全 文 ：食用菌学报 2010.17(3):16 ～ 19
收稿日期:2010-01-08原稿;2010-06-27 修改稿
基金项目:福建省重点科技项目 (编号:2008Y0024 , 2008Y0025 , 2009Y1005)、福建省科技厅项目 (编号:
2002I010)、福建省财政专项(编号:STIF-Y01)的部分研究内容
作者简介:张　慧(1981-), 女 , 福建省农科院土肥所研究实习员 , 主要从事微生物学方面的研究 , 发表主笔论文
1 篇。
＊本文通讯作者　E-mail:xinjianlin@163.net
文章编号:1005-9873(2010)03-0016-04
离子束选育姬松茸新菌株的鉴定
张　慧1 , 江秀红2 , 林新坚1＊ , 　陈济琛1 , 林戎斌1 , 郑永标1
(1福建省农业科学院土壤肥料研究所 , 福建福州 350013;2福建省农产品质量安全检验检测中心 , 福建福州 350003)
摘　要:利用同工酶 、ISSR 分子标记技术等方法对 3 个离子束选育获得的姬松茸菌株(AbML2 ,AbML7 和
AbML11)和一株孢子分离株(AbMD3)与出发菌株进行鉴定。 结果表明:AbML11、AbML7 在酯酶同工酶 、多
酚氧化酶谱带数量上与 AbM9有较大的差别 ,有特征带出现;ISSR 聚类分析看出 , 在相似系数大约为 0.64 水
平上 ,可将供试菌株分为两大类 ,AbML2 、AbMD3 、AbML7、AbM9 归为一类 ,菌株 AbML11 单独聚为一类。
关键词:食用菌;同工酶;PCR技术
　　姬松茸 Agaricus blazei Murill , 又名小松
菇 ,柏氏蘑菇 ,巴西蘑菇 。1992年 ,福建省农科院
从日本引进并栽培成功。离子束生物技术是生
物诱变育种的新方法 ,将氮离子束注入姬松茸担
孢子获得诱变菌株 , 以提高姬松茸的品质与
产量[ 1] 。
食用菌品种 ,特别是商业栽培品种的鉴定鉴
别需要对被鉴定的食用菌进行综合评价[ 2] 。利
用传统的农艺性状考量和形态差异比较分析是
常用的鉴定方法 ,酯酶和过氧化物同工酶分析比
较也是研究姬松茸种内遗传差异性和测量属内
遗传距离的重要手段[ 3] 。目前尚未见利用 ISSR
标记[ 4] 对姬松茸种质遗传多样性研究的报道 。
笔者采用 ISSR技术 ,用 28个引物对 5个姬松茸
菌株进行遗传多样性分析 ,并结合同工酶方法对
新选育的姬松茸菌株进行鉴定。
1　材料与方法
1.1 供试材料
　　出发菌株 AbM9为福建省农业科学院 1992
年从日本引进并栽培成功 ,后在生产中推广应
用 ,其栽培子实体单生或丛生 ,菌盖斗笠状或圆
形 、浅褐色 、有绒毛 ,菌柄粗短 、柄脚有气生菌丝。
AbM L7和 AbML11 为 AbM9 经离子束注
入诱变选育出的新菌株 ,其中 AbML7 为白色突
变菌株 ,其菌丝爬壁力弱 、长速最慢 ,子实体从菌
柄到菌盖均为白色 、单生或丛生 ,菌盖斗笠状或
圆形 ,菌柄细长;AbML11 菌株菌丝健壮 , 长速
快 ,菇蕾发生密度大 ,菌盖圆形 、灰褐色 、光滑 、少
绒毛 ,菌柄细长 、柄脚无气生菌丝 ,产量最高 ,抗
逆性较强[ 1] 。
此外 A bM 9离子束注入诱变选育时选出一
株 AEC+的突变菌株 AbML2和 AbM9 孢子分
离获得的菌株 AbMD3也作为参照菌株一起进行
了试验分析。
1.2 同工酶试验
1.2.1 同工酶提取
　　菌丝在 PDA平板上 26 ℃培养 10 d 后刮取
表面菌丝体 ,称取 0.5 g ,加入 1 mL 磷酸缓冲液
(pH7.4 , 0.1 mol/L),少量石英砂研磨 ,8 500 g 、
离心 5 min ,取上清液 , -20 ℃静置备用 。
1.2.2 同工酶分析
　　在 4 ℃条件下 ,分离胶浓度 8%,浓缩胶浓
度 5%,电极缓冲液 Tris-Gly 系统 , pH8.3 ,溴酚
蓝作为指示剂 。80 V 稳压电源约 30 min ,将电压
升至 120 V 约 2 h ,以溴酚蓝前沿指示剂迁移至
下端约 0.5 cm 处时停止电泳。酯酶同工酶
(EST)、多酚氧化酶(PPO)染色液的配制 、染色及
脱色方法参照参照文献[ 5] 。
1.3 ISSR试验
第 3 期 张　慧 ,等:离子束选育姬松茸新菌株的鉴定
1.3.1 DNA提取
　　取培养 10 d的姬松茸菌丝约 0.5 g ,参照文
献[ 6]的方法进行 DNA 提取。
1.3.2 ISSR-PCR
　　供试引物见表 2 ,扩增方法参照文献[ 7]的方
法进行。
表 1　ISSR供试随机引物
Table 1　ISSR primers
引物
Pr imer
序列(5 -3 )
Sequence
引物
Pr imer
序列(5 -3 )
Sequence
S4 AGAGAGAGAGAGAGAGT S16 BDBACAACAACAACAACA
S7 CACACACACACACACAG S17 AAGAAGAAGAAGAAGAAGC
S8 VDHTCGTCGTCGTCG TCG S20 DHBCGACGACGACGACGA
S9 CTCTCTCTCTCTCTCTRC S23 GAGAGAGAGAGAGAGACT
S10 GAGAGAGAGAGAGAGAC S24 NNNNNNNNNNNNNNN
S11 CTCCTCCTCCTCSC S25 CACACACACACACACAWG
S12 CATACATACATACATAG S26 CTCTCTCTCTCTCTCTG
S13 VHVGTGTG TGTGTGTGTGT
　　PCR 扩增结果采用 NT-SYS 聚类分析软件
体系进行聚类分析 ,构建遗传相关聚类图谱 。
2　结果与分析
2.1 酯酶同工酶 、多酚氧化酶
2.1.1 酯酶同工酶酶谱分析
2 , 3 , 7 , 9 , 11泳道分别为菌株 AbM L2 、AbMD3 、AbML7 、AbM9
和 AbML11
Lan es 2 , 3 , 7 , 9 and 11 correspond to s t rains AbML2 、AbMD3 、
AbM L7 、AbM9 and AbML11 , respect ively
图 1　供试菌株的酯酶同工酶酶谱
Fig.1　Esterase isozyme zymogram of
Agaricus blazei strains
　　由图 1可见 ,不同菌株酯酶同工酶的谱带数
目和酶活表现出不同程度的差异 , 5 个菌株共检
测出 55条酯酶同工酶谱带 ,其中迁移率不同的
谱带 5 条;AbMD3 和 AbM9 酶谱带数目相同;
AbML2 、AbML7 、AbML11谱带与 AbM9 的酶谱
均存在差异 , 在 Rf =0.367 和 Rf =0.517 处 ,
AbML7均有谱带缺失;在 Rf=0.600处 ,AbML7 、
AbML11出现一条特征带;在Rf=0.367处 AbML2
缺失一条酶带;在 Rf=0.716处 ,AbML2、AbML11
出现一条特征带。
2.1.2 姬松茸多酚氧化酶酶谱分析
泳道标记同图 1　Lan e designat ions as in Fig.1
图 2　供试菌株的多酚氧化酶酶谱
Fig.2　Polyphenol oxidase isozyme zymogram of
Agaricus blazei strains
　　多酚氧化酶染色结果见图 2。5个菌株有 4
条相同的酶带(Rf =0.207 、0.341 、0.397 、
0.603)。但各菌株谱带数目不同 ,且有各自的特
征谱带。AbML7在 Rf=0.121 、0.362 、0.724 出
现了特征带 ,在 Rf=0.517处缺失了一条带 。在
Rf=0.293 处 , AbMD3 、 AbM9 均有一条特征
带 ,而其它三个菌株没有出现 。在 Rf =0.362
处 , AbML11出现一条与 AbML7 迁移率相同的
特征带。
2.2 ISSR扩增结果分析
2.2.1 ISSR扩增结果
　　从供试的 26个随机引物中筛选出15个条带
清晰稳定 、重复性好 、多态性高的引物 ,共扩增出
206个条带 ,多态性条带为 84 条 ,占总条带数的
40.8%,每个引物平均获得 5.6 条多态性条带 。
17
食　用　菌　学　报 第 17 卷
由图 3可看出 ,在 8个引物 、5个菌株的综合带型
中 ,扩增后得到的 DNA 片段的分子量在 200 ～
2 000 bp之间 ,可以找到不同于 AbM9 的特征指
纹图谱。
　　　　M:分子量标记 ,其余泳道标记如图 1
M:M olecu lar markers;other lanes as designated in Fig.1
图 3　引物 S4 , S11 , S12 的 ISSR扩增图谱
Fig.3　ISSR amplification profiles of Agaricus blazei strains using primers S4 , S11 and S12
2.2.2 ISSR数据分析
　　将 ISSR扩增结果综合聚类分析(见图 4),通
过 NT-SYS 软件分析 ,获得遗传相似聚类图谱 。
在大约 0.64水平上 , 5 个供试菌株聚为二大类 ,
AbML11 为一类 , AbML2 、AbMD3 、AbML7 和
AbM9聚为一类;AbML11 与 AbM9 的遗传相
似系数最小为 0.28 , AbML2与 AbM9的遗传相
似系数为 0.64 ,表现出一定的遗传多样性 ,说明
离子束注入引起的突变部分地改变了菌株的遗
传特性。
图 4　ISSR 聚类分析图谱
Fig.4　Phylogenetic dendrogram of Agaricus blazei
strains based on ISSR markers
3　讨论
　　姬松茸胞外酶系丰富 ,蛋白酶活性变化与子实
体发育有关。本研究所之前实验结果表明 ,一潮菇
期羧甲基纤维素酶活性对姬松茸的产量有较显著
的影响 ,而菌丝长速与产量没有显著的相关性 ,故
不能将菌丝长速作为筛选高产菌株的指标[ 8] 。笔
者采用同工酶谱 、DNA 指纹 ISSR等技术对姬松茸
品种进行鉴定鉴别。利用现代的分子生物学技术
开展姬松茸种质资源遗传 、生理生化 、产品质量 、经
济性状的分析和评价 ,可以为改良现有的栽培品种
提供条件 ,为姬松茸良种选育工作提供依据。利用
分子指纹进行食用菌品种的鉴定鉴别需要方法上
的探索研究和规范[ 9] ,不同的食用菌种类要利用合
适的分子指纹技术 ,才可以获得满意的效果。
ISSR分子标记技术退火温度比 RAPD更高 ,具有
很好的重复性 、稳定性 ,可以揭示更高程度的 DNA
多态性 ,本研究从随机引物中挑选扩增效果较好 、
多态性高 、稳定性较强的引物对样品进行扩增 ,提
高试验结果的可靠性 。
国内目前的生产及研究用姬松茸菌种均来
源于巴西 、日本 ,至今尚未在中国境内发现野生
姬松茸菌株。而我们采用传统的单孢与多孢筛
选方法不易获得新的菌株(这些方法依赖的是原
菌种的自然变异与组合 ,没有引入新的遗传物
质)。通过远缘杂交 、诱变等技术可以引入杂种
优势 、提高变异几率 ,增加了选育优良特性菌株
的可能性 ,离子束生物技术作为我国自主知识产
权的创新技术 ,可用于诱变出生物育种新材料 ,
亦可用于生物工程转基因及细胞信号传导 、细胞
通讯等领域的研究[ 10] 。笔者对采用离子束注入
技术获得的姬松茸新菌株 、孢子分离技术获得的
菌株与其出发菌株在酯酶 、多酚氧化酶的同工酶
比较和 ISS R分子标记的比对鉴别 ,在这些菌株
存在形态和生产特性差异的基础上进一步确认
了菌株间的生理差异和遗传差异 ,同时也为姬松
茸菌株 ISS R分子标记鉴别提供了参考 。
致谢:感谢福建农林大学菌物中心谢宝贵老
师对本实验给予的帮助 !
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第 3 期 张　慧 ,等:离子束选育姬松茸新菌株的鉴定
参考文献
[ 1] 郑永标 , 林新坚 ,陈济琛 , 等.氮离子束注入姬松茸担
孢子的生物学效应研究[ J] .激光生物学报 , 2008 , 17
(4):482-485.
[ 2] 张金霞 , 黄晨阳 , 胡清秀.食用菌品种鉴定及品种保
护技术[ J] .中国食用菌 , 2005 , 24(4):14-16.
[ 3] 郭倩 , 周昌艳 ,宋春艳.姬松茸研究进展[ J] .食用菌
学报 , 2004 , 11(2):59-64.
[ 4] ZIETKIEWICZ E , RAFALSKI A , LABUDA D.
Genome fingerprinting by simple sequence repeat
(SSR )-anchor ed po lymerase chain reaction
amplification[ J] .Genome , 1994 , 20:176-183.
[ 5] 胡能书 , 万贤国.同工酶技术及其利用[ M] .长沙:湖
南科学技术出版社 , 1985.
[ 6] 朱衡 , 瞿峰 ,朱立煌.利用氯化苄提取适于分子生物
学分析的真菌 DNA [ J] .真菌学报 , 1994 , 13(1):
34-40.
[ 7] 林新坚 , 江秀红 , 蔡海松 ,等.姬松茸 ISSR 特异扩增
体系的研究[ J] .食用菌学报 , 2007 , 14(4):25-30.
[ 8] 林新坚 , 江秀红 ,林戎斌 , 等.姬松茸菌株的胞外酶活
性及与产量的关系[ J] .食用菌学报 , 2007 , 14(3):
24-28.
[ 9] 王建波.ISSR分子标记及其在植物遗传学研究中的
应用[ J] .遗传 , 2002 , 24(5):613-616.
[ 10] 陈恒雷 , 吕杰 , 曾宪贤.离子束诱变育种研究及应
用进展[ J] .种子 , 2005 , 24(6):45-47.
[本文编辑] 　曹　晖
Comparison of Agaricus blazei Murill Mutants
Generated by Ion Beam Injection
ZHANG Hui
1 , JIANG Xiuhong2 , LIN Xinjian1＊ , CHEN Jichen1 ,
LIN Rongbin
1 , ZHENG Yongbiao1
(1The Soil and Fer tilizer Institute , Fujian Academy of Agr icultural Sciences , Fuzhou , Fujian 350013 , China;
2Fujian Provincial Quality Safety Inspection and Test Center for Agricultural Products , Fuzhou , Fujian 350003 , China)
Abstract:Three Agaricus blazei mutants (AbML2 , AbML7 and AbML11)gener ated by nitr ogen ion beam
injection , and one spore isola te (AbMD3), all der ived from parental stra in AbML11 , were compa red using
isozyme and ISSR marke rs.Esterase and polyphenol oxidase isozyme zymograms of AbML11 , AbML7 and
AbM9 were distinct.Analysis of ISSR markers separ ated the isolates into two groups at a gene tic distance of
0.64 , one consisting of AbML2、AbMD3、AbML7 and AbM9 , and the othe r of AbML11.
Key words:Edible fungi;ester ase isozyme;PCR technique
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