全 文 ：技术与方法
生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2010年第 2期
构建微生物突变体的方法综述
张念章 逯忠新
(中国农业科学院兰州兽医研究所 家畜疫病病原生物学国家重点实验室
农业部草食动物疫病重点开放实验室 农业部畜禽病毒学重点开放实验室,兰州 730046 )
摘 要: 生物学范畴内的突变是指细胞中的遗传物质发生可遗传的改变, 包括 DNA碱基对的置换、增添或缺失等结构
的变化。人们利用突变生物体进行科学研究和培育新产品。综述了人工构建突变体的几种常用方法及原理, 着重介绍了应
用基因工程技术进行微生物改造的方法,为科研工作和生产实践拓展思路。
关键词: 构建突变体 微生物 方法 原理 基因工程
TheM ethods of ConstructingM icrobialMutant
Zhang N ianzhang Lu Zhongx in
(S tateK ey Laboratory of Veterinary EtiologicalB iology, K ey Laboratory of Grazing AnimalD iseases of M inistry
of Agriculture, K ey Laboratory of Animal Virology of M inistry of Agriculture, Lanzhou Veterinary
Research Institute, ChineseA cademy of Agricultural Sciences, Lanzhou 730046)
Abstrac:t Muta tion in the scope of b io logy re fers to the gene ticm ate rials wh ich ex isting in the cells can have hered itary changes,
inc luding the substitution, add ition or de letion of DNA basepa ir and o ther structure changes. The mutant is used for sc ientific researches
and acqu iring new products. This a rtic le in troduces som e useful m ethods abou t how to artificially construct m utant and the pr inciples,
empha tica lly introduces them ethods o fm icrob ia l transform ation by using genetic eng ineer ing techno logy. The purpo se is to deve lop ideas
for sc ientific research and practice.
Key words: Constructing the mutant M icroo rganism M ethod P rinc ip le Ggene tic eng ineer ing
收稿日期: 20091218
基金项目:国家 十一五 !重点基础研究发展计划 ( 973!计划 )项目 ( 2006CB504403) , 国家 十一五 !科技支撑计划项目 ( 2006BAD06A01,
2006BAD06A12 )
作者简介:张念章,男,研究生在读,研究方向:细菌分子生物学; Em ai:l n ian zhang2008@ yahoo. com. cn
通讯作者:逯忠新,主要从事细菌分子生物学研究; Ema i:l luzhongx in@ hotm ai.l com
自然条件下发生突变的频率很低, 其中不理
想的突变还会因物竞天择被淘汰, 而有利于物种
的突变则会被逐渐累积下来。人们正是利用这些
突变,将物种向人类有利的方面进行选择。随着
社会的发展, 人们迫切需要提高突变的频率以创
造出更多的满足人类需要的变异类型, 进而从中
选择、培育出优良的生物品种。人类模拟自然产
生高突变的条件,用物理、化学等因素人为诱发基
因突变,获得了许多符合人类需求的突变株。分
子生物学诞生之后,人们对基因的认识逐步加深,
使人们可以利用基因工程的手段, 实现基因的定
点改变。这不但能够使生物的性状在很短的时间
里得以改变, 而且精确了整合位点,增加了突变的
目的性。
1 物理诱变方式
11 紫外光
紫外线是诱发微生物突变的一种非常有用的工
具。DNA和 RNA的嘌呤和嘧啶有很强的紫外吸收
能力,最大的吸收峰在 260 nm。因此,波长在 200-
300 nm的紫外光才有诱变作用 [ 1]。紫外线可引起
生物体形成嘧啶 (主要是胸腺嘧啶 )二聚体、嘧啶水
合物和引起 DNA分子交联。其中形成嘧啶二聚体
的生物学效应研究的比较清楚。由于二聚体的出现
会减弱双链间氢键的作用,引起双链结构扭曲变形。
同时又会妨碍双链的解开, 阻碍碱基正常的互补配
2010年第 2期 张念章等:构建微生物突变体的方法综述
对,影响 DNA的复制和转录, 从而导致突变或死
亡 [ 2]。尽管不断有新型的诱变技术产生, 紫外诱变
技术因其操作简单,效果显著, 在很多领域仍然发挥
重要作用。
利用紫外线照射的方法,对原始反硝化菌株 R1
进行诱变,成功筛选出好氧反硝化性能有所提高的
正突变优势菌株 ZR43, 提高了菌株中的亚硝酸盐还
原酶的活性, NO2 N转化速率升高,总氮去除率达到
了 3948% ,比亲本 R1提高了 1806% [ 3]。
12 电离辐射
电离辐射是指一切能引起物质产生电离作用的
辐射总称。生物学上常用 射线进行辐射, 此外还
有 X 射线、射线和快中子等。这些射线可直接将
能量传递给生物分子, 使细胞中有序排列的生物大
分子处于激发和电离状态。引起遗传物质的变化主
要是碱基的氧化作用,糖苷键及 DNA单链键或双链
键断裂。伴随着生物大分子化学键的断裂, 有机体
内产生大量的离子和自由基。这些自由基与细胞中
的溶质分子相互作用,诱发酶的释放,导致代谢的方
向性和协调性紊乱, 促使开始的生物化学损伤进一
步发展,引起了机体内环境的进一步变化 [ 4]。其中
具体的机理尚不清楚。
13 离子注入
离子注入技术最早用于农作物育种, 近几年来
因其在微生物诱变育种中的高效性, 得到了越来越
广泛的应用。离子注入生物体内会在动量、能量和
质量的三重作用下产生不同的生物学效应。因此,
与生物体的相互作用存在峰值,在峰值范围内,注入
离子与生物体的相互作用是局部的、双重的和不易
修复的。在离子注入过程中,生物分子将会吸收能
量,经历复杂的物理和化学的变化, 产生各类自由
基。这些活性自由基, 不但可以引起正常生物分子
的损伤,致使细胞中的染色体畸变, DNA链断裂,也
可使质粒 DNA形成断裂点。产生染色体重复、易
位、倒位, 碱基缺失等多种生物学效应 [ 6]。离子注
入技术与目前其它的诱变源相比, 具有 LET值高,
射程可控,集束性好, 能量沉积和质量沉积区域集中
等优点,在不同的作物及菌种的诱变育种中发挥出
巨大的作用 [ 7 ]。许安等 [ 8]利用离子注入技术诱变
巨大芽抱杆菌和氧化葡萄糖酸杆菌, 选育出遗传性
状较为稳定的维生素 C前体 2酮基L古龙酸高产
菌系 IPPM 1028, 其转化率较出发菌提高 188%。
14 微波
微波辐射属于一种非电离性高频电磁波, 在
300MH z- 300 GH z范围内有较强的生物效应,主要
对生物体产生热效应和非热效应。在微波作用下,
生物体会产生局部温度上升 (热效应 )以及非温度
关联的各生理生化反应 (非热效应 ), 进而产生一系
列突变效应。在低功率微波条件下, 对干酪乳杆菌
属李糖亚种 X112进行诱变处理, 得到一突变菌株
W439,其 L乳酸产量比原始菌株 X112提高了
580% ,且连续遗传 10代,产酸性状稳定 [ 9]。
15 其它
除上述的方法之外,还有利用其它物理因素进
行的诱变,如利用激光、太空条件等, 或多种方法联
合使用构建生物突变体。
2 化学诱变方式
化学诱变剂是一类能和 DNA起作用,进而改变
DNA的空间结构或者结构组成, 导致 DNA产生变
异的物质。按其诱变机制可分为碱基类似物诱变
剂、直接诱变 DNA结构的诱变剂和诱发移码突变的
诱变剂 3类。利用化学诱变剂进行的化学诱变具有
使用方便,特异性较强和诱变后代较易稳定遗传等
特点。该方法已培育出许多具有生产利用价值的微
生物新品种,给生产带来了巨大的经济效益和社会
效益 [ 10]。
21 烷化剂
烷化剂又称生物烷化剂, 是一类能形成碳正
离子或其它亲电性基团的化合物。常用的烷化剂
包括亚硝基胍 ( NTG )、甲基磺酸乙酯 ( EM S)、硫酸
二乙醋 ( DM S)和硫酸二乙酯 ( DES)。其中 EM S是
目前公认的效果最好和应用最广的一种化学诱变
剂。其诱变作用主要发生在鸟嘌呤 N 7位置上,
烷基取代 H离子后, 使之成为一个带正电的季铵
基团, 从而发生两种遗传效应: 一是烷化的鸟嘌呤
与胸腺嘧啶配对, 代替胞嘧啶, 发生转换突变 (即
G: C变为 A∀T ) ; 二是由于鸟嘌呤的 N7烷基活
化,糖苷键断裂造成脱嘌呤, 鸟嘌呤的位置成了一
个空位, 复制时其互补位置上的碱基就不受严格
的配对限制, 4种碱基都有机会进入, 从而造成置
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生物技术通报 B iotechnology Bulletin 2010年第 2期
换现象。此外, EM S还可以造成糖磷酸骨架断
裂, 引起染色体缺失。与其它诱变剂相比, EM S诱
变后产生的突变频率高, 且多为显性突变体, 易于
突变体的筛选。
22 其它诱变剂及复合诱变
除了烷化剂外, 平阳霉素 ( PYM )、秋水仙素、5
溴尿嘧啶 ( 5BU )、2氨基嘌呤 ( AP)等也常用于诱
变工作。
将两种或多种诱变剂的联合应用于突变育种工
作中就形成了复合诱变。该诱变过程包括: 两种或
多种诱变剂的先后使用; 两种或多种诱变剂的同时
使用; 同一种诱变剂的交替重复作用等。普遍认
为, 如果将两种或两种以上诱变剂合理搭配使用,
诱变剂间的协同效应会产生较单一诱变更好的效
果。以一株绿色木霉 F1为出发菌株, 经紫外线、
亚硝基胍、硫酸二乙酯三种因素依次处理, 以每一
轮诱变处理筛选到的酶活最高的突变株作为下一
轮诱变的出发菌株。最终筛选到一株产酶量高且
性状稳定的高产菌株 D8, 其相对酶活较出发菌株
提高了 406% [ 11 ]。
3 基因工程的方法
无论是物理方法还是化学方法亦或多种方法的
联合应用,都是改良传统生物、获得新性状的经典诱
变方式。但是在实际操作中却有着诱变过程较盲
目,筛选和选育的工作量浩大等局限性。基因工程
技术手段的诞生克服了这些缺点,经过 30多年的发
展,该技术在基础理论研究和实际生产应用等方面
都取得了惊人的成绩。
31 DNA标签法
当一段特定的 DNA序列插入到基因组目的基
因的内部或其附近位点时, 便会诱发该基因发生突
变,形成突变体。根据这一作用原理,用已知的插入
DNA分子做探针,发展出来一种分离未知基因的方
法。由于插入的 DNA序列, 相当于人为的给目的基
因加上一段已知的序列标签,因此称 DNA插入突变
分离基因的技术为 DNA标签法, 亦叫基因标签法。
它包括 TDNA标签法和转位子标签法两大类。其
中转位子标签法又可分为同源转位子标签法和异源
转位标签法。B rown等 [ 12 ]利用转位子标签法鉴定
了与禽类致病性大肠杆菌毒力相关的染色体区域,
特征标签突变 ( signaturetaggedmutagenesis, STM )成
为研究大规模微生物基因组功能一种常用方法。如
今, 人工利用标签法来获得细菌基因突变株的技术
已日渐成熟。Bae等 [ 13]运用转座技术寻找葡萄球
菌的毒力因子。
32 基于载体构建的突变体
常用的构建突变体的载体包括质粒载体、噬
菌体载体以及二者部分结构组合成的噬菌粒载
体。细菌质粒是存在于细胞质中的一类独立于染
色体的自主复制的遗传成份, 可以持续稳定的处
于染色体外的游离状态。人们利用质粒转移技术
打破物种界限, 赋予生物新的遗传性状, 使外源基
因在受体细胞内按照人们期望的方式进行表达,
并进行基因功能分析等研究。与质粒相似, 噬菌
体也可作为外源基因表达的载体。最常用的噬菌
体载体是 噬菌体载体。根据使该载体失活的方
法,又可以分为插入型载体和替换型载体。利用
噬菌体实现基因克隆和表达的有 DNA连接酶、
DNA聚合酶 #等。由部分质粒载体和部分单链噬
菌粒载体组合而成的具有双功能的新型大肠杆菌
克隆载体系列, 就形成了噬菌粒载体。它有两个
复制起点, 其一来自 Co lE1, 其二来自单链噬菌体
f1。此载体具有分子量小、克隆能力大、可遗传稳
定等优点。基于载体构建微生物突变株, 特别是
用质粒为载体, 是目前在基因工程中应用较多的
构建突变体的方法。
33 基因打靶技术
20世纪 80年代后期发展的基因打靶技术, 通
过在转染细胞中发生外源打靶基因与核基因组目标
基因之间的 DNA同源重组,真正实现了外源基因定
点整合到基因组特定位置上的目的, 从而可以有针
对性的改变细胞的遗传特性。
基因打靶的分子基础是两条具有相同或类似
核苷酸序列的同源 DNA分子之间发生的遗传信息
的重组事件。因此, 基因打靶需要首先将要整合
到受体细胞核基因组目标座位的外源打靶基因,
以及位于打靶基因两侧与内源目标基因同源的
DNA片段, 克隆在具有选择性标记基因的载体 (如
自杀性质粒载体 )上, 构成专用的基因打靶载体。
之后再将其转化进感受态的受体细胞。由于外源
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打靶基因的两侧与内源核基因组上的目标基因或
座位之间存在着同源的 DNA序列,两条 DNA链的
相同部分便会相继发生单链断裂、链的交换、磷酸
二酯键的形成和缺口重新封闭等一系列变化, 并
最终完成同源重组, 实现外源基因在核基因组
DNA上的定点组合。基因打靶的效率取决于 DNA
同源重组的频率, 这与两条重组 DNA分子之间的
同源序列的长度密切相关。现在, 该技术在检测
基因功能、治疗遗传疾病等方面有着研究与应用。
Da isuke等 [ 14]将扩增的链球菌 sly基因片段中间部
分序列用 ca t基因代替, 连接到热敏自杀性质粒载
体 pSTE4上, 构建了基因打靶载体 pSLYK。然后
将此载体用电转法导入链球菌中, 获得了链球菌
的 sly基因缺失株。
34 RNA干扰技术
20世纪 90年代发现的 RNA干扰 (简称 RNA i)
现象也可以高效而特意的阻断体内相应基因的活
性,发挥基因剔除的作用。于是,人们开展了利用人
工方法诱导生物体产生 RNA i效应的 RNA i技术工
程。 Jacque等 [ 15 ]化学合成了与 H IV1基因组几个
区域相对应的 siRNA, 然后将其与 H IV1分子克隆
共转染 CD4阳性的 H eLa细胞 (M ag i) [ 16]。与未转
染 siRNA的细胞相比较, 病毒产物在 24 h内减少了
30- 50倍。
RNA i引起基因沉默的大致过程是外源性的
dsRNA在 D icer酶的切割下形成 21- 25 bp的 siR
NA。该 siRNA便会同 RNA 诱导的沉默复合体
( RNAinduced silencing complex, R ISC )结合, 并将
其激活。激活状态的 R ISC催化 dssiRNA发生解
旋和解链。其中的反义链会附着在 R ISC表面与
mRNA配对, 形成新的 siRNA, 再循环作用于另外
的靶向 mRNA。另一条链会被释放分解。这种不
断放大的瀑布式作用形成大量新的 siRNA, 使 siR
NA在短时间内迅速有效的抑制 mRNA翻译, 从而
有抑制靶向基因蛋白或多肽的合成。内源性的
mRNA会因存在反向重复序列而形成发卡结构的
m iRNA,也会产生 RNA i。其过程与 siRNA 形成
RNA i的过程虽有差别但大致相同。现已发现在
真菌等绝大多数真核生物中都有 RNA i现象的发
生。人类应用 RNA i技术,必将带来操控生物性状
改变的新的革命。
4 总结
前面讨论的各种获得微生物突变体的方法, 是
目前较常用的构建方法。在具体的生产实践或科学
研究中,可以根据研究对象、实验室水平等因素进行
适当的选择,也可以根据试验目的进行物理、化学和
基因工程手段的联合应用。人工构建微生物突变体
必将为科学研究和生产实践提供有力的平台。
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