全 文 ：综述与专论
生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2009年第 5期
转 Bt基因抗虫玉米的研究
李桂玲1, 2 李明泽 3 刘宗华 2 汤继华 2
( 1河南工业大学生物工程学院,郑州 450052; 2 河南农业大学,郑州 450002; 3濮阳职业技术学院,濮阳 457000 )
摘 要: 对转 Bt基因抗虫玉米的研究概况、转化方法、转化体的鉴定方法、遗传评价以及其存在的问题进行了综述。
关键词: 转 Bt基因 玉米 抗虫性
Research Overview on Bt Transgenic InsectResistantM aize
L iGuiling
1 L iM ingze3 L iu Zonghua2 Tang J ihua2
(
1
D epartm ent of Bioengineering , H enan University of T echnology, Zhengzhou 450052;
2
H enan Agricultural
University, Zhengzhou 450002;
3
Puyang Po ly technic, Puyang 457000)
Abstrac:t In th is paper, B t transgen ic insectresistantm a ize research prog ress, transform ing and the identification m ethods, g enet
ic assessm ents and the prob lem s around them w ere rev iew ed。
Key words: Bt transform ed gene M aize Insectresistant
收稿日期: 20081205
基金项目:河南省自然科学基金资助项目 ( 2000210003)
作者简介:李桂玲 ( 1974) ,女,河南沁阳人,讲师,研究方向为生物技术
亚洲玉米螟 Ostrinia furnacalis ( Guenee)鳞翅目,
螟蛾科, 主要分布在亚洲。我国除青藏高原玉米区
末见报道外,广布全国各玉米种植区。寄主为玉米、
高粱、谷子、棉花、大麻,此外也能为害小麦、大麦、马
铃薯、豆类、向日葵、甘蔗、甜菜、茄子、番茄等 20多
种植物。玉米心叶期幼虫取食叶肉或蛀食未展开的
心叶, 造成 花叶 ,抽穗后钻蛀茎秆, 致雌穗发育受
阻而减产, 蛀孔处易倒折。穗期蛀食雌穗、嫩粒,造
成籽粒缺损霉烂, 品质下降, 减产 10% ~ 30%。随
着植物细胞生物学和分子生物学的发展, 利用生物
基因工程技术将外源抗虫基因 B t导入玉米,使玉米
自身产生抗虫蛋白而达到抗虫目的成为可能。转
B t基因抗虫玉米的商品化,为控制玉米螟为害提供
了新的途径。
1 转 B t基因玉米的研究概况
1993年, Koziel[ 1]等报道合成了一个 Cry1Ab基因,
该基因编码 Bthuringiensis, kurstakiHD1的 Cry1Ab的
部分氨基酸。该合成基因与野生型 C ry1Ab基因只有
65%的同源性。合成基因富含 G, C碱基,并且以适合
在玉米中表达的密码子替代原细菌密码子。他们利
用基因枪把该合成基因导入一个玉米品种, 并且对
筛选出的两个转基因玉米品系进行了田间试验。一
个转基因玉米品系的 Cry1Ab基因由 CaMV 35S启
动子调控,而另一个转基因玉米品系的 Cry1Ab基因
分别由玉米磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶 ( PEPC ase)启
动子和玉米花粉特异性启动子调控。由 PEPCase启
动子和玉米花粉特异性启动子调控下的 C ry1Ab基
因在转基因玉米植株中的表达显示出明显的组织特
异性,在绿色组织中, C ry1Ab基因强烈表达,占可溶
性蛋白的 01% ~ 04%。田间试验结果表明,玉米
转基因品系能够抵御欧洲玉米螟 (O strin ia nubilalis)
在生长季节的反复危害。
国内转 Bt基因玉米研究起步较晚。北京农业大
学生物学院丁群星 [ 2]等首次报道了用子房注射法将
Bt毒蛋白基因导入玉米自交系的全过程。获得的一
株转基因玉米 (T0)自交,得到了 71株 T1代的植株。
转基因玉米 ( T0)经点渍法、Southern分子杂交及 PCR
扩增检测,在 71株中有 7株呈阳性反应; 对其中 4株
进行抗玉米螟测试,呈现一定的抗虫效果;在海南岛
用农大 60玉米再次进行了子房注射,也获得了成功。
生物技术通报 B iotechnology Bulletin 2009年第 5期
说明这种方法是可重复的,从而为我国利用基因工程
技术改造玉米开辟了新的途径。
1995年,北京农业大学生物学院王国英等 [ 3]报
道了用玉米悬浮细胞、愈伤组织和幼胚作受体,通过
基因枪轰击法成功地将 B t毒蛋白基因转入玉米细
胞。并再生了大量转基因植株,部分植株得到种子。
部分转基因植株的室内饲喂试验表明, 这些植株的
抗虫性差异很大,有少量植株表现出高度抗虫性,个
别植株几乎没有抗虫性。虽然基因枪轰击愈伤组织
和未成熟幼胚比轰击悬浮细胞所得到的转化体少,
但由于它们易于培养和再生植株, 故适合于大部分
玉米品种的遗传转化研究。
1997年,中国农业大学生物学院的张宏等 [ 4]报
道了应用超声波法,首次成功地将 Bt毒蛋白基因导
入玉米,并获得了可育的转基因植株及后代。 South
ern杂交结果证明, 外源基因已整合进 R0植株和 R1
代的染色体组中。研究还指出:超声波声强度和处理
时间是决定超声波介导法转化率的两个最重要参数,
并证明以 05W / cm2的声强、处理转化效果最佳。适
当参数的超声波处理能使稀薄表面形成大量的小孔,
又减少了外源 DNA分子的断裂,从而使外源 DNA分
子进入细胞。
2 转 B t基因玉米的转化方法
目前国内外主要采用基因枪轰击法 [ 1, 3, 5 ~ 8 ]、子
房注射法 [ 2]、超声波法 [ 4 ]将 B t基因和其它外源基因
导入玉米。迄今为止,基因枪法仍是用的最多、效果
最好的方法,其受体广泛, 可以克服农杆菌介导受寄
主的限制,但基因枪法存在转化率低、重复性差等缺
陷。因此,在玉米遗传转化方面,又有部分人转向农
杆菌介导的转化研究。近年来,有人证明一定浓度
( 20 M )乙酰丁香酮等酚类化合物可以活化 T i质
粒的 v ir区基因,从而提高转化频率, 这就为克服单
子叶植物的遗传转化受农杆菌寄主的限制提供了可
能。最近又出现了一种新的高效农杆菌转化靶组织
方法 ( son icated assisted agrobacteriummed iated trans
fo rmation, SAAT) ,该技术主要是将外植体在接种农
杆菌后经短暂的超声波处理,从而提高该项转化技
术的转化频率。该项技术能成功应用于玉米等禾谷
类作物,则会使禾谷类作物的遗传转化研究迈上一
个新台阶。
3 转化体的鉴定方法
目前, 应用于转基因植物的鉴定方法可分为利
用标记基因和报告基因进行检测、分子检测和免疫
技术 3大类。
31 标记基因和报告基因
标记基因常常用于植物遗传转化中筛选和鉴定
转化的细胞、组织、器官和再生植株, 通常与目的基
因构建在同一植物表达载体上,一起转入受体。有
时标记基因本身也可作为目的基因转入受体, 用于
基因遗传转化的基础研究或获得抗除草剂转基因
植株。
选择标记基因包括抗生素抗性基因和除草剂抗性
基因等。常用的抗生素基因有抗氨苄青霉素基因
( ap
r
)、抗四环素基因 ( tcr )、抗氯霉素基因 ( cmr )、抗卡
那霉素基因 (km r )、抗潮霉素基因 ( hygr )等。从分子生
物学角度而言,此类抗生素会造成细胞壁合成受阻,抑
制蛋白质的合成,抑制 DNA或 RNA的合成等。这些
选择标记基因已在棉花 [ 9]、拟南芥、烟草 [ 10]、大白菜 [ 9]、
矮牵牛 [ 11]、油菜 [ 12]等转基因植物中广泛应用。对于抗
生素不敏感的植物,可采用抗除草剂基因,由于抗除草
剂基因的转基因植株对人畜无毒害作用,是很有价值
的选择标记基因。例如,膦化麦黄酮基因用来替代卡
那霉素抗性基因在转基因谷类中得到应用。除草剂抗
性主要功能:作为某些酶的抑制剂,进一步抑制某些氨
基酸的合成。因此将除草剂基因转入植物体中,为除
草剂的推广使用奠定了基础。
报告基因是一种指示基因,把它的编码序列与
调控基因表达的启动子序列相融合, 其表达能够快
速报告细胞、组织、器官或植株是否被转化。报告基
因大多是一些酶的基因,利用加入相应底物,检测酶
活性是否存在,相应地指出目的基因是否转化。常
用的报告基因有 3类:农杆碱合成酶类,抗生素转化
酶类和具有光学性质的酶类。最为常用的是 GUS
基因,即 葡萄糖苷酸酶基因。GUS基因已成功地
用在谷子 [ 13]、玉米 [ 14]、大豆 [ 15]、油菜 [ 16]等作物转基
因研究中。另外, 半乳糖苷酶基因,荧光素酶基因
等在基因工程研究中亦有应用报道。随着报告基因
的不断发现,一种集选择与筛选于一体的绿色荧光
蛋白 GEP随之出现。它没有种属依赖性, 不需
要加入底物、酶、辅因子等,只需要暴露在 395 nm或
10
2009年第 5期 李桂玲等:转 Bt基因抗虫玉米的研究
490 nm的光下,转化的细胞、组织、器官或植株便会
激发出绿光 [ 17]。
32 分子检测
321 PCR 聚合酶链式反应 ( polymerase cha in re
act ion, PCR )是在体外对特定 DNA序列进行扩增。
PCR检测方法简单,将扩增产物和分子量标记 ( mark
ers)进行琼脂糖凝胶电泳, 经溴化乙锭染色,在紫外
光下观察是否出现预测的目的基因片段。具有目的
基因片段的植株为转基因植株。在 PCR的基础上,
人们又用了复合 PCR( mu ltiplex PCR, M PCR) [ 18]等来
检测外源基因是否成功转入。
322 分子杂交 分子杂交是鉴定转基因植株在
中外源基因是否整合到染色体上或是否在 RNA水
平或蛋白质水平表达的重要方法, 现已广泛应用于
转基因植物的鉴定 [ 16~ 18]。原理是依据探针与外源
目的基因碱基同源性配对进行的, 杂交后能产生杂
交印迹或杂交带的植株为转基因植株。分子杂交有
Southern杂交、N orthern杂交和W estern杂交。
Southern杂交是以外源目的基因的基因序列作
探针与转化植株的总的 DNA进行杂交, 是 DNA水
平上的分子鉴定。N orthern杂交是以外源目的基因
序列作探针与 RNA杂交,它是在转录水平上进行的
分子鉴定。Western杂交则是在翻译水平上或蛋白
质水平上的鉴定方法。
33 免疫技术
免疫技术是一种蛋白质水平上的检测手段,主要
有酶联免疫吸附法和免疫荧光技术两种。酶联免疫
吸附法 ( enzymelinked immunosorbent assay, ELISA )
是特殊的抗体被结合固定在固体表面如微孔板。加
入样品,未被结合的成分被洗掉,然后,通过加上酶标
的抗体来检测抗原,未被结合的成分再次被洗掉, 酶
与底物反应的颜色与样品中抗原的含量成正比。只
要获得目的基因的产物,均可采用这种方法 [ 19~ 21]。
免疫荧光技术 ( immunof luorescence)也是以抗
体为基础,一抗与结合有荧光色素的二抗结合,所发
出的荧光可由免疫荧光显微镜进行检测。
34 田间鉴定
玉米抗螟性田间鉴定是根据玉米螟的生物习性
及其为害规律,在玉米生长发育的不同时期如心叶
期、抽雄期、花丝期进行人工接虫鉴定, 以玉米植株
的受害程度评价各供试品种的抗螟性水平。
根据侵染方式不同又可分为自然落卵鉴定技术
和人工接种技术。前者是以玉米在田间自然发生的
玉米螟为害,在各品系中所表现的受害状不同,判断
其抗螟性高低。此鉴定方法的优点是简单, 缺点是
自然发生的螟虫在时间上不整齐,空间分布不均匀,
年度间发生量差异较大, 使鉴定结果的准确性受到
很大影响。人工接种鉴定, 克服了自然落卵鉴定技
术的缺点,鉴定结果准确性高、可比性强。但必需具
备玉米螟人工大量饲养技术和条件。这一方法是目
前国内外公认的和常采用的方法。
接虫时期一般在春玉米播种后 40 d和夏玉米
播种后 35 d,即玉米植株长出 6~ 8片完全展开叶
时,进行心叶期人工接虫。在玉米长至露雄期进行
穗期接虫,每个供鉴定品系接虫 20 ~ 30株, 3次重
复。接虫方法主要包括以下 3种: ( 1)接虫枪接虫
法是将亚洲玉米螟的初孵幼虫与一定量的介质载体
(如 40筛目玉米穗轴颗粒 )混合后用接虫枪 ( B azoo
ka)将幼虫接入玉米心叶丛中, 大喇叭口或雄穗上、
雌穗新鲜的花丝上,每株 40~ 60头幼虫。通常在雄
穗和花丝上接虫后套袋以防止天敌捕食等。 ( 2)小
玻璃管接虫法是将黑头卵 2块放入直径 08 cm, 长
45 cm的指形管中并盖上编号, 皮塞上钻一孔, 孔
中塞些脱脂棉。将指形管放入盘中置于室温条件下
盖上湿毛巾保湿,待卵块孵化后拔掉指形管塞子,将
初孵幼虫投入心叶丛中、大喇叭口或雄穗上、雌穗新
鲜的花丝上。 ( 3)接黑头卵法是将黑头卵接入玉米
心叶丛中、大喇叭口或雄穗上、雌穗新鲜的花丝上,
每株接 2块卵,约 60粒卵。通常心叶期在第一次接
虫 5~ 7 d后再接 1次。
一般穗期接虫 15 d后检查活虫成活率, 称活虫
体重, 3周后检查茎秆上虫孔数和剖秆测量隧道长
度,统计平均单株虫孔数和隧道长度。根据不同品
系雄穗对玉米螟幼虫生长发育影响的特点, 以幼虫
成活率和体重作为抗感指标。由于欧亚两种玉米螟
穗期世代为害习性差异较大, 故采用不同的鉴定标
准, 我国常采用的标准是叶片的 9级分级标准和茎
秆抗性的 5级分类标准 [ 22, 23]。但亦有文献报道, 采
用茎秆抗性的 5级分类标准较好, 因茎秆隧道长度
和茎有极显著的相关关系, 而叶片虫孔数和茎秆隧
11
生物技术通报 B iotechnology Bulletin 2009年第 5期
道长度以及茎秆虫孔数之间无线性相关 [ 24 ]。
另外,也有利用生物鉴定方法。生物鉴定就是
在转基因植株上接虫或以叶片喂食玉米螟幼虫,测
定致死率,以测定植株的抗虫性能。
4 遗传评价与利用
虽然目的基因是随机整合到玉米基因组中,但
多数研究证明外源基因的插入具有序列特异性。目
前有报道认为, B t基因在玉米中呈简单的孟德尔遗
传 [ 25, 26 ]。由于外源基因通过遗传转化能在植物体
中稳定的遗传,对某些不易转化的优良自交系或品
种可以通过回交转育的方法,将外源基因转移到其
它自交系或品种上,从而获得相应的转基因品系。
5 转 B t基因玉米研究存在的问题
51 转 B t基因的高效表达问题
培育高效表达和稳定遗传的抗虫品种是 Bt转
基因抗虫育种的关键。影响 B t毒蛋白表达强弱的
因素大致有 B t基因的特征是否适合在高等植物中
表达; 启动子类型; 转基因技术受体品种的遗传背
景;以及 B t基因在受体基因组插入的位置 [ 27, 28]。
人们对 B t基因的改造工作仍在进行之中, 其主
要目的是通过对遗传密码子进行优化, 使其更适合
于在高等植物中表达,从而提高 B t基因毒蛋白的表
达水平,增强转基因植株的抗虫能力。启动子对基
因的表达也有很重要的作用, 与 CaMV 35S启动子
调控相比,由 PEPCase启动子和玉米花粉特异性启
动子调控下的 C ry1Ab基因具有更高的表达效率。
另外转基因技术可能会影响目的基因在受体基因组
中的行为, 同时遗传背景可能会影响 B t基因的表
达,并且 B t基因是随机整合到受体基因组中,可能
存在着较大的位置效应 [ 29, 30]。
52 抗虫持久性和抗虫基因持久性问题
大面积种植转基因抗虫玉米, 昆虫产生抗性是
必然的。中国农科院范云六指出昆虫产生抗性是对
植物 Bt抗虫基因工程的一个挑战, 值得加以重视。
江苏农科院与中国农科院生物技术中心及上海生化
所合作,已将 B t基因和豇豆胰蛋白酶抑制基因构建
在一起,培育出双价抗虫棉 [ 31] , 解决了单基因抗性
脆弱性的问题。卫剑文等 [ 32]将 B t基因和大豆胰蛋
白酶抑制基因 (SBTI )一起导入水稻, 结果表明转双
抗基因植株较单基因植株又有更高的抗性。转基因
玉米的抗虫持久性问题可以借鉴这些成功经验加以
解决。同时,为预防和延缓玉米螟对转 B t基因产生
抗性,一般可采用在转 Bt基因抗虫玉米种植区设置
非转 B t基因玉米 庇护所 , 同时严格禁止在转 Bt
基因玉米种植区内种植别的转 B t基因植物。
由于基因突变、拟等位交换等造成基因丢失,或
由于其他原因使抗虫基因表达受抑制等都会造成抗
虫基因的失活而丧失抗虫性。因此, 在转基因作物
品种应用和布局上, 要重视保持遗传多样性这一
原则。
53 转基因抗虫玉米的安全性问题
玉米是重要的粮食作物, 将 Bt毒蛋白基因导入
玉米并表达, 对人类的安全是否存在潜在威胁 [ 33] ,
目前国内外尚缺乏权威性报道, 但多数研究证明 Bt
毒蛋白只对鳞翅目昆虫存在毒性, 而对其它动物特
别是人类和哺乳动物未有毒性。按照国际经合发展
组织 ( OECD) 1993年提出的 实质等同性原则, 转
Bt基因玉米和传统玉米作为饲料或食品的安全性
相比,不存在差异 [ 34]。另外, 大量种植转基因植物
对环境、生态、人类的危险性目前尚难预测。 1993
年, 国家科委发布了 基因工程安全管理办法 , 农
业部 1996年颁布了 农业生物基因工程安全管理实
施办法, 并成立了农业生物工程安全管理办公室,
用法律形式规范转基因的研究和开发利用 [ 35 ]。
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