分别达到 7037%和 6212%。
2 白三叶转基因研究进展
白三叶转基因研究于 20世纪 80年代初逐步展
开,各种转基因白三叶植株也相续问世。目前,国内
外已报道的转基因白三叶涉及的目的基因主要包括
品质改良、抗病、抗虫和抗逆等方面, 外源目的基因
主要是通过农杆菌介导法转入白三叶植株。
21 品质改良
白三叶是营养价值较高的优良牧草,牧草饲料中
的蛋白质,特别是硫氨基酸 ( SAA),可以显著增加羊的
生产量和羊毛的生产量 [ 25~ 27],所以提高蛋白质含量仍
是白三叶转基因育种的一个重要的目标。Ea ling和
Khan
[ 28, 29]将富含硫的豌豆清蛋白转入白三叶,检测到
转基因白三叶细胞内 SAA蛋白积累占总蛋白的
001%且延长了叶片寿命。另外, 1998年 Sharma等 [ 30]
将 zein基因转入白三叶,明显改善了白三叶的饲用价
值。将果聚糖转移酶基因 SacB转入白三叶草,发现转
基因植株茎中可溶性碳水化合物积累增加 [ 31, 32]。Lud
low将 [ 33]调解细胞分裂素生物合成的异戊烯转移酶
IPT基因用农杆菌介导法转入白三叶,发现再生转基因
植株叶片的衰老期明显滞后。Christainsen[ 34]用 3种启
动子 Assu, CAMV35S, Lssu控制 SSA转化白三叶,证实
不同启动子对外源 SSA 基因表达调控作用的差异很
大,其中 Assu启动子作用下 SSA蛋白积累最高,占叶
蛋白的 01%。
但是,在给家畜单独饲喂白三叶鲜草时,很容易
导致家畜臌胀病的发生, 这与白三叶体内缺乏缩合
单宁密切相关,因此,培育抗臌胀病的白三叶就成为
了白三叶转基因育种的另一个重要内容。例如, 将
从百脉根中分离出的 3个单宁合成的调节基因转入
白三叶,结果表明, 转基因白三叶植株叶片中单宁含
量增加了 [ 35 ]。此外,通过农杆菌介导法将从百脉根
中克隆出的无色花青素还原酶基因 LAR 转入白三
叶, 转基因植株叶片中的缩合单宁水平显著高于对
照,表明可以通过提高 LAR的表达来调控缩合单宁
的水平 [ 36]。
22 抗病
病虫害是造成白三叶减产的重要原因,近年来
白三叶抗病转基因的研究在提高白三叶抗病上已经
取得了较大的进展。白三叶抗病基因研究主要集中
在病毒病和真菌病上。
1993年 Dudas[ 37] 获得了抗白三叶花叶病毒
(WCMV )的转基因白三叶植株。Garrett和 Chu[ 38]在
1997年获得了表达苜蓿花叶病毒 (AMV )外壳蛋白基
因的转基因白三叶植株。Kalla等 [ 39]把 AMV和 WC
MV基因通过农杆菌介导转化白三叶, Northern检测
表明外源基因已在转基因植株中表达。Chu等 [ 40~ 42]
40
2009年第 5期 李继平等:白三叶生物技术研究进展
将 AMV外壳蛋白基因、WCMV外壳蛋白基因和复制
酶基因及三叶草黄脉病 ( CYVV )外壳蛋白基因分别
转入三叶草,所得的转基因植株均具有了一定的抗病
性。国内,赵桂琴 [ 43]用农杆菌介导将 WCMV基因导
入白三叶并得到表达。此后,又以白三叶的子叶为转
化受体,将 AMV基因整合到白三叶基因组中并且得
到了表达 [ 44]。A ldao[ 45]于 2000年利用器官特异和病
原诱导启动子调控抗真菌病 AFR s基因,在转基因三
叶草中检测到了该基因的整合。
23 抗虫
各类虫害对白三叶产量和品质的影响很大,由于
很难找到抵抗这些虫害的白三叶种质资源, 人们开始
探索利用转基因手段获得抗虫的白三叶新材料。目
前,白三叶抗虫基因研究最多的是从苏云金芽孢杆菌
中分离出的杀虫结晶蛋白基因 Bt和从植物中分离出
的蛋白酶抑制剂基因 P I。例如, Vo isey[ 46]将 B t基因
和 P I基因转入白三叶,经检测, Bt蛋白在转基因植株
叶片中积累为 01%, PI蛋白在转基因植株叶片中积
累为 007%。抗虫试验证实杀虫蛋白积累显著,抑制
了W iseana幼虫采食和生长,缩短了其寿命。
24 抗逆
提高白三叶抗逆性, 如抗寒、抗旱、耐盐碱等是
白三叶育种目标之一。试验证明, 通过基因工程技
术调控编码抗氧化物合成酶基因, 可提高植物的抗
逆性。
Spangenberg等 [ 47]将细菌的柠檬酸合成酶基因
转入白三叶, 结果表明转基因白三叶植株在 pH49,
铝浓度为 100 mo l/L的条件下仍能正常生长。在抗
旱和耐盐碱方面, 美国已将甜菜碱醛脱氢酶基因
BADH和逆向转运蛋白基因ANHX 5转入白三叶,以改
善白三叶适应干旱和盐碱的能力。在我国, 陈传
芳 [ 48]于 2004年通过农杆菌介导法将 BADH基因成功
地转化了白三叶,试验发现转基因白三叶植株能够在
含有 05% NaC l的水培养中正常生长两周以上,而非
转基因植株则呈现不正常生长。赵志文等 [ 49 ]利用农
杆菌介导法将反义磷脂酶 D基因 PLD转入白三
叶,通过 PCR和 PCRSouthern杂交鉴定后证实 PLD
基因已整合到白三叶核基因组中。
3 小结
白三叶具有营养丰富、适应性强、适口性好等特
点,是温带地区优良的豆科牧草。传统的杂交育种
在三叶草的研究中已广泛应用, 但传统的育种方法
进展缓慢,周期较长。随着生物技术的发展,利用基
因工程培育和改良植物品种成为便捷和实用的手
段。转基因技术通过引入少量有用基因取代了传统
育种中大量基因的介入, 减少了无用基因对性状改
良的不良影响,从而可以快速实现育种目标。建立
高效而稳定的植物遗传转化体系, 是保证植物转基
因获得大量可供筛选群体的前提条件。目前白三叶
组织培养及遗传转化中还存在许多问题,需要在具
体的试验中对传统的转化方法不断地进行改良和优
化。在我国白三叶生物技术研究起步晚的情况下,
应该利用国内外白三叶生物技术已有的研究成果,
更科学的开发和利用白三叶, 并与传统的育种技术
相结合,培育出新品种, 使白三叶更好的为我国畜牧
业发展及环境的改善服务。
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