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生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2011 年第 7 期
乳糖诱导重组多价人精子表位肽在
大肠杆菌中的表达
谢琦1 林军1 白玲1 叶元2 杨冰2 石青峰3 刘永明1
(1桂林医学院生物技术学院，桂林 541004;2桂林医学院附属医院妇科，桂林 541001;
3桂林医学院附属医院检验科，桂林 541001)
摘 要: 旨在研究用乳糖替代 IPTG作为诱导剂进行重组多价人精子抗原表位肽的表达及诱导表达的优化条件。在摇
瓶发酵条件下，通过改变培养基组成、诱导时机、诱导温度、诱导剂浓度、诱导时间和诱导方式等条件，利用 SDS-PAGE 电泳和
AlphaEase凝胶电泳图像分析系统，研究以上条件改变对 GST-重组多价人精子抗原表位肽融合蛋白表达量的影响，并与 IPTG
诱导结果相比较。结果显示，在摇瓶试验中，最优表达条件为选用 TB 培养基，在菌体对数生长的中期进行诱导，诱导温度
37℃、乳糖诱导终浓度 3 mmol /L、诱导时间 6 h。GST-重组多价人精子抗原表位肽融合蛋白的表达量占菌体总蛋白的 30. 5%，
且主要以可溶形式表达，与 IPTG的诱导结果相同。分批流加乳糖和一次性加入乳糖诱导，效果一样。乳糖可以替代 IPTG作
为诱导剂诱导 GST-重组多价人精子抗原表位肽融合蛋白的表达，优化条件下可获得与 IPTG相同的诱导表达效果。
关键词: 重组多价人精子抗原表位肽 乳糖 IPTG 表达 诱导
Expression of Recombinant Multi-epitopes Peptide of Human Sperm
Antigens in E. coli Induced by Lactose
Xie Qi1 Lin Jun1 Bai Ling1 Ye Yuan2 Yang Bing2 Shi Qingfeng3 Liu Yongming1
(1College of Biotechnology，Guilin Medical University，Guilin 541004;
2 Department of Gynaecology of the First Affiliated Hospital，Guilin Medical University，Guilin 541001;
3Department of Clinical Laboratory Medicine，Guilin Medical University，Guilin 541001)
Abstract: It was to study lactose instead of IPTG as the inducer for expression of recombinant multi-epitopes peptide of human
sperm antigens and optimal conditions of the expression． In the shake flask fermentation conditions，the influence of culture medium，in-
duction period，induction temperature，inducer concentration，induction time and induction method on the expression level of GST-
AG10-IR9-YLP12 fusion protein was analyzed with SDS-PAGE electrophoresis and AlphaEase gel electrophoresis image analysis sys-
tem，and results were compared with that induced by IPTG． Results showed that obtained optimal conditions for the expression of GST-
AG10-IR9-YLP12 fusion protein were as follows:TB as the medium，putting up induction in the middle logarithmic growth of bacteria，
37℃ as induction temperature，3 mmol /L as the final induction concentration of lactose，extending induction for 6 h． The expressed fu-
sion protein GST-AG10-IR9-YLP12 accounted for 30. 5 percent of the bacterial total protein，mainly in a soluble form，and the expres-
sion level was the same as that induced by IPTG． The result of induced expression by adding lactose three times exhibited no different to
that by adding lactose once． Therefore，it proved that lactose can substitute for IPTG as the inducer for expression of GST-AG10-IR9-
YLP12 fusion protein，and the same induced expression level as that of IPTG can be obtained when use lactose to induce the fusion pro-
tein expression in optimal conditions．
Key words: Recombinant multi-epitopes peptide of human sperm antigens Lactose IPTG Expression Induction
收稿日期:2011-03-04
基金项目:广西区科技厅科学研究与技术开发项目(桂科攻 0632007-1I)
作者简介:谢琦，女，讲师，研究方向:多肽的合成与活性;E-mail:xq@ glmc. edu. cn
通讯作者:刘永明，男，教授，研究方向:生物分子的结构与功能;E-mail:liuym@ glmc. edu. cn
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2011 年第 7 期
免疫因素造成的不孕不育越来越引起人们的
关注。抗精子抗体(AsAb)的产生是导致免疫性不
孕不育的主要原因，9% － 36%的不孕症夫妇存在
AsAb［1］。近年来，随着对诱导抗精子抗体产生的
精子抗原的研究逐渐深入，发现利用精子抗原的
免疫原性可以达到免疫法避孕的目的。将免疫性
不育与免疫避孕研究结合起来已成为当前研究的
一个显著特点。由于免疫性不育可能是针对精子
的多个部位的多个抗体的复合效应［2］，因此构建
具有多个不育相关的抗原表位的靶抗原不仅是开
发免疫性避孕疫苗的发展方向，也可用于检测 As-
Ab以辅助临床诊治免疫性不孕不育。本研究在使
用化学方法合成并筛选出的多个不育相关的 AsAb
特异性强、灵敏度高的人精子特异性抗原表位肽
的基础上［3］，借助生物信息学手段和蛋白质结构
分析软件，设计出由 3 个人精子特异抗原表位
(AG10、IR9、YLP12)组成的重组多价人精子抗原
表位肽。其中 AG10 序列(AVKIQAAFRG)来自人
精子蛋白 SP17 的一个免疫优势的线性 B 细胞表
位(118 － 127 aa)［4］，IR9 序列(IQTLGITPR)来自
一个新的特异性的人精子蛋白(FJ32704)的免疫
显性的线性 B 细胞表位(151 － 159 aa)［5］，YLPl2
序列(YLPVGGLRRIGG)是一段位于人类精子细胞
顶体区域的肽序列［6］。本实验室据此构建了与 GST
基因融合表达的重组多价人精子表位肽(AG10-
IR9-YLP12)的表达菌株，在 IPTG 的诱导下实现了
高效可溶性表达。
IPTG作为乳糖类似物，是一种高效的重组蛋白
表达诱导剂，但它对人体具有潜在的毒性［7］，而且
价格昂贵，使其在基因工程产品的大规模生产中的
应用受到限制。乳糖是一种有潜力的可以替代
IPTG的诱导剂，乳糖进入细胞后经过 β-半乳糖苷酶
的作用转化为异乳糖，进而起到诱导的作用［8］。乳
糖没有毒性且价格低廉，用乳糖替代 IPTG 已成为
目前研究的热点。本研究以乳糖作为诱导剂，在摇
瓶发酵条件下研究不同培养基、诱导剂浓度、诱导时
机、诱导时间、诱导温度和诱导方式对 GST-多价人
精子抗原表位肽融合蛋白表达的影响，旨在为实现
重组多价人精子抗原表位肽低成本、高产量的大规
模生产奠定基础。
1 材料与方法
1. 1 材料
1. 1. 1 菌种和质粒 含 PGEX-4T-1 /AG10-IR9-
YLP12 重组质粒的大肠杆菌 BL21(DE3)由本实验
室构建。
1. 1. 2 试剂 酵母粉(Yeast Extract) ，蛋白胨
(Tryptone) ，丙烯酰胺(Acr) ，甲叉双丙烯酰胺
(Bis) ，购自 BBI 公司;IPTG 购自 Merck 公司;其余
试剂均为国产分析纯。
1. 2 方法
1. 2. 1 培养基的配制 (1)LB 培养基:酵母粉
0. 5%，蛋白胨 1%，氯化钠 1%，121℃灭菌 20 min。
(2)TB 培养基:酵母粉 2. 4%，蛋白胨 1. 2%，甘油
0. 4%，磷酸二氢钾 17 mmol /L，磷酸氢二钾 72
mol /L，高压灭菌时磷酸盐与其他组分分开，待溶液
冷却至 60℃以下后混合。
1. 2. 2 工程菌培养 原始冻干菌种室温自然解冻
后，接种于新鲜的 LB 或 TB(含 50 μg /mL Amp)培
养基平板中，37℃培养过夜，再挑单菌落转接于新鲜
的液体培养基中，37℃，220 r /min培养。
1. 2. 3 菌体生长及目的蛋白表达量的测定方法
菌体生长量以 OD600值表示。目的蛋白表达量的测
定是在诱导表达结束后，取菌液 1 mL，离心收集菌
体，加入 1 ×电泳缓冲液 200 μL 混匀，100℃加热 5
min，12 000 r /min离心 2 min，取上清 10 μL，行 12%
SDS-PAGE电泳，用 AlphaEase凝胶电泳图像分析系
统分析各样品所含目的蛋白的比例。
1. 2. 4 GST-多价人精子抗原表位肽融合蛋白可溶
性表达的测定 取菌液 1 mL，离心收集菌体，加入
适量 PBS 重悬，超声破菌后，12 000 r /min 离心 10
min，分别取上清及沉淀，行 12% SDS-PAGE电泳。
1. 2. 5 不同培养基对目的蛋白表达的影响 按
1. 2. 2 方法将工程菌分别接种于含 Amp的 LB及 TB
培养基中，在时间、温度、乳糖浓度相同的条件下进
行诱导表达，按 1. 2. 3 方法检测目的蛋白表达量。
1. 2. 6 诱导时机对目的蛋白表达的影响 根据
1. 2. 5 的试验结果，TB 培养基更有利于目的蛋白的
表达，以下试验均使用 TB 培养基。按 1. 2. 2 方法
进行工程菌培养，分别以 0. 5%的接种量，转接于装
有 100 mL TB培养基的锥形瓶中，37℃振荡培养，在
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2011 年第 7 期 谢琦等:乳糖诱导重组多价人精子表位肽在大肠杆菌中的表达
菌体生长进入对数生长期的前、中、中后期即菌液
OD600值分别为 0. 5，0. 9，1. 4 时加入乳糖，使其终浓
度为 6 mmol /L，发酵相同的时间。按方法 1. 2. 3 检
测目的蛋白表达量。
1. 2. 7 诱导温度对目的蛋白表达的影响 按 1. 2. 2
方法进行工程菌培养，在时间、乳糖浓度、转速等条
件相同的情况下，置于不同温度(25℃、30℃、37℃)
的摇床中进行诱导表达。按 1. 2. 3 方法检测目的蛋
白表达量，按 1. 2. 4 方法检测最佳诱导温度下目的
蛋白的可溶性表达情况。
1. 2. 8 诱导剂浓度对目的蛋白表达的影响 按
1. 2. 2 方法进行工程菌培养，至最佳诱导 OD600值，
分别加入不同浓度的乳糖诱导剂，使其终浓度为
1. 5，3，6，9，15 mmol /L，诱导培养 6 h，按方法 1. 2. 3
检测目的蛋白表达量。
1. 2. 9 诱导时间对目的蛋白表达的影响 按
1. 2. 2 方法进行工程菌培养，至最佳诱导 OD600值，
加入最佳诱导浓度的乳糖溶液，进行目的蛋白的诱
导表达。从诱导开始起每 1 h 取菌液 1 次，按方法
1. 2. 3 检测目的蛋白表达量。
1. 2. 10 诱导方式对目的蛋白表达的影响 按
1. 2. 2 方法进行工程菌培养，至最佳诱导 OD600值，
分别按一次性或分批的方式加入最佳量的诱导剂。
一次性的方式为一次性添加最佳诱导浓度的量。分
批的方式为自诱导始，每隔 1 h 添加一次乳糖，添加
量为最佳量的 1 /3，共添加 3 次。两种方式的诱导
时间均为 6 h。按方法 1. 2. 3 检测目的蛋白表达量。
1. 2. 11 乳糖诱导和 IPTG 诱导效果的比较 按以
上试验优化的乳糖诱导的最佳条件进行目的蛋白的
表达，与相同条件下 1 mmol /L IPTG 的诱导结果进
行比较，评判乳糖诱导的效果。
2 结果与分析
2. 1 不同培养基对目的蛋白表达的影响
在其他诱导条件相同的情况下，工程菌在 TB
培养基中目的蛋白的表达量高于 LB。结果见图 1。
微生物发酵培养基的组成对菌体生长和产物合成都
有重要影响。为了提高工程菌生产重组蛋白的产
量，我们有目的地选择了营养更丰富的 TB 培养基
与大肠杆菌的通用培养基 LB 进行比较，相对于 LB
培养基而言，TB培养基含有丰富的碳氮源、氨基酸、
肽、核苷酸、碳水化合物、生长因子和微量元素。此
外，TB培养基中的甘油作为碳源，使得菌体生长过
程中不会产生乙酸，利于重组蛋白的积累，而磷酸盐
中的钾离子能够维持细胞渗透压，磷酸根能保持菌
体生长过程中稳定的 pH。下一步的工作，针对工程
菌的营养需求，我们还需在 TB 培养基的基础上进
行培养基组成的优化。
M. Protein marker;1． LB;2． TB;箭头所示为目的蛋白
图 1 目的蛋白在不同培养基中的表达情况
2. 2 诱导时机对目的蛋白表达的影响
在发酵时间相同的条件下，于对数生长的前、
中、中后期加入终浓度相同的乳糖进行诱导，结果表
明，在菌体生长期的各个阶段加入乳糖均有目的蛋
白的表达。比较而言，在菌体对数生长期的中期
(OD600约为 0. 9)时进行诱导，目的蛋白的表达量最
高，但只是略高于中后期(OD600约为 1. 4) ，明显高
于前期，说明在对数生长的早期诱导不利于目的蛋
白的表达。这是因为乳糖转运是一个主动运输的过
程，需要一系列酶的参与，因而需要一定的生物量和
透过酶的表达作为目的蛋白诱导表达的基础，所以
在菌体对数生长的中期及中后期诱导更有利于目的
蛋白的表达。试验表明，在菌体对数生长的中期至
中后期一个较宽的时间范围内诱导，目的蛋白的表
达量变化不大，这个特性有利于大规模重组产物的
生产控制，结果见图 2。
2. 3 诱导温度对目的蛋白表达的影响
在其他诱导条件相同的情况下，工程菌在不同温
度(25℃、30℃、37℃)下进行诱导，所表达的目的蛋白
的表达量不同。在 37℃时，目的蛋白的总表达量最
高，结果见图 3。通过测定在 37℃时目的蛋白的表达
形式，可知主要以可溶的方式表达，结果见图 4。
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生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2011 年第 7 期
M. Protein marker;1． OD600 为 0． 5;2． OD600 为 0. 9;
3． OD600为 1. 4
图 2 不同时期诱导目的蛋白表达的情况
M. Protein marker;1． 25℃;2． 30℃;3． 37℃
图 3 目的蛋白在不同诱导温度下的表达情况
1．全菌;2．破菌上清;3．破菌沉淀
图 4 目的蛋白的表达形式
2. 4 诱导剂浓度对目的蛋白表达的影响
试验结果(图 5)显示，终浓度为 1. 5 mmol /L 的
乳糖即可诱导目的蛋白的表达，目的蛋白的表达量已
达到全菌总蛋白的 22%，说明工程菌对乳糖的诱导
效应较为敏感，较低浓度的乳糖既能启动目的基因的
高效表达。乳糖浓度达到 3 mmol /L时，目的蛋白的表
达量达到 30%，且不再随乳糖浓度的增加而增加，因此
对此工程菌而言，乳糖的最佳诱导浓度是 3 mmol /L。
1． 1. 5 mmol /L;2． 3 mmol /L;3． 6 mmol /L;4． 9 mmol /L;
5． 15 mmol /L
图 5 不同浓度乳糖的诱导结果
2. 5 诱导时间对目的蛋白表达的影响
试验结果(图 6)显示，加入乳糖后，目的蛋白的
表达随着诱导时间的增加而增加，至 6 h 达到最高，
之后目的蛋白的表达不再随时间的增加而增加。对
此工程菌而言，乳糖的最佳诱导时间为 6 h。
M. Protein marker;1-8．诱导时间分别为 1，2，3，4，5，6，7，8 h
图 6 诱导时间对目的蛋白表达的影响
2. 6 诱导方式对目的蛋白表达的影响
试验结果(图 7)显示，一次性添加乳糖诱导的
方式与流加乳糖诱导的方式对目的蛋白的表达量的
影响无明显差异，效果相同。从有利于操作的角度
出发，一次性添加的方式更简便。
2. 7 乳糖诱导和 IPTG诱导效果的比较
试验结果(图 8)显示，在乳糖诱导的最佳条件
下，目的蛋白的表达量占菌体总蛋白的 30. 5%，达
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2011 年第 7 期 谢琦等:乳糖诱导重组多价人精子表位肽在大肠杆菌中的表达
到与 IPTG相同的诱导效果。此外，乳糖所具备的
无毒和价廉的优点，使其在重组多价人精子表位肽
的大规模发酵生产中更具有优于 IPTG的价值。
1．分 3 次添加乳糖，每次添加浓度为 1 mmol /L;2．一次性添加
乳糖，添加浓度为 3 mmol /L
图 7 诱导方式对目的蛋白表达的影响
1． 3 mmol /L lactose;2． 1 mmol /L IPTG
图 8 不同诱导剂对目的蛋白表达的影响
3 讨论
随着对诱导抗精子抗体产生的精子抗原的研究
逐渐深入，使得以精子特异性抗原为靶抗原开发免疫
性避孕疫苗在抗生育研究领域中极具前景。何畏
等［9］曾报道用多价精子抗原表位多肽 －免疫刺激复
合物可诱导机体产生强大的体液和黏膜免疫，且持续
时间较长，获得的避孕效果较好。同时，利用不育相
关的精子抗原肽作为包被抗原建立的 ELISA方法用
于检测 AsAb 以辅助临床诊治免疫性不孕不育在国
内外均有报道。但不论是进行人多价精子抗原表位
肽疫苗的研究还是 AsAb 检测的推广应用，能否获取
大量的人多价精子抗原表位肽是研究的关键之一。
乳糖操纵子的表达系统是目前应用最广泛的重
组蛋白表达系统。IPTG 是乳糖操纵子的高效诱导
剂，其在大肠杆菌中不被降解和代谢，诱导条件简
单，诱导浓度低，诱导效果持久。但由于它对人体潜
在的毒性，而且价格昂贵，通常只作为实验室表达少
量蛋白质时的诱导剂。乳糖作为原核细胞的常用碳
源对乳糖操纵子具有天然的诱导作用，虽然它的诱
导机制比 IPTG 复杂，诱导条件需要更深入地研究
和优化，但乳糖作为一种常见的二糖，无毒无害，价
廉易得，使其在重组蛋白的大规模发酵生产中具有
优于 IPTG的潜在价值和优势。
本研究在以往研究的基础上，以乳糖代替 IPTG
作为诱导剂，通过优化表达条件，实现了目的蛋白的
高效可溶性表达，表达的目的蛋白占菌体总蛋白
30. 5%，与 IPTG的诱导效果相同。这些研究结果不
仅表明乳糖可以代替 IPTG 作为诱导剂诱导大肠杆
菌乳糖操纵子表达系统中重组蛋白的高效表达，而
且为实现重组多价人精子抗原表位肽的大规模生产
提供了新的技术支撑。
参 考 文 献
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(责任编辑 李楠)
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