全 文 ：健物技术通报
· 研究报告 · 丑了口 曰见 年增刊
中风易感性与候选基因 位点关联研究
张小燕 胡木林 周才秀 王忠, 陈沁‘
’上海芯超生物科技有限公司 , 上海
中国中医科学院中医临床基础医学研究所 , 北京
中国中医科学院西苑医院 , 北京 。洲刃
‘上海博星基因芯片有限责任公司 , 上海 侧〕
摘 要 脑中风是严重危害我国中老年人身体健康的主要疾病之一 , 对中风相关基因单核普酸多态性位点
在人群中分布情况的研究将有助于深入认识中风发病机制及提高防治能力 。 该研究用寡核普酸芯片方法检测 了
个多态性位点与中风易感性之间的关联。 结果发现 寡核普酸芯片技术作为一种很好的基因分型方 法 , 具有高通
量 、平行性 、微量化、 自动化和快速灵敏等的特点 , 适用于大规模基因分型平台的建立 实验初步发现与中风易感性
相关的有血管紧张素原 基因 , , , 载脂蛋 白 基 因 哩
, 一 , 亚甲基四氢叶酸还原酶 基 因 二 , 一 , , 血管紧
张素 型受体 ! 基因 , 一 。
关键词 寡核普酸芯片技术 单核普酸多态性 中风易感性
一
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, 乒硫 哪 , 脚 , 妙 , ,
, 跳。 。少石 了呀 咭 。盯 , 动 ,
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中风病每年造成 50 万人死亡 , 成为世界上第
二大死因 。 我国是中风病高发区之一 , 现有中风病
残存患者达 70 万人 , 且以年发生 巧6 一 2 34 万人的
速度在增长 , 脑中风每年夺去 78 一 1 87 万国人的生
命 , 是国人死亡的首因 。 随着中国人 口老龄化和高
血压患病率的逐年增长 , 中国脑中风患者的绝对数
基金项 目:国家自然基金课题(中医药重大研究计划 )(902 09 0 15 ) , 国家自然基金课题(3067257 )
通讯作者:王忠 , 中国中医科学院中医临床基础医学研究所 , E 一 m ail : 劝ao ya llzh an g@ ho tm ail . co叫 zh on w@ sina .。o m
生物枚术通报 B to tec hn ole舒 2008 年增刊
一定会增长 , 所以深人研究中风的遗传因素和病理
机制以寻找中风有效的防治途径成为了当今医学生
物学的热门课题川 。
单核普 酸 多态 性 ( single nueleotide polym or-
phism , S N p
) 为 D NA 序列变异的基本形式 。 S N p 不
仅可以作为遗传学标记 , 通过连锁或者关联分析定
位疾病易感基因 , 而且有些 SN P 本身就可以导致疾
病 , s N P 对疾病的早期风险性评估 、早期诊断 、预防
和治疗等各方面均有巨大的应用价值[’一 4 〕。 选取了
8 个 SN P 位点为研究对象 , 采取 “病例一对照 ” 的研究
策略 ,建立了基于寡核昔酸芯片技术的 SN P 分型平
台 , 进行候选基因单核昔酸多态性与中风疾病之间
的关联研究 , 以期揭示这些 SN P 位点在中风的发病
机制中可能发挥的作用 , 阐明部分脑中风发病过程
中的遗传学病因 , 为寻找有效的防治途径和个性化
治疗奠定基础 。
l 材料与方法
1.1 主要试剂及仪器
3 一氨丙基 三 甲氧基硅 烷 (3 一 a m i n o p r o p y l t ri m e -
t h o x y s i l a n e A P s )
, 二甲基亚矾 (D M F ) , 购 自德 国公
司 SIG M A 公司 , 1 , 4 苯二异硫氰酸盐(l , 4 一p h e n y l e n e
d l i s o t h i o e y a n at e
,
p D C
)
, 美国 Aldrieh.Chem .Co 产品 。
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TP 美国 Pha rm ac ia 公司产品 。 十二烷基磺酸
钠(SDS ) , 中国上海化学试剂采购供应站分装厂 。
P C R 扩增仪 , G e n e A m p P C R S y s t e m 9 6 0 型 , 购 自美
国 PE 公司 。 点样仪 (Cartesian Pixsys 7500 ) , 美国
eart esian 公司产品 。 扫描仪(SeanAray4( 翔 型) , 美
国 ce ne司 seanning xnC.产 品。 电热恒温 培养箱
(Ro bbins seientifie m odel l仪旧型 ) , 美国 R obbins Sei-
en tific 公司 。 电热恒温培养箱(DN I刃心52 型 ) , 中国上
海精宏实验设备厂 。 低温离心机 , 德国 H era eu s公司
产品 。 P C R 所用相关试剂(Ta q 酶 、 d N TP 、 M g C 1 2 ) 购
自中国大连宝生物工程有限公司 。 电泳仪及凝胶成
像系统 , 中国上海复日科技有限公司产品。
1
.
2 试验设计与 D N A 样本
试验采用随机对照成组设计 。 中风病患者组全
血血样由北京西苑医院神经内科提供 。 诊断标准参
照 19 95 年中华医学会第 4 届脑血管病会议修订的
各类脑血管疾病诊断要点 , 52 例患者均经临床 、 C T
和 M R I扫描确诊 , 其中男 30 例 , 女 2 例 , 年龄 40 -
90 岁 。 对照组 犯 例(为相差 巧 天内住院)的其他
科住院患者 , 其中男 17 例 , 女 巧 例 , 年龄 45 一 8
岁 。 采用 W izard G enom ie D NA purifieation K it(pro-
m eg a公司)试剂盒抽提全血基因组 D N A 。
1
.
3 中风相关基因及 SN P 位点的筛选
根据实验室前期工作及相关文献报道 , 参照
N C BI的 sN P 数据库(~
.nebi.nlm .gov ) , 从候选
基因中选取具有研究价值的 SNP 位点用于寡核昔
酸芯片分型 。 最终选取八个位点分别是 :A GT 基因
M et2 35Thr位点 , A P O E 基因 CysllZA rg (A pO E I) 和
Cys158A嗯 (A P O E Z )位点 , M T H F R 基因 677T (A la。
Val)位点 , T N F p 基 因 Thr2 6A sn 位点 , A T I R 基 因
A ll66e 位点 , e N O s 基因 。164T (Glu一Asp )位点 ,
F G B 基因 A r群阵8场s位点 。
1
.
4 S N P 位点及相应 D N A 片段的克隆及则序
根据相关 文献 , 参 考 N C BI 的 SNP 数据库
(w
.nebi.al m .gov) , 选出与 SN P 位点相应的 DN A
片段 , 进行克隆测序 。
1
.
5 探针的设计
根据步骤 2 中测序结果 , 参考 NC BI 的 sN P 数
据库(w
.nebi.nlm .gov) , 设计检测探针 32 条 , 及
用于质控的阳性探针 、阴性探针各 1 条 , 共计 34 条
探针 。 探针 5 ‘端经氨基修饰 , 用于芯片点样 。 所有
探针序列如表 1所示 。
1
.
6 芯片点样
干净载玻片浸于含 1% APS 的95 % 丙酮溶液中
Zm in , 丙酮浸洗 sm in , 重复 6 次 , 1 1 0 ℃烘烤 45m in ,
再将玻片浸于含2% PDC 的 10 % 毗陡/ DM F 溶液中
Zh , 丙酮溶液冲洗一次 , 室温晾干 , 置 4℃用于点样 。
用点样液溶解合成好的寡核昔酸探针 , 配置 l x 点
样溶液 , 探针终浓度为 10林m o F L , 每条探针横向重
复点样 5 个点 , 用 Cart is an 7500 点样仪按表 3 布局
点于上述经化学修饰的玻片上 。 经过 30 m in 的水
合 , 室温 lh 自然干燥 , 0 . 2 % S D S 洗去未共价结合
DN A , 双蒸水冲掉残余的 SD S , 自然晾干 , 4 ℃保存。
为了保证芯片质量的稳定性和其在不同实验条
件下的可对比性 , 我们将芯片的第一行和第一列设
置为阳性对照 , 并且对于同一个位点的每组探针设
计了五个重复 。 考虑到杂交信号要介于过弱和过饱
和之间 , 对某些位点设计了多组探针 。
年增刊 张小燕等:中风易感性与候选基因 SN P 位点关联研究 167
表 1 SN P 芯片探针设计
GENE PROBE PROBE SEQUEN CE
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NsP Ins
NsPlm s
NsPlnst
N sPlm st
NsPZna
Ns雌ma
NsPZ naZ
NsPZmaZ
Ns解nat
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N sP3 na
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NsP3ns
Ns户ms
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阳性探针
阴性探针
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E
TOPGAA
7 多重 PC R 扩增及芯片杂交扫描 根据所选单核昔酸多态性位点引物 , 由上海生
生物杖术通报 B io te ch nole gy 2 008 年增刊
工公司合成 c卢荧光标记引物 。 通过单重扩增确认
并优化多重扩增条件 。 取 PcR 产物 7ml , 加 l ml
C CO B 阳性对照 , 再加人经 94 ℃ 预热的 2 ‘杂交液
(10’S S P E I % S D S ) S ln , 混合 , 于 94℃变性 3m in , 迅
速冰浴并放置 3m in 。 将全部液体滴于芯片的点样
区 , 盖上盖玻片 , 放置于专用杂交仓中封闭 , 湿盒内
48℃杂交 lhr 。 杂交完毕 , 将芯片取出后用双蒸水
冲去盖玻片 , 然后放人洗脱液(1 x S c/0 .5% sDS)
中上下抽动清洗 sm in 。 取出用双蒸水冲洗 2 一 3
次 , 晾干 。 将上述杂交的芯片插人专用的 Sca nAr -ray40OO 扫描仪中进行扫描 , 吸收波长为 649nm , 激
发波长为 670nm , 扫描强度70 % 一 90 % 。
1
.
8 芯片杂交图谱分析
杂交后阳性探针呈现较强的荧光信号 , 阴性探
针 、空白对照及未杂交上的探针无荧光信号或信号
很弱 , 经激光扫描处理 , 以伪彩色阵列图显示 , 信号
越强 , 颜色越亮。 阳性探针一般呈白色 、 红色或绿
色 , 而阴性探针为蓝色或黑色 。
1
.
9 基因分型
1.9 .1 强度有效性阂值的设定 检测探针平均信
号强度在 200 一 50 0 0 0 之间的杂交点看作是有效
点 , 高于 50 000 则为过饱和 , 而低于 20 则被看作
无信号 。 针对不同样品的芯片杂交情况 , 在判断时
选择不同的探针来分析其基因型 。
1
.
9
.
1 基因分型评判标准 取每组探针 5 个重复
点的平均强度作为该探针的实际杂交强度 , 根据每
组两条不同探针之间杂交信号的比值来确定基因
型 。 若 ra tio < 0.5 或 > 2 , 则该基因为纯合型 , 其突
变位点与杂交信号较强的探针上的可变碱基互补 。
若0.5蕊 rat io 蕊2 , 则该基因可视为杂合型 。
1
.
ro R F 廿 验证及测序验证
为了验证芯片杂交结果的正确性 , 我们选取部
分基因来做限制性片段长度多态性及测序以检验其
基因型 。
1
.
H 数据处理
Sc an Ara 抖0 0 扫描结果用 sca 朋er 图像处理软
件读取各点的信号强度值 , 通过计算同一位点不同
探针杂交信号的强度比来确定基因型 。 通过计数方
法获得各种基因型和等位基因的个数和分布频率。
采用 SPS ro .0 统计软件将数据进行统计学处理 。
组间频率比较采用 xZ 检验 , 用 o R 值和 95 % 的置信
区间来表示基因型和中风的关联性 。 当 P < 0.05
时 , 被认为差异显著。
2 结果
2.1 全血基因组 DN A 提取结果
用分光光度计检测提取的基因组 D NA , 1 : 40 稀
释后 OD 260 值 0.132 一 0 . 5 3 0 , 平均值为 0.30 , 平均
浓度为 583.65n岁林I。 o D 2 6 o / 2 8 0 值 1.67一2 . 1 0 , 平
均值为 1.83 , 纯度均 > 50 。
2
.
2 多重 PCR 扩增
7 个基因分别进行单重 PCR 后 电泳条带清晰 ,
特异性理想 , 产物 长度与设计相符 。 其中 FGB 、
e N O S 基因扩增电泳图谱分别如图 1 、 图 2 所示 。 比
较不同退火温度下的电泳结果设定下一步多重
PCR 中的最适退火温度为 59 ℃ , 在此温度下特异性
和条带强度都较好 。
图1 FG B 基因在个不同的退火温度下
PCR 扩增电泳图谱
图 2 eN oS 基因在个不同的退火温度下
PcR 扩增电泳图谱
2 .3 芯片扫描结果分析
年增刊 张小燕等:中风易感性与候选基因SNP 位点关联研究 16 9
2 .3. 1 杂交图谱 Sca nA ra 科00 扫描后所得杂交
图谱如图 3 所示 , 利用上述基因分型标准识读位点 。
2
.
3
.
3
·芯片质控 阳性探针均饱和或过饱和 , 说明
该杂交体系中互补探针能产生稳定而较强的杂交信
号 , 验证了该杂交体系的可行性 。 所有阴性对照和
空白对照信号均低于 20 , 说明该杂交体系无污染 ,
且假阳性率较低 。
2
.
3
.
2 重复率质控 所有样本在芯片上 5 次重复
检测结果完全相符 , 重复率 10 0% , 说明该体系杂交
条件稳定 , 结果可靠 。
2
.
4 检测结果验证
2.4.1 R F廿 验证 随机抽取 20 例血样用 R F廿
法检测 M T H FR 基因型 , 20 例完全匹配 , 结果与芯片
检测的匹配率为 10 % 。
2
.
4
.
2 测序验证 随机抽取 20 例血样用测序法检
测 A Po E 基因型 , 20 例完全匹 配 , 结果与芯片检测
匹配率为 10 % 。
图3 芯片杂交图
(样品 16 , sc an A ra 抖州x〕扫描仪扫描后 sc~ er 图像处理
软件读取各点的信号强度值 , 吸收波长为64 9nm , 激发波长为670 nm )
2.5
2.5
数据统计
1 试验组与对照组基本情况的分析 采用
A N O VA 检验验证中风组与对照组两组人群年龄不
存在显著差异 (F < Fo.05 , P > 0 . 05 ) 。 采用 难 检验
生物技术通推 刀勿te ch n。勿盯 2008 年增刊
验证中风组与对照组两组人群性别不存在显著差异
(x, = 0 . 3 6 6 , p = 0 . 5 4 5 ) 。
2
.
5
.
2 H a rd y
一
w ei nb
e rg 平衡的验证 所调查人群8
个位点基因型分布符合 Hard y一 W ei nh er g 平衡 , 实际
检出基因型频率数与预期基因型频率数基本一致 ,
说明所抽取的样本完全可以代表整个群体的基因型
分布。
2
.
5
.
3 所检测的 8 个多态性位点中 , 发现与中风易
感性相关的有血管紧张素原 (A GT )基因 M 235 T 多
态性 (T/ C :xZ = 10 .34 , p 二 0 . 0 1 , ( C T + C C ) / 竹:
oR 二 3 . 4 3 7 , e l =
(
一 2 1 1 , 9 . 7 0 9
) )
, 载脂蛋 白 E
(A pO E )基因 eysl58a嗯 多态性 ((G G + A G )/AA :xZ
= 5.607 , p = 0 . 0 1 8 , O R = 9 . 4 3 4 , C l =
(
1
.
6 8 6
,
8 3
.
3
) )
, 亚甲基四氢叶酸还原酶(M TH FR )基因 C67 T
多态性 (T/ C :xZ = 10 .992 p = 0.00 1 , ( T + T e ) /
C C
:
O R
二 2
.
5 9 1 C l = ( 1
.
0 0 2 , 6
.
7 1 1
) )
, 血管紧张素
1 1型受体(ATIR )基因 A l166C 位点(C/A :xZ =
4.520 , p = 0 . 0 3 4 , A A /
(
C C
+
A C
)
:
(
O R
=
0
.
2 1 3
,
C l
二 ( 0
.
0 5 7 , 0
.
7 9 9
) )
, 未发现与中风易感性相关的
有载脂蛋白 E (A PO E )基因 cy sl12 arg 多态性 , 一氧
化氮合成酶(eNO S) 基因 Gl u2 98 A sP 多态性 , 纤维
蛋白原 (FG B )基因 Ar梦“8师s 多态性 , 肿瘤坏死因
子 p (TN F田基因 Th r2 6A sn 位点 。 具体分布情况如
表2 所示 。
表 2 中风组和对照组 8 个位点基因多态性的分布
基因型频率
中风组 对照组位点 基因型 计数 频率 计数 频率 95% Cl
(n 二 5 2 ) ( % ) ( n 二 3 2 ) ( % )
n,内、O矛O丹了
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A G T M 2 3 5 T
A P O E e y s l l Z缨
APOECys158毗
MTH FRC677T
TNFpTh r2 6Asn
Enos Glu298AsP
ATIRAI166C
FC BAr舒48助s
55.8
34.6
9.6
82.7
15.4
1.9
42.3
55 .8
1.9
19 .2
57 .7
23 .1
19 .2
26
4
8 1.3
12 .5
6 .3
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0 .29 1
3.706
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2 . 0 32
1. 54 5
0 . 3 86
2 . 30 2
0 . 6 2
1 .0 7 1
1 .4 57
0 .5 76
1 .3 3 3
0 . 10 3 ~ 0 .8 2 6
1. 1 24 ~ 12 .2 2 2
0 . 29 1 一 8 . 7 5 8
0
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5 4 3 ~ 4
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0
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2 1 0 ~ 2
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0.037 ~ 10 .07 1
0 .267 ~ 1.596
1.09 8 ~ 7 .0 5
0 .012 ~ 0 .593
1.582 ~ 9.09 6
0 .637 ~ 3.7 84
0 .14 9 ~ 0 .998
0 .582 ~ 9.096
0 .245 ~ 1.568
0 .373 ~ 3.0 85
0 .543 ~ 3.9 13
0 .236 ~ 1.407
0 .494 一 3 . 60 1
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年增刊 张小燕等:中风易感性与候选基因SNP 位点关联研究 17 1
3 讨论
血管紧张素原基因 , 位于 1砂2 一 43 处 , 编码区
由5 个外显子和4 个内含子构成 。 其中2 号外显子
704 核昔酸处胸腺嚓陡(T) 被胞嗜陡(C )所代替 , 导
致编码产物第235 号氨基酸由蛋氨酸(M et )变为苏
氨酸(Th r) , 由此产生 3 种基因型 [5] 。 我们对 ATG
基因 M 235T 进行多态性检测发现 A TG 基因 M 235 T
多态性可能是中风的危险因素 , 其分子机制可以这
样理解:A GT 是肾素一血管紧张素系统(R AS) 的重要
成分 , 是活性物质血管紧张素 (Ang )的唯一前体物
质 。 而 R A S 在维持体内电解质平衡及血管抗性方
面起重要的作用 。 血浆中AG T 蛋白的浓度直接影
响 Ang 的生成 , 进而影响血管抗性和血压 , 导致心
脑血管疾病的发生【6] 。
A P O E 基因位于第 19 号染色体上 , 由4 个外显
子和 3 个内含子组成 , 其中大部分蛋白编码序列都
位于第4 外显子区域 。 成熟的 A POE 是由29 个氨
基酸组成的富含精氨酸的单链多肤糖蛋 白。 A P O E
多态性的分子学基础是第 112 位(即 A PoE I) 和第
155位 (即 APo EZ )上半胧 氨酸 (eys ) 和精氨酸
(A rg )的互换川 。 研究结果表明 A Po EI 对中风易
感性无显著影响 , 而 APO EZ 基因型 A G 分布频率较
对照组显著升高且中风相对风险率较 (A A + G G )显
著升高;其分子机制可能是该突变可以升高血浆胆
固醇水平 , 加速动脉粥样硬化的形成 , 使卒中及血管
性痴呆的发病率升高〔’〕, 并且可能与高血压和肥胖
有关〔9] 。
人 M TH FR 基因定位于常染色体 1p363 上 , 包
括 1 个外显子和 10 个内含子 , 位于第 4 外显子的
C677T (Al a、V al )碱基突变最为常见 。 我们的研究
结果表明 C67 T ( Al a、V al )会导致中风易感性增
加 ,其分子机制可能如下 :血浆同型半胧氨酸(H cy )
水平升高已被广泛认为是心脑血管病的独立危险因
素 , H cy 再 甲基化反应需 M T H FR 作为关键酶参
与[’。] , 由于 M T H FR e 677T ( A lao V al)转变导致编码
产物热敏感性改变而致酶活性改变 , 突变纯合子酶
活性只有正常的 30 % , 杂合子酶活性为正常 65 % ,
而酶活性的改变导致血 hcy 水平的增高 , 使个体中
风风险率增大【川 。
人 ATI R 基因定位于染色体 3够1 一 25 , 长度约
5 kb , 含 5 个外显子和 4 个内含子 , 编码氨基酸 n
66 位核昔酸发生 A o C 的点突变可产生 A A 、 A C 和
c c3 种基因型[’2〕。 A TI R 可导致脑动脉和微动脉的
收缩效应 , 促进儿茶酚胺和前列腺素释放 , 引起血管
平滑肌细胞过度肥厚或增生 , 降低血管腔/壁比值而
导致中风。 多态性导致中风易感性的原因可能也与
此有关 ,但是其具体机制尚在研究中。
肿瘤坏死因子 日(TN Fp )是一种具有复杂生物
学活性的细胞因子 , 为活化的淋巴细胞所分泌 , 在免
疫调节基因产物的联合反应和调控中起重要作
用[” ] 。 T N F p Th 论6 A s。 多态性位点位于 TN Fp 基因
的第一外显子内 , 第三个碱基置换导致第 26 位氨基
酸的改变 , 即 AA C = A sn (天门冬酞胺)改变为 A CC= Th r(苏氨酸) 。 一氧化氮合成酶在内皮依赖性血
管舒张反应中起着十分重要的作用〔‘4 〕。 e N o s 基因
外显子 7 的第 19 1 位核昔酸转换(G o T )造成了氨
基酸替换 , 使第 298 号氨基酸残基 由谷氨酸(Gl u)
转变为天冬氨酸(As p) (Gl u2 98 o As p )[ ” ] 。 本实验
未在Th r2 6As n , Gl u2 98 As p 多态性与中风发病之间
发现显著的关联性 , 提示上述多态性在中风病人发
病的遗传因素中可能不起重要作用 [’6 ] 。
编码 Fg 的基因簇约 45kb , 位于第 4 号染色体
4q2 8(4q2 3 一 q 3 2 ) 。 B p 链的基因长约 skb , 有 8 个
外显子 , 7 个内含子 。 我们研究的位点位于 8 号外
显子 pe科s (G、A ) 处[”] 。 纤维蛋 白原 (fibdno-
ge n , F g ) 是重要的凝血因子 , 在凝血 、血小板聚集、纤
溶调节 、动脉硬化的发生发展等诸多方面起着重要
的作用 , 目前研究多认为 Fg 是心血管疾病 、 心肌梗
塞 、外周动脉性疾病 、脑血管缺血性中风等的独立危
险因素之一[‘8 〕。 实验中 FG B A rg4 48场s多态性在
中风疾病的形成和发生过程中未发现相关性 , 很可
能是由于由于突变后编码的赖氨酸和突变前的精氨
酸同为碱性氨基酸 , 突变前后编码产物的物理化学
性质及形态结构等不会发生太大的变化的缘故 。
综上所述 , 寡核昔酸芯片作为一种新兴的技术
检测平台 , 具有明显的高通量 、集成化 、并行性的检
测优势 , 且结果直观 , 易于保存和携带 , 非常适合疾
病相关基因的分型检测仁” ] 。 在本实验所用芯片设
计的基础上提高位阵列密度 、增大检测通量 , 以期筛
(下转第 175 页)
年增刊 魏敬双等:重组单抗药物的肤图分析 175
为从重组单抗的肤图谱得到更多的信息 , W an
等[’]还曾尝试过先将重组抗体的轻链 、重链分开 ,
分别进行蛋白酶裂解之后进行 RP 一 H P L C 分析 。 利
用这种方法 , 鉴别出了一种单抗 CG P5 6901 的重链
发生交联变异的情况 。
在对抗体样品进行变性及胰蛋 白酶裂解前 , 均
需将抗体样品的缓冲液置换为适于进行下一步操作
的环境中, 常规的换液方式是采用透析法 , 透析换液
的过程非常耗时 , 一般需要透析几个小时 , 而且在透
析过程中 , 常常伴随着样品的稀释 , 透析换液后样品
浓度降低。 本试验中 , 所有的换液操作通过超滤离
心完成 , 使用超滤离心管 , 可以在很短的时间内完成
换液操作 , 同时 ,样品还可以很方便地浓缩到所需要
的浓度 。 所以 , 只要选择好合适的截流量 ,使用超滤
离心管进行换液操作是代替透析法的非常实用的手
段 。 鉴于台式高速离心机在一般的分析检测实验室
已经属于常规仪器 , 所以用超滤离心代替透析法并
不需额外的仪器设备 , 却可以大大缩短实验的时间 ,
同时也避免了频繁更换透析液的繁琐操作。
除重组单抗药物外 ,其它一些分子量大 、结构复
杂 、二硫键含量高的重组蛋白药物(如我公司在研
的重组人血白蛋白 , 每分子含 17 对二硫键)的肤图
谱分析都可以适用于本研究所建立的方法 。
参 考 文 献
国家药典委员会. 中华人民共和国药典.( 20 5年版 3 部). 北
京:化学工业出版社 , 2 0 0 5 , 附录 43 一 4 .
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(
4
)
:
4 8 5
一 4 8 8
.
( 上接第 171 页)
选和检测更多中风相关多态性位点是我们研究的下
一步目标卿〕。 将寡核昔酸芯片用于疾病与 sNP 的
关联分析这个思路是可行的 , 芯片的高通量 , 平行性
的特点 , 将会对多基因遗传病的分子病理机制的研
究和易感基因的检测及个性化治疗起到较大的推动
作用 [21]。
参 考 文 献
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