全 文 ：生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN·综述与专论· 2008年第4期
收稿日期:2008-01-11
基金项目:陕西省重点攻关项目(05JS47)
作者简介:薛柯(1982-),女,在读硕士研究生,从事基因工程与细胞工程制药研究;E-mail:elizabeth506@sohu.com
通讯作者:尉亚辉,博士生导师,Tel:86-029-88302199,E-mail:weiyahuicn@yahoo.com.cn
疫苗在帮助人们预防疾病方面有着十分重要
的作用,但由于生产技术和设备等各方面因素的制
约,使传统疫苗的生产成本十分高昂,从而限制了
其在发展中国家尤其是经济落后国家的使用。而利
用植物作为生物反应器生产口服疫苗,则大大降低
了疫苗的生产成本。自从 1992年 Mason等[1]首次利
用转基因技术在烟草中表达了乙肝病毒表面抗原
(HBsAg)以来,科学家已证实了多种植物口服疫苗
在临床免疫实验中的成功,这项以转基因植物作为
载体的新型疫苗产业正在兴起。
1 植物口服疫苗的优势和种类
与传统的疫苗相比较,植物口服疫苗具有很多
优势。例如,植物作为生物反应器具有完整的真核
表达系统,其表达产物能够进行正确装配和翻译后
修饰加工,与天然产物的结构和生物学活性都非常
相似。其次,植物口服疫苗还能有效的诱导粘膜产
生免疫反应,其植物细胞壁、细胞膜和细胞器的天
然生物胶囊作用能避免抗原蛋白在消化道中被降
解,有效地诱导肠胃黏膜免疫反应,同时又能起到
一定的缓释作用。另外,植物口服疫苗生产成本低
廉、易于运输储存、接种方式简单等优点更是传统
疫苗无法比拟的。
目前利用植物载体主要生产 3类疫苗:传染性
疾病疫苗、自身免疫疾病疫苗和肿瘤疫苗。
2 用于生产口服疫苗的受体植物
到目前为止,已成功用于生产口服疫苗的植物
有烟草、拟南芥、马铃薯、番茄、胡萝卜、莴苣、羽扇
豆、菠菜、玉米、苜蓿和藻类等。其中烟草和拟南芥
是模式植物,在口服疫苗早期开发性研究中应用较
多。
马铃薯是经常用于生产口服疫苗的植物材料。
例如 Arakawa等[2]将轮状病毒肠毒素蛋白表位与霍
植物口服疫苗及其安全性研究进展
薛柯 尉亚辉 张变玲 荆二勇 姬婧媛 张展鹏
(西北大学生命科学学院 西部资源生物与现代生物技术省部共建教育部重点实验室,西安 710069)
摘 要: 随着生物技术的不断进步,人们利用转基因技术定向改造现有植物品种的研究已经取得可喜的成绩。其
中利用植物材料作为生物反应器生产口服疫苗更是近年来的热点。主要介绍了植物口服疫苗的研究进展,对于存在的问
题提出了解决方法。
关键词: 植物口服疫苗 转基因 安全性
ReviewAboutPlant-inducedEdibleVaccineand
ItsSafetyResearch
XueKe WeiYahuiZhangBianling JingEryong JiJingyuan ZhangZhanpeng
(KeyLaboratoryofResourceBiologyandBiotechnologyinWesternChina,SchoolofLifeScience,
NorthwestUniversity,Xian710069)
Abstract: Transgenictechnologytomodifytraditionalplantshasbeendevelopedrapidlyespecialybyusing
transgenicplantsasbioreactortoproduceediblevaccine.Itwasdiscusedaboutthedevelopmentofediblevaccineinthis
paper.Problemswereshowedouttogetherwithsolutions.
Keywords: Ediblevaccine TransgenicplantsSafety
生物技术通报Biotechnology Buletin 2008年第4期
乱毒素 B亚单位(CTB)基因融合,并在马铃薯中表
达,口服免疫小鼠能产生可特异性抗血清和黏膜抗
体。G.B.SunilKumar等[3]还首次在马铃薯毛根中表
达了乙肝表面抗原蛋白 (HBsAg)。I.A.Mechtcheri
akova等[4]利用两种植物病毒载体马铃薯X病毒(Pota-
tovirusX,PVX)和豇豆花叶病毒 (Cowpeamosaic
virus,CPMV)在马铃薯中成功表达了乙肝病毒核心
蛋白(hepatitisBvirusnucleocapsidprotein,HBcAg)。
番茄的果实可以直接食用,且口感好,是研究
植物口服疫苗的理想载体。近年来,编码乙肝病毒
表面抗原(HBsAg)基因、HIVgag抗原基因和狂犬病
毒(Rabiesvirus)外壳蛋白的基因等多种基因已经
成功在番茄体内表达。Huang等[5]在番茄果实中表
达诺沃克病毒衣壳蛋白,小鼠口服后能诱导免疫应
答。本实验室也成功在樱桃番茄中表达了乙肝病毒
表面抗原蛋白[6]。
玉米等禾谷类作物种子中蛋白质含量高,储存
时间较长而不降解,干种子方便储藏和运输,也是
特别合适的疫苗载体。LijunYang等[7]以胚乳特异
型启动子 GluB1,在玉米种子胚乳中表达了 C-末端
带有 KDEL标记的屋尘螨(dermatophagoides,house
dustmite,HDM)主要抗原 Derp1融合蛋白。而且发
现这种植物表达的抗原的翻译后修饰表现为高度
的多聚甘露糖形式,与未糖基化修饰的抗原相比,
其与 IgE结合的能力有所降低。说明玉米种子中表
达的 Derp1抗原是安全的。
此外以三叶草、苜蓿、大豆、青椒、花生和菠菜
等作为植物生物反应器来生产口服疫苗也有不少
相关报道和动物实验证据[8]。
3 植物口服疫苗的动物免疫和临床应用进展
转基因植物生产的口服疫苗的动物免疫实验
效果及临床实验是检验疫苗有效与否的根本指标。
1992年 HughMason等[1]首次利用转基因烟草生产
口服乙肝疫苗,饲喂小鼠后证实烟草生产的抗原激
发了小鼠体内的免疫反应。此后,有越来越多的关
于转基因植物口服疫苗的动物实验报道,有些已经
进入临床 I/I期实验阶段。主要治疗疾病方向有细
菌性腹泻、乙型肝炎、狂犬病和麻疹病等。部分最新
研究报道如下。
Hsuan-FuChen[9]等将肠道病毒 71(Enterovirus
71,EV71)一种外壳蛋白 VP1蛋白基因转入番茄体
内并饲喂小鼠,该蛋白同时也是抗原决定部位。结
果在小鼠体内检测到了 VP1特异性的粪便 IgA抗
体和血液 IgE抗体。SergeiN.Shchelkunov[10]等科学
家构建了一种人造基因 TBI-HBS,分别编码人免疫
缺陷病毒 (humanimmunodeficiencyvirus,HIV-1)的
两个抗原决定部位和乙肝病毒表面抗原。用包含
TBI-HBS抗原的番茄果实饲喂小鼠,在 14d和 28d
后,在小鼠血液和粪便中出现了高含量的 HIV和
HBV特异性抗体。另外,LiPan等[11]研究出了一种
利用番茄生产的口蹄疫疫苗,对猪进行免疫后将其
置于感染病毒的环境中,结果发现猪体内产生了特
异的抗体,避免了被病毒感染。
自美国政府在 1997年首次批准了首例转基因
植物口服疫苗的临床实验以来,口服疫苗在人体内
的免疫实验取得了一定进展。例如YasminThanavala
等[12]以表达乙肝表面抗原的转基因马铃薯为材料,
对志愿者进行双盲实验以评价其免疫活性。每
100g马铃薯为一份口服剂量,其中 HBsAg含量约
为 8.5μg/g。研究者在志愿者食用了未经烹调的马
铃薯后检测发现,食用 3份剂量组的志愿者中有
62.5%的人血液抗 HBsAg抗体增加;食用两份剂量
组中这个数字为52.9%。Kapusta等[13]同样将转HBsAg
的莴苣给3人食用,有2人产生了免疫反应。Yusibov
等[14]利用转基因菠菜表达狂犬病毒,在 5名志愿者
的人体免疫实验中有 3人产生了免疫防御反应。
以上科研结果表明,转基因植物口服疫苗已经
具备了作为临床用免疫药物的初步条件,未来会成
为临床免疫治疗的重要组成部分。
4 面临的问题和解决方案
可以说植物口服疫苗尚处于起步阶段,需要解
决的问题还有很多。例如,外源蛋白表达量低且不
稳定、免疫有效性低、植物转化周期长、易产生非期
望效应、安全性问题等等。只有突破了这些瓶颈,才
能为转基因植物口服疫苗带来更广阔的应用前景。
目前面对这些问题在现阶段有如下解决方案。
4.1 提高表达量的解决方案
目前抗原在植物体内的表达量一般占可溶性
总蛋白的 0.01%~0.4%[15],多在 ng-μg级,与传统疫
苗还有很大差距。疫苗在植物中的产量取决于编码
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2008年第4期
(下转第46页)
抗原蛋白的基因序列的利用率,以及合适的植物转
化表达元件的构建。要达到提高外源蛋白表达量的
目的可从优化这两方面入手。如使用双增强启动
子、组织特异性启动子。优化密码子、优化抗原表
位。添加增强子或前导序列;降低目的基因与宿主
基因组的同源性以消除基因沉默;避免位置效应
等。此外,可将外源基因导入植物叶绿体基因中,这
样不但能使外源蛋白含量大幅提高(可达 46%[15]),
还能降低由于人为改变传统植物基因组结构而造
成的对生物多样性的破坏。近年来,也有越来越多
的科学家使用植物病毒作为瞬时表达载体来生产
疫苗,使外源基因随着病毒复制而在植物体内增
殖,瞬时高效表达外源蛋白。
4.2 优化免疫途径提高免疫应答的解决方案
主要需解决的问题包括确定合适的免疫剂量
和免疫方法、添加免疫佐剂、降低免疫耐受性等,这
些问题的解决是以抗原在受体植物中稳定高效表
达为前提的。
4.3 安全性问题及其解决方案
转基因植物生产的口服疫苗本质上是转基因
食品,而关于转基因食品的安全性问题无论对科研
界还是普通消费者来说都是关注的焦点。目前对转
基因植物自身的变化及其对饲喂动物、土壤生态系
统、周围生态环境的影响已经有很多研究报道。虽
然大众对于安全性的争论十分激烈,但并没有直接
的证据能够表明转基因食品对人体是有害的。随着
技术的不断完善,转基因安全性问题也并非无法解
决。
4.3.1 选择生物安全标记基因 转基因植物中的
标记基因主要分为选择基因 (富集转化细胞作用,
多为抗生素抗性基因)和报告基因(易于检测表达
产物,如绿色荧光蛋白基因 gfp等)。为了避免传统
的选择基因存在基因漂移,会使人体产生免疫耐受
性、破坏生态平衡等潜在危险(例如加拿大“超级杂
草”事件),可以剔除标记基因或者发展正向筛选系
统。由于前者存在效率低、步骤多等缺点,目前最有
效的方法是后者,使用对生物安全的非抗性标记基
因。这种筛选方法并不是将非转化的细胞杀死,而
是导入特定的基因使转化细胞具备特定的代谢优
势或利用特定的物质,使之生长旺盛,从而达到筛
选目的。目前发现的生物安全标记基因主要有糖类
代谢酶基因(pmi和 xylA)、干扰氨基酸代谢酶基因
(ak和 dapA)、绿色荧光蛋白基因(gfp)、β-葡萄糖
苷酸酶基因(gus)、核糖醇操纵子(rtl)和叶绿素生
物合成基因(hemL)。
4.3.2 降低非期望效应,增强遗传稳定性 由于转
基因技术本身的特点,使得转化植物的非期望效应
较易产生,外源基因的插入也会影响宿主植物染色
体结构,引起变异。目前对于非期望效应的分子检
测手段主要有蛋白质组学分析技术(如双向电泳技
术)和基因表达分析技术(如基因芯片技术),以国
际通用的“实质等同性”原则为指导来分析转基因
植物的安全性。而分析转基因植物的染色体变异则
要复杂困难的多,但值得指出的是虽然这种变异对
于植物基因工程的商品化是不利因素,但却为研究
外源基因的转录机制及其对受体植物基因组的影
响机制提供了物质基础。
4.3.3 外源基因去除技术 据北京农业杂志报道,
华裔科学家李义领导的实验小组经过 6年的努力,
终于在转基因植物对生态环境和人体健康的潜在
威胁方面获得突破。他们开发出了一种外源基因去
除技术,该技术的要点是在目标植物中加入了受
DNA调控片断启动子控制的特殊基因,该基因在
启动子的作用下,可根据科研人员的意愿,在需要
的时间和部位上将外源基因和自身从转基因植物
中切掉,从而使转基因植物的花粉、种子和果实不
再含有外来基因,达到用转基因植物生产出非转基
因植物的目的。这一技术的问世有望彻底解决转基
因食品的安全性问题。
4.3.4 生产疫苗的转基因植物与其他转基因植物
的不同 生产疫苗的植物作为药用植物与普通转
基因植物的种植管理方法应该有所不同。例如在指
定的区域内种植,与周围农作物隔离,避免物种之
间的相互干扰及外源基因的漂移,提供更高的安全
性。
5 结语
虽然现在转基因植物生产口服疫苗这项技术
尚处在科研阶段,在自身发展和外部环境两方面都
存在很多阻力,但是由于其具有治疗预防疾病的特
殊用途,使得这项技术相对于其他转基因植物工程
薛柯等:植物口服疫苗及其安全性研究进展 29
生物技术通报Biotechnology Bulletin2008年第4期
(上接第29页)
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具有更大的意义。可以肯定这项造福全人类的科学
研究将会继续进行下去,研究者们任重而道远。
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