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生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2011 年第 7 期
小菜蛾线粒体复合物Ⅲ铁硫蛋白基因 5上游调控
区域的克隆及序列分析
龚亮 张彦博 耿鹏 胡美英
(华南农业大学农药与化学生物学教育部重点实验室，广州 510642)
摘 要: 利用 Tail-PCR 技术克隆了小菜蛾线粒体复合物Ⅲ铁硫蛋白亚基的基因组 DNA 序列，全长 5 013 bp，GenBank
登录号为 HM210791。研究表明，该基因具有 3 个内含子，大小分别为 96 bp、577 bp 和 549 bp，且其内含子两端具有典型的
GT-AG结构。生物信息学分析表明，该基因 5上游调控区域不仅包括 TATA-box 等启动子核心序列，而且含有 BR-C Z4、Hb、
Dfd、CF2-II和 HSF等转录因子结合位点。进一步鉴定了该基因的转录起始位点、启动子序列和 CPG 岛区域。为小菜蛾线粒
体复合物Ⅲ铁硫蛋白亚基的转录调控机制和具体的生理功能研究提供一定基础。
关键词: 小菜蛾 线粒体复合物Ⅲ铁硫蛋白亚基 Tail-PCR 5上游调控区域
Cloning and Sequence Analysis of 5Regulatory Region of Rieske
Iron-Sulfur Protein Gene in Diamondback Moth，Plutella xylostella
Gong Liang Zhang Yanbo Geng Peng Hu Meiying
(Key Laboratory of Pesticide and Chemical Biology，Ministry of Education，
South China Agricultural University，Guangzhou 510642)
Abstract: The insect mitochondrial inhibitors target the protein of respiratory chain but its genome structure and regulation mech-
anism has been reported by only a few researchers． In this study，5 regulatory region of Rieske Iron-Sulfur Protein in P． xylostella was
cloned by Tail-PCR having the size of 5 013 bp and GenBank No． HM210791． The results showed that this gene has three introns having
the size of 96 bp，577 bp and 549 bp，respectively，and its terminal has GT-AG structure． Biological informatics analysis showed that the
results not only contain the core promoter sequences(TATA-box) ，but several transcriptional elements(BR-C Z4，Hb，Dfd，CF2-II)as
well． Furthermore，transcription initiation site，promoter sequence and CPG island were also been identified and analyzed． This study
provides a clue for the regulation mechanism and specific physiological function of Rieske Iron-Sulfur Protein in P． xylostella．
Key words: Plitella xylostella Rieske iron-sulfur protein Tail-PCR 5-upstream regulatory region
收稿日期:2010-12-09
基金项目:国家自然科学基金项目(30871660) ，高等学校博士学科点专项科研基金项目(20094404110019)
作者简介:龚亮，男，硕士研究生，研究方向:农药分子毒理学;E-mail:lxian82@ 163. com
通讯作者:胡美英，女，博士生导师，研究方向:植物源农药及昆虫行为的分子机制;E-mail:humy@ scau. edu. cn
小菜蛾［Plutella xylostella(L．) ］是十字花科蔬
菜的重要害虫，也是对农药产生抗药性最强的害虫
之一。据估计，近年来该虫每年的防治费用高达 10
亿美元［1］。在中国，小菜蛾对菊酯类、有机磷类、苯
甲酰基脲类杀虫剂、沙蚕毒素类和微生物 BT(Bacil-
lus thuringiensis)杀虫剂等的抗药性均有报道［2，3］。
目前，常规杀虫剂对小菜蛾的防治效果普遍较差，因
此，从分子水平深入研究小菜蛾线粒体相关蛋白的
序列和功能特性，将为小菜蛾线粒体抑制剂的研究
提供参考。
线粒体是“细胞能量工厂”，其主要功能是通过
氧化磷酸化进行能量转换，为细胞活动提供能量。
其中，氧化过程由线粒体内膜上的 4 个呼吸链膜蛋
白复合物(简称复合物Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ)来完成。线
粒体复合物Ⅲ又称 CoQH2-细胞色素 c 还原酶复合
物，含 1 个细胞色素 c1、2 个细胞色素 b(b566 和
b562)和 1 个铁硫蛋白(Rieske Iron-Sulfur Protein，
RISP)。复合物Ⅲ催化电子从辅酶 Q 向细胞色素 c
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2011 年第 7 期
传递，并且每传递一对电子，同时传递 4 个 H +到膜
间隙，以此形成电势差利于 ATP 的形成，抗霉素 A
是线粒体复合物Ⅲ的电子阻断剂［4］。而位于中心
位置的线粒体复合物Ⅲ铁硫蛋白亚基(RISP)对于
电子从辅酶 Q 向细胞色素 c 传递速率有决定性的
作用［5］，突变该蛋白将会显著降低线粒体复合物Ⅲ
的活性［1，6］。
本研究在前期小菜蛾线粒体复合物Ⅲ铁硫亚基
cDNA 全长克隆的基础上，进一步利用 Tail-PCR
(thermal asymmetric interlaced PCR)技术，鉴定了该
基因 5上游调控区域序列，为深入研究该基因的转
录调控机制和针对该靶标的线粒体抑制剂的研究提
供了一定的参考。
1 材料和方法
1. 1 供试昆虫及试剂
供试小菜蛾为野生品系，收集于未施农药的
甘蓝田，由本实验室长期饲养供试。饲养条件:温
度(25 ± 1)℃，相对湿度 70% － 85%，光周期 16 ∶ 8
(L∶ D)。幼虫饲养于菜心苗。大肠杆菌感受态细胞
(DH5α)由本课题组制备和保存。Genome Walking
试剂盒为 TaKaRa 公司产品，货号为 D316。琼脂糖
凝胶 DNA 回收试剂盒为 TIANGEN 公司产品。
pMD20-T 载体、Taq DNA 聚合酶、DL2000 DNA
Marker均购自 TaKaRa公司。
1. 2 方法
1. 2. 1 小菜蛾基因组 DNA的提取及检测 取 5 头
小菜蛾 4 龄幼虫(约 80 mg) ，加入含 500 μL 5%
SDS 的裂解缓冲液，充分研磨后用苯酚、氯仿反复抽
提，12 000 r /min离心 10 min，再加入 500 μL 苯酚，
12 000 r /min 离心 10 min，移取上清液至一新 Ep-
pendorf 管中，加入 50 μL 715 mol /L 醋酸铵和 800
μL 冰乙醇，置于冰上 15 min。挑取悬浮状 DNA 到
一新 Eppendorf 管中，加入 500 μL 70% 冰乙醇洗
涤，干燥以去除乙醇，加入 30 － 50 μL ddH2O 悬浮
DNA。用琼脂糖凝胶电泳鉴定其完整性后 － 20℃保
存备用。
1. 2. 2 小菜蛾粒体复合物Ⅲ铁硫蛋白基因组 DNA
的克隆及测序 以小菜蛾基因组 DNA为模板，进行
PCR扩增。依据我们之前报道的小菜蛾 RISP 基因
cDNA全长序列(GenBank 登录号:EU815629) ，设计
了 1对特异性引物用于小菜蛾 RISP 基因组 DNA 的
扩增。其中上游引物含有起始密码子 ATG，下游引物
带有终止子 TAA(表 1)。为了提高准确性，用高保真
酶进行 PCR扩增，反应程序:94℃预变性 3 min;35 个
循环，94℃ 30 s，55℃ 45 s，72℃ 1 min;最后 72℃延
伸 10 min，4℃ 保存。上述 PCR 反应结束后，用
1. 2%的琼脂糖凝胶电泳检测，PCR产物经过 TIAN-
GEN凝胶回收试剂盒纯化回收，参照 pMD20-T载体
说明书连接到此克隆载体，然后转入大肠杆菌
(DH5α)感受态细胞，挑取白色菌落，培养后提取质
粒，用 PCR的方法进行重组质粒的鉴定。选择经过
PCR鉴定为阳性的菌液送上海英骏生物技术有限
公司进行序列测定。
表 1 用于扩增小菜蛾 RISP 基因 5上游区域的引物
名称 引物序列(5→3)
Genome Walking-SP1 GTTTACTGACCTCCAGCGATGAGGT
Genome Walking-SP2 TGAGTTGGCACTGAAACCACAAGTG
Genome Walking-SP3 TCCATGCAGGGATTGCACTGTCGAA
RISP-Genome Forward ATGACTTCTGTTGTTGTGAGGTCAG
RISP-Genome Reverse TTAACCTACAACTAGGGTTCCCTCG
1. 2. 3 小菜蛾线粒体复合物Ⅲ铁硫蛋白基因 5上
游调控区域的克隆 本研究利用 Tail-PCR 技术，克
隆了小菜蛾线粒体复合物ⅢRISP 基因 5上游调控
区域序列，其基本原理是根据已知 DNA 序列，分别
设计 3 条同向且退火温度较高的特异引物(special
primer，SP) ，与试剂盒中提供的 4 种经过独特设计
的退火温度较低的兼并引物组合进行热不对称
PCR反应。
根据 RISP 基因组序列分别设计了 3 条套组特
异性引物(表 1) ，设计方向为需要扩增的未知区域
方向，SP2 的位置设计在 SP1 内侧，SP3 位于 SP2 的
内侧。具体操作按照 TaKaRa GenomeWalking试剂盒
说明书进行，PCR反应结束后，取1st，2nd，3rd PCR反
应液各 5 μL，使用 1%琼脂糖凝胶电泳进行检测，切
胶回收3rd PCR 扩增产物，并用 SP3 引物进行 DNA
测序。
1. 2. 4 序列的生物信息学分析 使用软件DNAMAN
对测序结果进行整理，利用在线 TFSEARCH 软件
221
2011 年第 7 期 龚亮等:小菜蛾线粒体复合物Ⅲ铁硫蛋白基因 5上游调控区域的克隆及序列分析
(http:/ /www. cbrc. jp / research /db /TFSEARCH. html)
做转录因子结合位点的预测。利用在线软件 NNPP
(http:/ /www. fruitfly. org / seq _ tools /promoter. html)
预测转录起始位点预测;使用在线软件 Promoter 2. 0
Prediction预测启动子序列 http:/ /www. cbs. dtu. dk /
services /Promoter /。CPG 岛的预测使用在线软件
EMBOSS CpGPlot(http:/ /www. ebi. ac. uk /Tools /em-
boss /cpgplot / index. html)。
2 结果
2. 1 小菜蛾线粒体复合物Ⅲ铁硫蛋白基因组序列的
克隆及分析
以小菜蛾基因组为模板，根据小菜蛾线粒体复
合物Ⅲ铁硫蛋白编码区设计和合成特异性引物，进
行 PCR扩增，将其产物凝胶电泳检测(图 1)后回收，
构建克隆载体并测序。由测序结果发现，小菜蛾线
粒体复合物Ⅲ铁硫蛋白基因组全长为 2 041 bp，其
中包含 3 个内含子，大小分别为 96 bp、577 bp 和
549 bp。其内含子两端具有典型的 GT-AG 结
构(图 2)。
图 1 小菜蛾线粒体复合物Ⅲ铁硫蛋白基因组
DNA的琼脂凝胶电泳检测
灰色背景表示 3 个内含子序列;方框表示 GT-AG;带箭头的单划线表示基因组 DNA 扩增引物;带
箭头的双划线表示 Tail-PCR引物
图 2 小菜蛾线粒体复合物Ⅲ铁硫蛋白基因内含子序列
321
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2011 年第 7 期
2. 2 小菜蛾线粒体复合物Ⅲ铁硫蛋白基因 5上游
区域的获得
利用 Tail-PCR 技术，根据小菜蛾线粒体复合
物Ⅲ铁硫蛋白基因组 DNA 设计了 3 条套组引物，
以小菜蛾基因组为模板，克隆了小菜蛾复合物Ⅲ
铁硫蛋白基因 5上游调控序列(图 3)。通过 3 次
步移，获得长度为 2 960 bp 的 DNA 片段(图 4)。
经与 GenBank 中 EU815629 的 cDNA 序列比对发
现该 DNA 片段 3-末端的序列与 EU815629 基因
cDNA 5端序列一致，说明该片段确实是该基因上
游调控区域。
图 3 小菜蛾线粒体复合物Ⅲ铁硫蛋白基因
5调控区域的凝胶电泳检测
2. 3 小菜蛾线粒体复合物Ⅲ铁硫蛋白基因 5上游
区域的分析
利用 Promoter 2. 0 等在线分析软件分析小菜蛾
线粒体复合物Ⅲ铁硫蛋白基因起始密码子上游序
列，预测出转录起始位点为位于起始密码子上游
1 566 bp 处的碱基 A，这与普遍发现的转录起始位
点为 A 相一致。用 TFSEARCH软件分析此序列，发
现该序列不仅包括 TATA-box 等启动子核心序列而
且含有 BR-C Z4、Hb、Dfd、CF2-II 和 HSF 等转录因
子结合位点(图 4)。进一步研究发现在该基因的
+ 1 bp至 + 301 bp处附近有 CpG 岛(图 5) ，且位于
启动子(+ 348 bp至 + 392 bp区域)附近。
3 讨论
本研究在获取小菜蛾线粒体复合物Ⅲ铁硫蛋白
基因序列的基础上，进一步设计 3 个嵌套的特异性
引物分别和简并引物组合进行连续的 PCR 循环
(Tail-PCR) ，扩增得到了该基因 5上游调控序列，生
物信息学分析该序列不仅包含启动子的核心结构序
列，也包含一些特异的反应元件和转录因子结合位
点。如 TATA 框:该元件具有将 RNA 聚合酶Ⅱ引导
到正确转录起始位点的功能，从而使转录精确地开
始［7］;然而一些认为与发育调控有关转录调控因子
也同样存在于本克隆区域，如 Dfd 因子［8］。据此，我
们认为小菜蛾 RISP 基因在其线粒体膜结构的形成
中起到了某种作用。
目前，利用生物信息学分析基因启动子是基因
启动子研究中的重要研究手段［9，10］。本研究利用在
线启动子预测软件，预测启动子存在区域，其结果以
+ 348 bp至 + 392 bp 区域的可能性较大。再次利
用 EMBOSS-CpG Plot在线软件预测发现在该基因启
动子附近具有 CpG 岛，位于 + 1 bp 至 + 301 bp附
近。这部分的分析结果为该基因启动子的实验学鉴
定打下了一定的基础。
呼吸传递链中电子的转移，会被特定的抑制剂
所阻断，这在农药创制方面有着特殊的意义。传统
杀虫剂主要作用害虫的神经系统或生理过程，多次
使用后害虫容易产生抗药性，而昆虫线粒体抑制剂
的杀虫作用机理特殊，是一种很有前途的杀虫药
剂［11］。过去所研发的害虫线粒体抑制剂，如鱼藤酮、
粉蝶霉素 A，其靶位点是害虫线粒体复合物Ⅰ［12］。本
实验室较详细地研究了小菜蛾线粒体复合物Ⅲ铁硫
蛋白基因组的结构，为针对该基因的线粒体抑制剂
的研究提供基因组 DNA 序列信息。但该基因启动
子及转录调控元件的具体生理功能尚有待深入
研究。
RNA干扰技术一直广泛应用于基因功能的研
究，然而科学家们试图将该技术应用于害虫防治领
域，目前已在鳞翅目和鞘翅目昆虫中试验成功。本
课题组在之前的研究中也强调过，克隆和鉴定沉默
致死的昆虫靶标基因或转录调控因子是该技术成功
应用的关键［13，14］。鉴于 RISP 在昆虫线粒体电子传
递和 ATP形成中的重要作用，利用 RNA 干扰技术
沉默该基因或其转录调控因子，阻断小菜蛾 ATP 的
形成，有望形成对小菜蛾进行防治的新方法。本研
究首次鉴定了小菜蛾 RISP 基因 5上游调控区域的
DNA序列，并分析了其转录调控因子，为利用 RNAi
技术，深入研究以该基因为靶标的生物农药提供基
因序列信息。
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2011 年第 7 期 龚亮等:小菜蛾线粒体复合物Ⅲ铁硫蛋白基因 5上游调控区域的克隆及序列分析
转录因子结合位点由带下划线的表示;推测的启动子序列已被框起，推测的转录起始位点由 + 1 表示
图 4 小菜蛾线粒体复合物Ⅲ铁硫蛋白基因 5上游调控区域的生物信息学分析
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生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2011 年第 7 期
图 5 小菜蛾 RISP基因 CpG岛生物信息学预测结果
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(责任编辑 狄艳红)
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