全 文 ：基因组学与应用生物学，2010年，第 29卷，第 4期，第 804-808页
Genomics and Applied Biology, 2010, Vol.29, No.4, 804-808
技术改进
Upgraded Technology
拟南芥中与植物生长和耐寒相关的miRNA表达载体的构建
蔡杰 1,2 杨成龙 2 段瑞军 2 郭建春 2*
1海南大学农学院,海口, 570228; 2中国热带农业科学院生物技术研究所,热带作物生物技术国家重点实验室,海口, 571101
*通讯作者, jianchunguoh@163.com
摘 要 本研究通过 PCR方法从拟南芥基因组序列中分离了 3 个理论推断与耐寒相关的 miRNA片段
(miRNA402, miRNA319和 miRNA393)和 1个与植物生长相关的片段 miRNA172。利用重叠延伸 PCR技术
将 miRNA172小分子，以及 3个与耐寒相关的 miRNA402，miRNA319和 miRNA393小分子串连在一起分别
导入植物表达载体 pVKH-35S-GUS-pA，取代表达载体中的 GUS基因，构建了 pVKH-35S-mir172-pA和
pVKH-35S-mir31+402+393-pA 融合表达载体。经 PCR 和双酶切及测序鉴定，pVKH-35S-mir172-pA 和
pVKH-35S-mir319+402+393-pA构建成功，为后续利用基因工程手段，miRNA转化木薯，提高木薯生长和木
薯耐寒相关研究奠定基础。
关键词 miRNA,表达载体,重叠延伸 PCR技术,双酶切
Construction of miRNA Expression Vectors Correlative with Plant Growth
and Cold-resistant in Arabidopsis
Cai Jie 1,2 Yang Chenglong2 Duan Ruijun 2 Guo Jianchun 2*
1 College of Agriculture, Hainan University, Haikou, 570228; 2 Key Laboratory of Tropical Crops Biotechnology Ministry of Agriculture, Institute of
Tropical Bioscience and Biotechnology, Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences, Haikou, 571101
* Corresponding author, jianchunguoh@163.com
DOI: 10.3969/gab.029.000804
Abstract In this article, we have isolated one small molecule miRNA172 related with plant growth, 3
cold-resistant related miRNA402, miRNA319 and miRNA393 from Arabidopsis genomic DNA by PCR method.
Then miRNA172 and the fused miRNAs with miRNA402, miRNA319 and miRNA393 have been replaced the
GUS gene in pVKH-35S-GUS-pA by splicing overlap extension PCR and constructed plant botanic expression
vectors of pVKH-35S-mir172-pA and pVKH-35S-mir319+402+393-pA, respectively. The expressing vectors of
pVKH-35S-mir172-pA, pVKH-35S-mir319+402+393-pA have been identified to be successfully constructed by
PCR, restriction enzyme digestion and sequence analysis. The result would be the preliminary work for use of
miRNAs to improve the cassava growth and cold tolerance by gene engineering method.
Keywords miRNA, Expressing vector, Splicing overlap extension PCR, Restriction enzyme digestion
www.genoapplbiol.org/doi/10.3969/gab.029.000804
基金项目：本研究由国家自然科学基金(30860151)、现代木薯农业产业技术体系(nycytx-17)和中央级公益性科研院所基本科研
项目(ITBBZD0721)共同资助
miRNA是真核生物内源性的一类 20~24 nt 的
非编码单链小分子 RNA，由一段具有发卡环结构的
长度为 70~80 nt的单链 RNA前体剪切后生成，能够
通过与靶 mRNA特异性的碱基配对，引起靶 mRNA
的降解或者抑制其翻译，从而对靶基因进行转录后
的负调控。miRNA基因以单拷贝、多拷贝或基因簇
等多种形式存在于基因组中，而且具有绝大部分定
位于基因间隔区，少部分位于基因的内含子，不翻译
成蛋白质的特点。由 miRNA介导的转录后调控方式
具有以下 4个特点：(1)成熟的植物 miRNA为 21 nt左
右，从统计学意义上看，这可能是已知的 mRNA表达
过程中所需的最小热力学稳定长度，而且将 miRNA
前体加工为 21 nt左右的 miRNA的速度比从 mRNA
转录到蛋白质翻译调控的全过程要快。因此，采用这
种方式就能更加迅速地调控基因表达，达到平衡 /适
应内外环境的目的，比从蛋白水平的调节更节省能量
(Ruvkun, 2001)；(2) 21个碱基可以排列组合成 421种
碱基序列，即理论上可以调控 421个靶基因，这个数目
远远超出普通生物体所含有的基因数量，可对任一基
因进行专一性地调控，而且转录的长度越短，转录的
出错率就越小，使得调控可能更为有效(Pasquinelli et
al., 2000)；(3)真核生物相当部分基因内含子在转录过
程中被剪切的片段也可编码miRNA，这是转录副产物
的再次利用(Ying and Lin, 2005; Kim and Kim, 2007)；
(4) miRNA的调控是针对已转录的产物，避免了信号
的传递和蛋白产物的形成，这种反馈调节方式可快速
实现可逆调节(Morlando et al., 2008)。
miRNA最早是在线虫(Caenorhabditis elegans L.)
(Lee et al., 1993; Wightman et al., 1993)中被发现，后来
通过克隆和生物信息学的方法在拟南芥(Arabidopsis
thaliana L.) (Sunkar and Zhu, 2004)、水稻(Oryza sativa
L.) (Sunkar et al., 2005)、玉米 (Zea mays L.) (Mica et
al., 2006)、小麦(Triticum aestivum L.) (Yao et al., 2007)
和苔藓(Moss L.) (Arazi et al., 2005)等植物中也发现
了不同数量和类型的 miRNA。
重叠延伸 PCR技术(splicing by overlap extensi-
on PCR, SOE-PCR)由于采用具有互补末端的引物，使
PCR产物形成了重叠链，从而在随后的扩增反应中
通过重叠链的延伸，将不同来源的扩增片段重叠拼
接起来。重叠延伸 PCR技术能够在体外进行有效的
基因重组，而且不需要内切酶消化和连接酶处理，可
利用这一技术很快获得其它依靠限制性内切酶消化
的方法难以得到的产物。重叠延伸 PCR技术成功的
关键是重叠互补引物的设计。重叠延伸 PCR在基因
的定点突变、融合基因的构建、长片段基因的合成、
基因敲除以及目的基因的扩增等方面有其广泛而独
特的应用(魏薇等, 2008)。
本研究通过 PCR 技术从拟南芥中分离了理论
推导与植物生长相关和耐寒相关的 4个 miRNA小
分子，并利用重叠延伸 PCR技术成功构建了两个表
达载体 pVKH-35S-mir172-pA 和 pVKH-35S-mir-
319+402+393-pA，为后续能够利用这些 miRNA转
化能源植物木薯，从而提高木薯生长和耐寒能力奠
定了基础。
1结果与分析
1.1 miRNA的克隆与序列比对
本试验中，我们以拟南芥 DNA为模板，分别用
引物 Mir402-1和 Mir402-2，Mir172-1和 Mir172-2，
Mir393-1 和 Mir393-2，Mir319-1 和 Mir319-2 进行
PCR，从拟南芥植物中共扩增得到分别长约 140 bp，
170 bp，200 bp和 330 bp的 4个 miRNA前体，并分别
命名为Mir172，Mir393，Mir319和Mir402。
将测序结果通过 NCBI Blast 进行同源性分析，
结果显示与 GenBank中报道的编号为 NR_022719.1，
NR_022851.1，NR_022632.1 和 NR_022431.1 的基因
有 100%的同源性(表 1)。
1.2构建的表达载体鉴定
将 pVKH-35S-mir172-pA用 HindⅢ和 BamHⅠ
酶切，分别得到两条大小为 140 bp和 15 150 bp的片
段(图 1A-1)，其片段大小与以 pVKH-35S-mir172-pA
为模板，Mir172-1和Mir172-2为引物扩增的 PCR产
物长度相等(图 1A-2)；利用 SalⅠ和 BamH Ⅰ酶切
表 1 NCBI Blast结果
Table 1 The result of NCBI Blast
登录号
Accession number
NR 022719.1
NR 022851.1
NR 022632.1
NR 022431.1
说明
Description
拟南芥MIR172C RNA
Arabidopsis thaliana MIR172C RNA
拟南芥MIR393B RNA
Arabidopsis thalianaMIR393B RNA
拟南芥MIR319C RNA
Arabidopsis thaliana MIR319C RNA
拟南芥MIR402 RNA
Arabidopsis thaliana MIR402 RNA
最大得分
Max score
246
296
368
571
总得分
Total score
246
296
368
571
查询覆盖范围
Query coverage
88%
94%
91%
95%
E值
E-value
2.00E-62
2.00E-77
6.00E-99
7.00E-160
最大同源性
Max identification
100%
100%
100%
100%
拟南芥中与植物生长和耐寒相关的 miRNA表达载体的构建
Construction of miRNA Expression Vectors Correlative with Plant Growth and Cold-resistant in 805
基因组学与应用生物学
Genomics and Applied Biology
pVKH-35S-mir319+402+393-pA，分别得到两条大小
为 700 bp和 15 150 bp的片段(图 1B-2)，其扩增片段
大小与以 pVKH-35S-mir319+402+393-pA 为模板，
Mir393-1和Mir319-2为引物扩增的 PCR产物长度
相等(图 1B-1)，是 Mir402，Mir393和 Mir319 3个小
分子miRNA长度总和。PCR结果和酶切结果都和理
论计算值一致，说明表达载体构建正确。
2讨论
生物和非生物在内的多种逆境胁迫是影响植物
正常生长和作物产量的重要限制性因素。逆境胁迫
不仅会诱导植物蛋白质编码基因的表达，也会诱导
一些非蛋白质编码基因的表达，这类非蛋白质编码
基因的表达产物在植物的生长、发育和应对逆境胁
迫等过程中起到重要的调控作用。miRNA (小分子
RNA)就是这类非蛋白质编码基因产物中的重要类群，
研究发现，多种逆境均会诱导 miRNA的产生，其作
用是通过引导目的基因 mRNA的降解和阻止翻译
过程来调控靶基因，最终通过形态或生理上的变化
达到对逆境的适应(沈亚欧等, 2009)。
研究表明，部分与植物逆境胁迫相关的 miRNA
已证实(沈亚欧等, 2009)。miRNA393在病菌浸染、低
温、干旱、高盐和 ABA胁迫下正调控；miRNA319在
低温下正调控；miRNA402在低温、干旱、高盐和 ABA
胁迫下正调控；在胁迫条件下控制植物生长和发育的
miRNA，过量表达miRNA172提前植物开花的时间，
而且是目前植物体内唯一发现通过抑制它的目标物
的翻译来起作用的miRNA (徐涛和张富春, 2008)。
本试验选取部分与植物逆境有关的 miRNA进
行研究。根据拟南芥基因组序列设计引物，扩增
miRNA，并将其片段插入到 pVKH-35S-GUS-pA中，
经双酶切和 PCR及其 DNA测序检测后，成功构建
了 2个与植物逆境相关的 miRNA表达载体，为后续
利用 miRNA在木薯中的表达来提高木薯的耐胁迫
能力提供一种新的途径。
本试验采用重叠延伸 PCR 克服了短片段基因
操作的难度，成功将多个小分子 miRNA多片段的连
接。该技术与连接转化相比,可以高效、快捷、经济地
扩增长片段 DNA，而且不需要内切酶消化和连接酶
处理，可以将任意的两个目的基因拼接连接形成含
有 2个目的基因的融合基因，中间无任何非目的基
因的 DNA序列，还可以得到短至 20 bp 以上的片
段，弥补一般 PCR对短于 100 bp片段的重组几乎无
能为力的缺憾，极大地丰富了 PCR技术的扩增范围。
重叠延伸 PCR 技术在寡核苷酸引物设计时除
要考虑到引物设计的一般原则，还应考虑到重叠部
分的长度，一般重叠部分应设计 15~20个碱基。另
外，引物的 Tm值对结果也有影响，设计的全部引物
最好有相同或相近的 Tm值。而本实验考虑到引物
设计程序繁琐，对重叠延伸 PCR部分进行优化，主
要是我们对片段的连接采用一般 PCR法，这样就避
免了设计嵌合引物进行 PCR的繁琐步骤，然后用两
头引物进行 PCR扩增获得基因全长片段。经分析测
序结果，发现与用重叠延伸 PCR方法获得基因全长
片段完全一致。一般情况下，目的基因与表达载体的
连接，是按物质的量之比设置的，一般载体(n):片段
(m)=1:10，而我们实际操作时以体积比来衡量摩尔比
的，本试验是根据跑胶的时候条带的亮度、宽度做一
个粗定量，一般来说，体积比为载体:片段=1: (3~8)。本
实验目的基因的片段大小与表达载体的大小比大约
为 1:6，我们实验设计 4个梯度，分别为 1:3、1:6、1:8
和 1:10，实验表明，1:6转化效率最为理想。
图 1 pVKH-35S-mir172-pA 和 pVKH-35S-mir319+402+393-
pA表达载体 PCR和酶切鉴定结果
注 : A: pVKH-35S-mir172-pA 表达载体 PCR 和酶切鉴定结
果 ; M: 15 000 bp Maker; 1: BamHⅠ和 Hind Ⅲ酶切 pVKH-
35S-mir172-pA; 2: mir172 PCR 结果; 理论大小为 140 bp; B:
pVKH-35S-mir319+402+393-pA 表达载体 PCR 和酶切鉴定
结果; M: 15 000 bpMaker; 1: mir319+402+393 PCR鉴定结果;理
论大小为 700 bp; 2: BamHⅠ和 SalⅠ酶切 pVKH-35S-mir319+
402+393-pA
Figure 1 Identification of pVKH-35S-mir172-pA and pVKH-
35S-mir31+402+393-pA expression vector by PCR and enzymic
digestion
Note: A: Identification of pVKH-35S-mir172-pA expression vec-
tor byPCRand enzymic digestion;M: 15 000 bpMaker; 1: BamHⅠ
and HindⅢ digestestion; 2: PCR of mir172; The length of mir172
is 140 bp; B: Identification of pVKH-35S-mir319+402+393-pA
expression vector by PCR and enzymic digestion; M: 15 000 bp
Maker; 1: PCR result of mir319+402+393; The length is 700 bp; 2:
BamHⅠand SalⅠ digest of pVKH-35S-mir319+ 402+393-pA
www.genoapplbiol.org
DOI: 10.3969/gab.029.000804806
3材料与方法
3.1材料
拟南芥：本实验室栽培。质粒：pMD18-T Simple
Vector (Ampr)、pVKH-35S-GUS-pA (Hygr和 Kamr)由
本实验室保存。大肠杆菌 DH5α及 PCR相关产品为
北京华美生物公司产品。各种限制性内切酶为大连
宝生物公司产品。引物合成与序列分析，上海生工生
物工程技术服务有限公司。
3.2拟南芥 DNA提取
用 SDS法(王关林和方宏筠,主编, 1998,科学出
版社, pp.742-743)提取和纯化拟南芥 DNA。SDS法
在裂解过程中，蛋白质、破裂的细胞壁和变性的染色
体 DNA会互相缠绕成大型复合物，后者被十二烷基
硫酸盐包盖。当用钾离子取代钠离子时，这些复合物
会从溶液中有效地沉淀下来。离心除去变性剂后，就
可以从上清液中回收复性的 DNA。
3.3引物设计
根据 GenBank 中的拟南芥 ath-miR172c，ath-
miR-319c，ath-miR393b和 ath-miR402基因序列设
计引物(表 2)。
3.4 pVKH-35S-mir172-pA植物表达载体构建
用 BamHⅠ和 HindⅢ双酶切 Mir172，然后与带
有 BamHⅠ和 Hind Ⅲ粘性末端的植物表达载体
pVKH-35S-GUS-pA连接，构建表达载体，命名为
pVKH-35S-mir172-pA，载体构建流程见图 2。
3.5 pVKH-35S-mir319+402+393-pA 植物表达载体
构建
分别用 BamHⅠ和 XhoⅠ，XhoⅠ和 Hind Ⅲ双酶
切Mir393和Mir402，得到两个小片段,用连接试剂
盒进行连接，16℃水浴过 8~12 h。用连接好的两个小
片段作为模板，并将连接好的两个小片段命名为
Mir393-402，用 Mir393-1和 Mir402-2为引物，进行
PCR扩增，反应体系为 50 μL，退火温度 52℃，30个
循环。PCR产物回收后，将其与 pMD18-T Simple
Vector 连接，再将连接物转化大肠杆菌 DH5α，取
100 μL培养物涂布在 Ampr平板上，37℃培养 24 h，
挑选阳性克隆，送到上海生工生物工程技术服务有
限公司测序，将测序结果在 GenBank中进行同源性
分析。同时也用 Hind Ⅲ和 SalⅠ双酶切Mir319得到
一个小片段，暂记为 Mir3191，然后再将 Mir3191与
Mir393-402 用连接试剂盒进行连接，16℃水浴过
8~12 h。用连接好的三个片段作为模板，用Mir393-1
和 Mir319-2作为引物，进行 PCR扩增，反应体系为
50 μL，退火温度 52℃，30个循环。把 PCR产物回收
后，将其与 pMD18-T Simple Vector 连接，再将连接
物转化大肠杆菌 DH5α，取 100 μL培养物涂布在
表 2引物名称和引物类型
Table 2 Name and type of primers
引物名称
Name of primer
Mir402-1
Mir402-2
Mir172-1
Mir172-2
Mir393-1
Mir393-2
Mir319-1
Mir319-2
引物序列(5-3)
Sequence of primer (5-3)
5-AATCTCGAGCGTGGTAGATAAGTTTG-3
5-CGGAAGCTTTGATAAAGTTTTCAGTAGCATA-3
5-AATGGATCCAGCTACTGTTCGCTGT-3
5-TAGAAGCTTAGCCACTGATTGCAGC-3
5-AGAGAAAGGATCCAAAGGGATC-3
5-CCACTCGAGAAAGAATGAATCCAAAG-3
5-TGCAAGCTTTAGATATAGAAGGAGATT-3
5-AATGTCGACTAGAAAAAGAAGGAGCT-3
酶切位点
Enzymic digestion site
XhoⅠ
HindⅢ
BamHⅠ
HindⅢ
BamHⅠ
XhoⅠ
HindⅢ
SalⅠ
注:表中下划线部分序列为酶切位点
Note: Underlined part of sequence is restriction site in the table
图 2 pVKH-35S-mir172-pA载体构建流程
Figure 2 pVKH-35S-mir172-pA Vector construction process
拟南芥中与植物生长和耐寒相关的 miRNA表达载体的构建
Construction of miRNA Expression Vectors Correlative with Plant Growth and Cold-resistant in Arabidopsis 807
基因组学与应用生物学
Genomics and Applied Biology
Ampr平板上，37℃培养 24 h，挑选阳性克隆，送到上
海生工生物工程技术服务有限公司测序，将测序结
果在 GenBank中进行同源性比对分析。然后与带有
BamHⅠ和 SalⅠ粘性末端的植物表达载体 pVKH-
35S-GUS-pA连接，构建表达载体，命名为 pVKH-
35S-mir319+402+393-pA，载体构建流程见图 3。
and Proudfoot N.J., 2008, Primary microRNA transcripts are
processed co-transcriptionally, Nature Structural & Molecu-
lar Biology, 15(9): 902-909
Pasquinelli A.E., Reinhart B.J., Slack F., Martindale M.Q., Kuro-
da M.I., Maller B., Hayward D.C., Ball E.E., Degnan D.,
Müller P., Spring J., Srinivasan A., Fishman M., Finnerty J.,
Corbo J., Levine M., Leahy P., Davidson E., and Ruvkun G.,
2000, Conservation of the sequence and temporal expression
of let-7 heterochronic regulatory RNA, Nature, 408(6808):
86-89
Ruvkun G., 2001, Molecular biology: glimpses of a tiny RNA
world, Science, 294(5543): 797-799
Shen Y.O., Lin H.J., Zhang Z.M., Gao S.B., and Pan G.T., 2009,
Advances in study of plant miRNAs under stressed environ-
mental conditions, Yichuan (Hereditas), 31(3): 227-235 (沈
亚欧,林海建,张志明,高世斌,潘光堂, 2009,植物逆境
miRNA研究进展,遗传, 31(3): 227-235)
Sunkar R., and Zhu J.K., 2004, Novel and stress-regulated mi-
croRNAs and other small RNAs from Arabidopsis, The Plant
Cell, 16(8): 2001-2019
Sunkar R., Girke T., Jain P.K., and Zhu J.K., 2005, Cloning and
characterization of microRNAs from rice, The Plant Cell, 17
(5): 1397-1411
Wei W., Li F., and Chen H.R., 2008, Amplification of long DNA
fragment by splicing overlap extension PCR, Yunnan Daxue
Xuebao (Ziran Kexue Ban) (Journal of Yunnan University
(Natural Science Edition)), 30(S1): 86-88 (魏薇,李凡,陈海
如, 2008,利用重叠延伸 PCR技术扩增长片段 DNA,云南
大学学报(自然科学版), 30(S1): 86-88)
Wightman B., Ha I., and Ruvkun G., 1993, Posttranscriptional reg-
ulation of the heterochronic gene lin-14 by lin-4 mediates
temporal pattern formation in C. elegans, Cell, 75(5): 855-862
Xu T., and Zhang F.C., 2008, Advances of the action of plant
miRNAs in stress tolerance, Shengwu Jishu Tongbao
(Biotechnology Bulletin), (5): 5-9 (徐涛,张富春, 2008,植物
miRNA抗胁迫机理研究进展,生物技术通报, (5): 5-9)
Yao Y.Y., Guo G.G., Ni Z.Y., Sunkar R., Du J.K., Zhu J.K., and
Sun Q.X., 2007, Cloning and characterization of microRNAs
from wheat (Triticum aestivum L.), Genome Biology, 8(6):
R96
Ying S.Y., and Lin S.L., 2005, Intronic microRNA, Biochemical
and Biophsical Research Communications, 326(3): 515-520
图 3 pVKH-35S-mir319+402+393-pA载体构建流程
Figure 3 pVKH-35S-mir319 +402 +393-pA vector construction
process
参考文献
Arazi T., Talmor-Neiman M., Stav R., Riese M., Huijser P., and
Baulcombe D.C., 2005, Cloning and characterization of mi-
cro-RNAs from moss, The Plant Journal, 43(6): 837-848
Kim Y.K., and Kim V.N., 2007, Processing of intronic microR-
NAs, The EMBO Journal, 26(3): 775-783
Lee R.C., Feinbaum R.L., and Ambros V., 1993, The C. elegans
heterochronic gene lin-4 encodes small RNAs with antisense
complementarity to lin-14, Cell, 75(5): 843-854
Mica E., Gianfranceschi L., and PèM.E., 2006, Characterization
of five microRNA families in maize, Journal of Experimental
Botany, 57(11): 2601-2612
Morlando M., Ballarino M., Gromak N., Pagano F., Bozzoni I.,
www.genoapplbiol.org
DOI: 10.3969/gab.029.000804808