全 文 ：·研究报告·
生物技术通报
B IO TECHNOLOGY　BULL ETIN 2009年第 8期
重组人乙酰胆碱受体原核表达
条件的优化及初步应用
陈利春 1 　汪凌云 2 　孙玉秀 2 　陈兵 2 　徐从贞 2 　鲁云霞 2
(1 安徽省合肥市妇幼保健院 ,合肥 230001; 2 安徽医科大学生物化学与分子生物学教研室 ,合肥 230032)
　　摘 　要 : 　在已建立的重组人乙酰胆碱受体表达质粒的基础上进一步优化试验条件 ,初步应用于 EL ISA分析实验性重症
肌无力模型 ( EAMG)中抗体的滴度。取构建好的 pET28a ( + ) 2hAChRα12210经小规模诱导 ,确定 IPTG诱导的最佳浓度为 0.
006 mmol/L ,最佳时间为 5 h,最佳温度为 37℃;大规模诱导培养后离心 ,超声得到菌体沉淀 , 1 mol/L尿素洗涤后 8 mol/L尿素
溶解 ,过 N i2 +亲和层析柱 ,紫外吸收及 Folin酚法确定表达量较多而蛋白最纯的 4℃透析过夜 , PEG8000浓缩后免疫雌性近交
系 Lewis鼠构建 EAMG, EL ISA检测分析模型大鼠血清中抗体的效价。结果表明 ,制备了大量较纯的 rhAChR,并成功应用于
EL ISA法分析 EAMG模型中抗体的滴度。因此 ,获得的纯化 rhAChR可用于构建 EAMG模型及鉴定。
关键词 : 　pET28a ( + ) 2hAChRα12210　 IPTG　N i2 +亲和层析 　PEG8000　EMAG
Optim ization and Primary Application of Prokaryotic Expression
of Human AChRα2subun it 12210 in E. coli
Chen L ichun1 　W ang L ingyun2 　Sun Yuxiu2 　Chen B ing2 　Xu Congzhen2 　Lu Yunxia2
(1 Hefei M aternal and Child Health Hospita l, Hefei 230021; 2 Deptm ent of B iochem istry
and M olecular B iology, Anhui M edical University, Hefei 230032)
　　Abs trac t: 　 It was to exp lore the conditions for high exp ression of human AChRα2subunit 12210 in E. coli (BL21) , the induction
conditions such as concentration of IPTG, induction temperature and time were imp roved. Results indicated that the highly exp ressed
human AChRα2subunit 12210 were obtained at 0. 006 mmol/L IPTG for 5 h under 37℃. After large scale of induction culture, puri2
fied recombinant p roteins were obtained through centrifugation and sonication of bacteria, then solved with 8 M urea, and went through
N i2 + affinity chromatography. Immunized female Lewis rats were involved in to induce EAMG, to analyze antibody titer of serum in
model group. The results exhibited that recombinant p roteins were pure and can be used to construct EAMG model to determ ine anti2
body titer successfully.
Key wo rds: 　pET28a ( + ) 2hAChRα12210　 IPTG　N i2 + affinity chromatography　PEG8000　EMAG
收稿日期 : 2009202216
作者简介 :陈利春 (19782) ,女 ,主治医师 ,研究方向 :疾病的分子生物学
通讯作者 :鲁云霞 , E2mail: lyxwkb@ tahoo. com. cn　　重症肌无力 (myasthenia gravis, M G)是由乙酰胆碱受体抗体 (AChR2Ab)介导的自身免疫性疾病。在 M G病人血清中 ,乙酰胆碱受体 (AChR )作为主要的自身抗原 ,诱发机体产生相应的抗体 ,作用于神经肌肉接头处的突触后膜 ,阻断了 AChR离子通道和神经肌肉间的传递 ,造成骨骼肌无力。约有 85%的 MG病人血清中发现了 AChR 2Ab[ 1 ] 。实验性重症肌无力 ( EAM G)是一种动物模型 ,与人 类 M G非常相似 ,可由注射 MG病人血清或抗AChR的单克隆抗体或免疫来自电鳗电器官提取的 AChR而诱发 ,但由于后者产生的抗体与免疫动物的肌肉 AChR有交叉反应 ,因此对于 M G发病机制及防治方法的研究多采用前者。本研究的前期工作是运用重组人 AChR α亚基 12210 ( rhAChRα12210)免疫雌性近交系 Lew is鼠 ,已成功地诱导了 EAM G模型 [ 2 ] 。
生物技术通报 B iotechnology　B u lle tin 2009年第 8期
为了提高 rhAChRα12210的表达量 ,本研究在已
构建成功的 pET228a ( + ) 2hAChRα12210的基础上 ,
对其原核表达条件如 IPTG诱导的浓度、时间、温度以
及 N i2 +亲和层析柱的咪唑洗脱浓度等进行了摸索和
探讨 ,经不连续 SDS - PAGE及凝胶定量分析软件证
实其纯度已达到 95% ,并用其免疫雌性近交系 Lewis
鼠诱导 EAMG模型 , EL ISA法分析抗体的滴度。
1　材料与方法
111　材料
重组表达载体 pET28a ( + ) 2hAChR为安徽医科
大学生化教研室构建 ,含有该质粒的 BL21 (DE3)菌
株由该室保存。蛋白低分子量 Marker购自 TaKaRa
公司 ,人源 AChR2Ab ( SC21442)购自美国 Santa Cruz
公司。弗氏完全和不完全佐剂、辣根过氧化物酶标
记的小鼠抗大鼠 IgG购自武汉博士德公司。Kana2
mycin购自 Sigma公司。 Folin2酚试剂、牛血清白蛋
白 (BSA)购自上海生工生物技术有限公司。6～8
周龄的雌性近交系 Lewis鼠 20只 ,平均体重在 138
±3. 5 g,购于北京维通利华实验动物技术有限公
司 ,按随机对照原则将 Lewis鼠分成试验组 (10只 )
和对照组 (10只 ) ,并在安徽省实验动物中心 SPF环
境下饲养。
112　rhAChR原核诱导表达条件的优化
从含有 pET28a ( + ) 2hAChR α12210 的 BL21
(DE3)宿主菌生长的 Kanamycin板上挑取单个菌
落 , 37℃220 r/m in振荡过夜培养后以 1∶200接种于
5 m l LB液体培养基中振荡培养约 2. 5 h,测 A550为
0. 6后加入 IPTG诱导表达 ,离心洗涤后的菌体沉淀
中加入 1 ×loading buffer, 100℃煮沸 5 m in,不连续
SDS2PAGE鉴定 (12%分离胶 , 5%浓缩胶 ) [ 3 ]。37℃
振荡培养至 A550为 0. 6时 ,通过分别加入不同浓度
IPTG、诱导不同时间和不同温度来确定诱导表达的
最适条件。 IPTG的最终浓度分别是 1、0. 8、0. 6、0.
4、0. 2、0. 1、0. 08、0. 06、0. 05、0. 04、0. 03、0. 02、0.
01、0. 008、0. 006、0. 004、0. 002和 0. 001 mmol/L;
37℃恒温分别为 8、7、6、5、4、3、2和 1 h确定诱导的
最适时间 ;按 37℃、34℃、31℃、28℃、25℃和 22℃依
次递减来确定诱导的最适温度。每次改变条件时都
用测 550 nm吸光度、SDS2PAGE及 BandScan分析软
件来监测 rhAChRα12210的表达情况。
113　重组蛋白的大规模诱导及分离纯化
将含有 pET28a ( + ) 2hAChR α12210 的 BL21
(DE3)宿主菌以 1∶200接种于 300 m l LB液体培养
基中 , 37℃振荡培养约 2. 5 h,测 A550达 0. 6后加入
0. 006 mmol/L IPTG诱导表达 5 h, 8 000 r/m in离心
15 m in得菌体沉淀 ,称重后加 50 mmol/L Tris2HCl
(pH7. 4)洗涤 ,超声 3 s,停 15 s,功率 165 w,共 20
m in,用 2 mol/L尿素洗涤沉淀 ,用 8 mol/L尿素溶
解 , 8 000 g离心 ,将上清上柱于 N i2 +亲和层析柱 ,用
10～100 mmol/L咪唑梯度溶液洗脱 ,共得到 14管
纯化蛋白 ,紫外吸收法测定 A280及 A260确定蛋白的
纯度 , Folin2酚法测定蛋白的浓度 , SDS2PAGE鉴定
(12%分离胶 , 5%浓缩胶 ) [ 3 ]。合并纯化的蛋白各
管并装入透析袋中 ,对 10 mmol/L PBS(pH7. 4)透析
过夜 , PEG8000浓缩至 1 mg/m l。
114　 rhAChR α12210融合蛋白免疫 Lewis鼠诱导
EAMG模型
用经过亲和层析柱纯化、透析并浓缩的样品作
为免疫原 ,加入 10 mmol/L PBS ( pH7. 4 )适当稀释
(1 mg/m l)后与等量氟氏完全佐剂 ( CFA )充分乳
化。采用 10%水合氯醛按 40 mg/kg剂量注入 Lewis
鼠腹腔麻醉动物 ,试验组取双侧足趾及肩背部皮下
分四点注入 100μg rhAChRα12210融合蛋白 ;对照
组则于相同部位注入等剂量与 CFA充分乳化后的
空菌总蛋白。在第一次免疫后 4周将相同剂量抗原
或空菌总蛋白与氟式不完全佐剂充分乳化后再次接
种两组动物。
115　间接 EL ISA检测 EAMG模型小鼠血清的效价
在试验结束前断尾取血 1 m l,将离心后的血清放
置 - 20℃冰箱冷冻。用 50μl rhAChR (0. 5μg/m l,溶
于 pH8. 0的碳酸盐缓冲液 )包被 EL ISA板 , 4℃过夜。
PBS2T洗板 3次 , 5%脱脂奶粉封闭 ,加入 50μl待测
血清 (1∶3 200) ,室温孵育 2 h后分别加入 HRP标记
兔抗大鼠 IgG (1∶5 000) ,室温静置 30 m in后再加入
邻苯二胺 (OPD)显色 , 1 mol/L H2 SO4 终止反应 ,在酶
标仪上测量 A492 ,若待测血清吸光度 /阴性对照血清
吸光度比值大于 2. 1即为血清抗体 AChR2Ab滴度阳
性 ,具体方法参见参考文献 [ 4 ]并略加修改。
116　数据统计
采用 SPSS11. 5软件进行组间 t检验。
011
2009年第 8期 　　陈利春等 :重组人乙酰胆碱受体原核表达条件的优化及初步应用
2　结果
211　rhAChR原核表达条件的优化
对含 pET28a ( + ) 2hAChR的大肠杆菌进行诱导
表达条件的优化 ,从电泳图谱结合 BandScan软件分
析得知 : rhAChR 表达诱导时 IPTG的最适浓度为
0. 006 mmol/L (图 1) ,最适诱导时间为 5 h (图 2) ,
最适温度为 37℃ (图 3)。
21111　诱导浓度对 rhAChR蛋白表达量的影响 　
IPTG诱导浓度对重组蛋白的表达量影响电泳结果
如图 1所示。
1.对照 ; 2. 0. 0008; 3. 0. 001; 4. 0. 002; 5. 0. 004; 6. 0. 006; 7. 0. 008; 8. 0. 01; 9. 0. 02
IPTG终浓度 (mmol/L)
M. 低分子量蛋白质标准 ; 1. 对照 ; 2. 0. 008; 3. 0. 006; 4. 0. 004; 5. 0.
002; 6. 0. 001; 7. 0. 0008
IPTG终浓度 (mmol/L)
M. 低分子量蛋白标准 ; 1. 未用 IPTG诱导的的总蛋白作为对照 ; 2～
12. 总蛋白分别用 0. 01、0. 02、0. 04、0. 06、0. 08、0. 1、0. 2、0. 4、0. 6、0.
8、1 mmol/L IPTG诱导表达.
IPTG终浓度 (mmol/L)
图 1　rhAChR在不同 IPTG浓度时的诱导表达
应用 BandScan软件对凝胶电泳结果进行分析 ,
可得出目的蛋白占总蛋白表达量的百分比 ,分析结
果整理如 (表 1)。
表 1　凝胶电泳结果的 BandScan软件分析
IPTG终浓度
(mmol/L) 1. 0 0. 8 0. 6 0. 4 0. 2 0. 1 0. 08 0. 06 0. 04
灰度百
分比 (   ) 36. 8 22. 3 28. 7 24. 6 34. 2 19. 0 29. 5 26. 8 22. 4
IPTG终浓度
(mmol/L) 0. 02 0. 01 0. 008 0. 006 0. 004 0. 002 0. 001 0. 0008 0
灰度百分
比 (   ) 21. 1 19. 2 33. 3 34. 2 29. 3 45. 4 30. 1 15. 0 11. 6
IPTG可诱导 rhAChR α12210 的高效表达 ,但
IPTG本身对细胞有一定的毒性 ,并抑制细胞中其它
蛋白的表达。因此 ,随着 IPTG终浓度不断上升 ,菌
体总蛋白的表达明显下降 ,甚至因对细胞的毒性而
影响目的蛋白的表达。结合图 1及表 1结果分析 ,
可以找到 IPTG抑制总蛋白表达与诱导目的蛋白表
达之间的平衡点 ,这个平衡点即诱导表达 rhAChR
α12210的最佳浓度为 0. 006 mmol/L。
21112　诱导时间对 rhAChR蛋白表达量的影响 　
IPTG诱导浓度对重组蛋白的表达量影响电泳结果
如图 2所示。
M. 低分子量蛋白标准 ;对照. 未用 IPTG诱导的总蛋白 ; 1～8. 用 0. 05
mmol/L IPTG分别诱导 1、2、3、4、5、6、7、8 h后表达的总蛋白
图 2　rhAChR在不同诱导时间的表达
应用 BandScan软件对凝胶电泳结果进行分析 ,
可得出目的蛋白占总蛋白表达量的百分比 ,分析结
果整理如 (表 2)。
111
生物技术通报 B iotechnology　B u lle tin 2009年第 8期
表 2　凝胶电泳结果的 BandScan软件分析
诱导时间
( h) 1 2 3 4 5 6 7 8
灰度百分
比 ( % ) 19. 4 22. 8 34. 6 36. 4 46. 7 26. 0 33. 7 33. 6
由图 2可以看出 ,随着培养时间的延长 ,细胞产
生的蛋白总量越来越多 ,目的蛋白的表达也随之增
加 ,在 5 h时出现了高峰。由表 2可以进一步确定 ,
5 h时目的蛋白占总蛋白表达量的最大值。因此认
为 , 5 h是诱导 rhAChRα12210表达的最佳时间。
21113　诱导温度对 rhAChR蛋白表达量的影响 　
诱导温度对重组蛋白表达量的影响电泳结果如图 3
所示。
M. 低分子量蛋白标准 ; 1～6. 分别在 22℃、25℃、28℃、31℃、34℃、
37℃条件下诱导表达的总蛋白
图 3　rh AChR在不同温度时的诱导表达
应用 BandScan软件对凝胶电泳结果进行分析 ,
可得出目的蛋白占总蛋白表达量的百分比 ,分析结
果整理如表 3。
表 3　凝胶电泳结果的 BandScan软件分析
诱导温度
(℃) 22 25 28 31 34 37
灰度百分
比 ( % ) 20. 6 29 41. 7 42. 3 42. 1 33. 1
由图 3可以看出 ,温度在 22℃至 37℃之间目的
蛋白都有不同程度的表达 ,且表达量呈明显上升趋
势。22℃时 , rhAChRα12210的表达量很低 ,相对来
说 , 37℃时 rhAChRα12210表达量较高。由表 3则
可以确定 22℃时目的蛋白的相对表达量最低 ,而
37℃时目的蛋白的表达量最高 ,因此 , 37℃应视为
rhAChRα12210的最佳诱导温度。
212　rhAChR的大规模诱导表达及分离纯化
21211　重组蛋白的大规模诱导表达 　大规模诱导
表达的 rhAChRα12210主要以包涵体的形式存在于
离心后的沉淀中 ,且在 2 mol/L尿素中是不溶的 ,只
有高达 8 mol/L尿素才能溶解包涵体中大部分的
rhAChRα12210 (图 4)。
M. 低分子量蛋白标准 ; 1. 未用 IPTG诱导的总蛋白 ; 2. IPTG诱达表
达后的总蛋白 ; 3. 诱导表达后 2 mol/L尿素沉淀物 ; 4. 诱导表达后 8
mol/L尿素上清 ; 5. 诱导表达后 8 mol/L尿素沉淀
图 4　rhAChRα12210大规模诱导后的电泳图
21212　亲和层析法分离纯化 rhAChR　在过 N i2 +亲
和层析柱时咪唑洗脱液一共收集了 14管 ,其中第 1
～5管中没有 rhAChRα12210,从第 6管开始一直到
13管均有 rhAChR α12210,且都只有一条带 ,说明
rhAChRα12210纯度达 95% ,其中第 6～11管较多
(图 5)。紫外吸收法测定时 , A280 /A260 = 1. 75,接近
1. 8,说明蛋白纯度较高。
M. 低分子量蛋白标准 ; 1～14. 重组蛋白 rhAChRα12210
图 5　柱层析后 SD S - PAGE
213　间接 EL ISA法检测 EAMG模型 Lewis鼠的血
清效价
模型组 AChR2Ab IgG含量 (OD 值 ) 0. 97 ±0.
20,与对照组 1. 27 ±0. 26比较明显下降 , P 0. 05,
有统计学意义 ,说明大规模制备的 rhAChRα12210
211
2009年第 8期 　　陈利春等 :重组人乙酰胆碱受体原核表达条件的优化及初步应用
已能成功地用于制作 EAMG模型。
3　讨论
MG的发病机制目前尚不完全清楚 ,据推测细
胞免疫及体液免疫均参与了发病过程。 1975 年
Lennon和 L indstmm [ 5 ]首次应用电鳗乙酰胆碱受体
免疫大鼠和猪成功地建立了 MG模型 ,为研究 MG
的发病机制和免疫治疗提供了有效途径。
烟碱型乙酰胆碱受体 ( nicotinic acetylcholine re2
cep tor, nAChR)属于配体门控的离子通道受体家
族 ,由不同亚基构成 ,其结构和功能各异 ,应用新技
术对 nAChR的结构、功能及与疾病的关系进行深入
的研究 ,将为这些疾病的防治提供更确切、有效的方
法。本研究克隆的是人 nAChRα12210位氨基酸残
基对应的核苷酸序列 ,是 MG致病的关键区域 [ 6 ] ,它
对应于 AChR配体的结合位点和 T细胞的主要免疫
表位 ,也是主要致病抗体 AChR2Ab作用的靶点。
用 pET系列表达载体 ,氯化钙结合热休克法转
化 BL21 (DE3)。在低浓度 IPTG的诱导下宿主菌首
先表达 T7RNA聚合酶 ,然后结合于载体 T7强启动
子处 ,使得 rhAChR的表达量占总蛋白量的 20%左
右。已有文献显示 , pET系列质粒构建的重组质粒
在原核系统中表达的重组蛋白是可以复性并得到纯
化的 [ 7 ]。由于 pET载体上带有 H is标签 ,所以用亲
和层析介质 N i2 + 2chelating Sepharose Fast Flow结合
电泳分离纯化 ,得到了纯的重组蛋白 ,并已成功地应
用于 EAMG模型及造模后抗血清效价的测定 ,为进
一步研究 EAMG模型及防治机制奠定了坚实的实
验基础。
参 考 文 献
1　 De BaetsM, Stassen MH. J Neurol Sci, 2002, 202: 5～11.
2　 许文华 ,许功林 ,陈兵 ,等. 中华神经科杂志 , 2007, 40 ( 8 ) : 560
～563.
3　萨姆布鲁克 J,拉塞尔 DW著 ,黄培堂 , 等译 ,分子克隆实验指南
(第 3版 ) [M ] . 北京 :科学出版社 , 2001, 1252～1259.
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munol, 2006, 146 (2) : 294～302.
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7　 范清林 ,魏伟 ,邹文艺 ,等. 中国药理学通报 , 2006, 22 ( 2 ) : 228
～233.
本刊启事
　　从 2010年第 1期开始 ,将严格按“编辑作者常用国家标准 ”,对参考文献进行著录。因此
从现在作者来稿时 ,所引用的期刊类参考文献要加注文章题 (篇 )名。具体著录格式如下 :
作者 ,作者. 文章题 (篇 )名. 刊名 ,出版年 ,卷号 (期号 ) :页次.
例 1:朱立煌 ,徐吉臣 ,陈英. 用分子标记定位一个未知的抗稻瘟病基因. 中国科学 (B辑 ) ,
1994, 24: 1408～1502.
例 2: Veluthambi R, Krishnan M , Gould J , et al . Op ines Stimulate Induction of the vir Gene
of the Agrobacterium Tum ifaciens Ti Plasm id . J Bacterol, 1989, 171 (7) : 3696～3703.
其它类参考文献的著录格式等 ,详见本刊稿约 ( http: / / aii. caas. net. cn)。
本刊编辑部
2009年 6月
311