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研究报告

生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2010年第 10期
豌豆白化苗蛋白质双向电泳技术的建立
赵鑫1, 2  刘红霞 2  陈佰鸿 1  毕阳 1
( 1中国农业科学院作物科学研究所 农业部作物遗传育种重点开放实验室 国家农作物基因资源与基因
改良国家重大科学工程,北京 100081; 2甘肃农业大学农学院,兰州 730070)
  摘  要:  以豌豆白化苗为试验材料, 分析了不同的蛋白质提取时间 ( 4 h、8 h及过夜 )和蛋白质上样量 ( 500、1 000、2 000

g)对双向电泳蛋白质得率和等电聚焦效果的影响。结果表明, 不同的蛋白提取时间和蛋白上样量对等电聚焦效果影响较
大。适宜的豌豆白化苗提取时间应至少长于 8 h, 最好提取过夜, 能裂解得到大量蛋白质; 适宜的豌豆白化苗蛋白上样量为
1 000
g,此条件下, 双向电泳的分辨率最高,分离出的蛋白大多为小分子量功能性蛋白。
关键词:  蛋白质组学  豌豆  2
DE
Establishment of Two
dimension E lectrophoresis Technique in Pea
(P isum sativum ) A lbino Seedlings
Zhao X in
1, 2  L iu H ongxia2  Chen Baihong1  B iYang1
(
1
TheN ationalK ey Facility for Crop Gene R esources and Genetic Improvem ent, Institute of Crop Sciences, Chinese A cademy of
Agr icultural Sciences, Beij ing 100081;
2
Co llege of Agronomy, Gansu Agricultural University, Lanzhou 730070)
  Abstrac:t  Th is study focused on the specific problem s o f pro te in extrac tion from pea seedling s tissues. Samp le prepara tion is a
critica l step in a tw o
dim ensional ge l electropho resis proteom e approach and is abso lute ly essential for good resu lts. W e used d ifferent
ex tract tim e ( 4 h, 8 h, and overn ight) and pro te in load ing am ount ( 500, 1 000, 2 000
g) to analyze the effects of these two factors on
the results of 2
DE. Results show ed tha t the optima l prote in ex traction tim e fo r pea a lb ino seed lings is not lesse r than 8 hours, preferab ly
overnigh t, wh ich can crack a large num ber o f prote ins; optim a l pro te in load ing am ount is 1 000
g, w hich can obta in as m any functiona l
prote ins as poss ible and the best reso lution in tw o
dim ensional e lectrophoresis. The establishm ent of 2
DE in pea a lb ino seed lings la id a
basis fo r further study the function of prote in invo lved in pea defense response.
Key words:  P roteom ic Pea 2
DE
收稿日期: 2010
03
17
基金项目:国家自然科学基金 ( 30500342 ),中国博士后基金 ( 2004036176 )
作者简介:赵鑫,男,在读硕士研究生,研究方向:果树生物技术; E
m ai:l 275972106@ qq. com
通讯作者:刘红霞,女,博士,副研究员, E
m ai:l liuhx@ caas. net. cn;陈佰鸿,男,博士,副教授, E
m ai:l bh ch@ gsau. edu. cn
随着后基因组学的发展,蛋白质组学已成为研
究植物生命现象本质的前沿和热点学科, 其核心技
术之一, 双向电泳 ( tw o
d imensional ge l electrophore

sis, 2
DE ),也成为高通量分离、研究蛋白质功能的
有力分析工具。豆科植物蛋白质组学研究中, 可见
少量对豆科植物特定组织 /器官 [ 1- 4 ]、生物 /非生物
胁迫 [ 1, 5]以及寄生 /共生关系 [ 2, 6 ]下差异表达蛋白的
分离和鉴定。而以豌豆白化苗为试材, 研究病原侵
染条件下豌豆防御相关蛋白的蛋白质组学研究国内
外还未见相关报道。
类黄酮类物质是豌豆体内的最主要抗菌物质,
直接与豌豆的抗病强弱呈正相关性 [ 7 ] ,而豌豆白化
苗中叶绿素含量较少,幼苗生长状态不仅较一致、对
外界刺激应答反应迅速, 而且在温室避光条件下可
实现多次取材,是较好的研究豌豆类黄酮类基因 /蛋
白功能的材料。然而,豌豆白化苗体内蛋白质含量
低, 蛋白质在提取过程中很容易发生降解, 利用 2

DE技术获得的一些蛋白, 也多为各种组织结构的
组成蛋白,如组成质膜 [ 8 ]、线粒体、内质网、高尔基
器 [ 9]等的蛋白质,与豌豆的防御反应毫无关联。虽
2010年第 10期 赵鑫等: 豌豆白化苗蛋白质双向电泳技术的建立
然不同的植物材料和组织器官蛋白质的提取方法有
所不同,但是获得足够量的蛋白质和精准的上样量
是保证 2
DE成功与否的关键, 也是研究蛋白质功
能的最基本步骤,直接关系到后续等电聚焦的效果。
如果双向电泳图谱分辨率较低,就不能分离出有效
的功能性蛋白质。因此, 本试验以豌豆白化苗为研
究对象,对蛋白提取时间和蛋白质上样量对 2
DE
蛋白质得率和等电聚焦的效果进行了分析探讨。本
研究为后续利用 2
DE技术获得重要的与豌豆防御
相关的功能性蛋白建立了良好的研究体系, 也为深
入了解豌豆的抗病防御反应机理打下了良好的研究
基础。
1 材料与方法
1. 1 试验材料
供试豌豆品种为中碗 6号 (P isum sativum Linn. ),
购自中国农业大学兽医畜牧学院。将蛭石材料灭菌
后和豌豆种子过夜泡涨后, 将种子均匀播于湿润的
蛭石表面 (约 1粒 /cm2 ) , 并遮光黑暗培养 ( 25 ,
HR 60% - 70% )。待遮光生长的豌豆苗长约 5 cm
左右时取样,液氮速冻 - 80 保存待用。
1. 2 试验方法
1. 2. 1 总蛋白质提取及定量  称取 1 g样品充分
研磨后转移至 50 mL离心管, 加入三倍体积的蛋白
提取液 ( - 20 预冷丙酮, 10% (W /V ) TCA (三氯乙
酸 ) , 20 mmo l/L DTT)振荡混匀, - 20 放置不同时
间 ( 4 h、8 h及过夜 ) ; 4 , 15 000 ! g离心后弃上清,
保留沉淀;用三倍体积并含 20 mmo l/L DTT的冷丙
酮重悬沉淀, - 20 放置 2 h,使色素充分脱去; 4 ,
15 000 ! g离心去上清,保留沉淀; 沉淀悬浮于 80%
的冷丙酮中, - 20 放置 1 h后, 再次离心去除丙
酮。沉淀自然风干, 按 30
L /mg向样品中加入蛋
白裂解液 ( 7 mol /L尿素、2 mo l/L硫脲、4% (W /V )
CHAPS、40mmol /L DTT、2% IPG bu ffer)。振荡均匀
后置于冰上,离心,保留上清,即为蛋白提取液,使用
Amersham公司 2D
Quant试剂盒对蛋白质进行分析
定量, 步骤按试剂盒说明进行。
1. 2. 2 等电聚焦及平衡  试验选用 24 cm, pH4- 7
的 IPG胶条 ( GE 公司 ) , 蛋白质上样量为 500、
1 000、2 000
g,每个上样量设 3个重复。首先用水
化液 ( 8 mo l /L尿素、2% (W /V ) CHAPS、3% (W /V )
DTT、2% IPG bu ffer)将上样样品定容至 450
L, 然
后直接加到胶条槽中。将 IPG胶条胶面朝下置于胶
条槽中, 在上面均匀滴加覆盖油。采用 Amersham
公司的 E ttan IPGphor∀等电聚焦系统进行等电聚
焦, 电泳参数设定如下: 30 V 8 h, 50 V 4 h, 300 V 1
h, 500V 1 h, 1 000 V 1 h, 8 000V 12 h。
等电聚焦完成后, 将胶条放入平衡缓冲液 #
( pH8. 8 1. 5 mo l/L Tris
C l、6 mol /L尿素、30% ( V /
V )甘油、2% (W /V ) SDS、1% (W /V ) DTT)中振荡平
衡 15 m in。胶条取出后再放入平衡缓冲液 ∃
( pH88 1. 5 mo l/L T ris
C l、6 mo l/L尿素、30% ( V /
V )甘油、2% (W /V ) SDS、4% (W /V )碘乙酰胺 )中振
荡平衡 15 m in。
1. 2. 3 蛋白 SDS
PAGE分离及染色  平衡好的 IPG
胶条置于预先制备好的 12. 5% SDS聚丙烯酰胺凝胶
上,低熔点琼脂糖封顶液将凝胶顶部封好。然后在
E ttan DALT six垂直电泳仪上进行第二向电泳。电泳
参数:预电泳 1 h, 1 w /胶;然后调节瓦数到 4- 5 w /
胶,待溴酚兰前沿恰好跑出胶外的时候停止电泳;冷
循环水仪为 Mu lt iTemp( tm )∀循环水浴冷却,设定温
度为 15 。
将凝胶放入固定液 ( 40%乙醇, 10%乙酸 )中固
定 30 m in。将固定后因脱水而变小的凝胶转移至
10% 的乙酸中放大 20 m in。将凝胶放入染色液
( 45 mL水 + 45mL甲醇 + 10mL冰醋酸 + 0. 25 g考
马斯亮蓝 R
250)中, 染色 10 m in。脱色液 ( 60 mL
水 + 30mL无水乙醇 + 10mL冰醋酸 )脱色,每隔1 h
更换 1次脱色液, 充分脱去背景色即可。脱色后用
2
D胶分析软件 ImageM aster 2
D P latinum 6. 0对双
向电泳图像进行分析处理。
2 结果与分析
2. 1 蛋白提取时间对蛋白质得率的影响
等量样品充分研磨后, 采用不同时间 ( 4 h、8 h
及过夜 )提取蛋白, 其余试验步骤均相同。冷丙酮
重悬沉淀后,自然风干, 加入蛋白裂解液,离心保留
上清,然后进行 SDS
PAGE电泳检测 (重复两次, 等
体积上样 ) ,结果 (图 1)显示,提取时间不同,蛋白质
的条带数量、染色深浅有明显差异。豌豆幼苗组织
提取 4 h, 无明显蛋白质出现; 提取 8 h, 蛋白质数量
较少, 染色较浅; 提取过夜,大量蛋白质出现。这表
101
生物技术通报 B iotechnology  Bulletin 2010年第 10期
明提取时间影响豌豆幼苗蛋白质的得率, 提取时间
至少应长于 8 h, 最好提取过夜。
1.蛋白 M arker; 2, 3.提取 4 h; 4, 5.提取 8 h;
6, 7.提取过夜
图 1 蛋白提取时间对蛋白得率的影响
2. 2 蛋白质不同上样量对双向电泳的影响
蛋白提取液使用 Am ersham公司的 2D
Q uant试
剂盒定量后, 采用不同的蛋白上样量 ( 500、1 000、
2 000
g ),然后按步骤完成等电聚焦, 其余步骤和
SDS
PAGE等步骤均相同。利用 ImageM aster 2D
Platinum6. 0的 2
D胶分析软件对双向电泳图像进
行分析,结果表明, 蛋白质等电聚焦上样量对电泳结
果影响较大 (图 2)。当蛋白上样量 % 500
g时, 图
谱中的蛋白质总点数约在 800左右 ( 758 & 15) , 分
离出的蛋白质较少,图谱分辨率低,经质谱鉴定出现
的蛋白点多为组织结构性蛋白质 (图 2
1) ; 当蛋白
上样量等于 1 000
g时,图谱中的蛋白质总点数增
加较多 (约为 1 100 & 10), 图谱分辨率高, 经质谱鉴
定后,出现的蛋白质点以小分子量的功能性蛋白居
多 (图 2
2) ;而当蛋白上样量∋ 2 000
g时,蛋白质
总点数反而下降 (约为 1 080 & 15)。图谱中虽然蛋
白质点较多,但等电聚焦不完全, 在酸性端有大量蛋
白质未完全分开 (图 2
3)。
图 2 蛋白上样量对双向电泳的影响
3 讨论
植物的种类和组织部位不同,蛋白质的提取方法
和提取时间有所不同,而获得足够量的蛋白质样品及
精准的蛋白上样量又是保证 2
DE技术成败的关键。
因此,在双向电泳中,蛋白质的提取和定量是研究蛋
白质的最基本和重要步骤。TCA /丙酮法是 2
DE技
术中提取蛋白质的常用方法,其原理是利用还原剂使
蛋白质完全变性而增加蛋白质在裂解液中的溶解性。
TCA法有很高的蛋白质溶解性, 获得的蛋白质点较
多,不影响蛋白质所带的电荷,且大分子的核酸物质
等也被除去 [ 10]。由于材料裂解时间决定蛋白质变性
的程度及提取的效率,因此,适当延长裂解时间,可使
DTT有充足时间打断二硫键而使蛋白质彻底变性,有
效增加蛋白质的溶解性,提高蛋白质从第一向到第二
向转移的效率。本试验中, 采用 4 h裂解材料,没有
获得任何蛋白质, 而当裂解时间延长至 8 h时,有少
量蛋白质被提取出来,但量不足, 而过夜低温提取后,
不仅大量蛋白质被提取出来,而且获得的蛋白质量较
充足,能保证后续质谱鉴定的需要,但是建议提取时
间不要过长,否则样品中的蛋白质易降解,不利于功
能性蛋白质分子的分离鉴定。
对于双向电泳来说, 蛋白质定量非常重要。因
102
2010年第 10期 赵鑫等: 豌豆白化苗蛋白质双向电泳技术的建立
为目前 2
DE技术中所使用的 IPG胶条都有一定的
蛋白质承载能力,如果上样量太大,会引起过量蛋白
质在 IPG胶条内聚集, 影响 IPG胶条内的等电聚焦
和后续电泳中的蛋白质分离。本试验中就观察到,
当上样量过大时 ( > 2 000
g ), 在电泳胶酸性端有
大量蛋白未完全展开。因此,等电聚焦上样量既要
保证有最大量的蛋白质存在,又要保证各蛋白质在
双向电泳中有最大的分辨率, 能够准确染色。在试
验中我们发现,利用专门的双向电泳蛋白质定量试
剂盒, 可以较准确、快速地定量蛋白质,而采用一般
的考马斯亮蓝法定量蛋白会出现较大的试验误差,试
验重复性也较差。利用试剂盒定量的方法, 我们在豌
豆白化苗上确定的最适宜蛋白上样量为 1 000
g左
右。另外,上样量也与胶条的 pH 范围和染色方法
有关。 pH 范围越窄, 上样量越大 [ 11] ; 染色方法不
同,上样量也可在数百微克 (银染 )到最大几十毫克
(考马斯亮蓝染色 )之间 [ 12]变化, 本试验采用了窄
pH和考染的方法, 需要的蛋白质上样量较大, 若采
用银染法和宽 pH 分离蛋白, 则应降低相应的蛋白
质上样量。
参 考 文 献
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