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生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2011 年第 8 期
SYBR Green实时荧光 PCR高通量检测转基因大豆油
王华1，2 梁怀宇1 李华1
(1内蒙古民族大学生命科学学院，通辽 028000;2吉林农业大学食品学院，长春 130118)
摘 要: 采用 SYBR Green实时荧光 PCR技术，建立了食用大豆油转基因成分的检测方法。根据转基因大豆中内源参
照基因 lectin和外源基因 35S启动子、NoS终止子和 cp4 epsps 基因，设计特异性引物，在 Roche 荧光 PCR 仪上进行实时荧光
PCR扩增。荧光曲线表明，SYBR Green实时荧光 PCR可特异性地检测大豆油中的转基因成分，方法准确、快速，并运用熔解
曲线进行产物分析，验证了试验结果的特异性和准确性，检测方法灵敏度高。
关键词: SYBR Green实时荧光 PCR 转基因 大豆油 检测
High Throughput Detection of Transgenic Ingredient from Soybean
Oil by Real-time Fluorescent SYBR Green PCR
Wang Hua1，2 Liang Huaiyu1 Li Hua1
(1College of Life Science，Inner Mongolia University for Nationalities，Tongliao 028000;2College of Food
Science and Engineering，Jilin Agricultural University，Changchun 130118)
Abstract: Using a rapid Real-time polymerase chain reaction(PCR)method to detect transgenic ingredient from soybean oil was
established in this study． Primers were designed according to the endogenous lectin gene and transgenic target 35S，NoS and cp4 epsps
gene of the transgenic soybean and these genes were amplified． Meanwhile，the specificity of PCR amplification was analyzed with corre-
sponding melting curves． In conclusion，this method is fast，sensitive，accurate and specific，and can be used to qualitative detect trans-
genic components in soybean oil．
Key words: Real-time fluorescent SYBR Green PCR Transgenic ingredient Soybean oil Detection
收稿日期:2011-01-10
基金项目:内蒙古民族大学校内课题(MDX2008024)
作者简介:王华，女，博士研究生，研究方向:功能性食品与生物反应器;E-mail:huaking1981@ 126． com
通讯作者:李华，女，本科，研究方向:功能性食品;E-mail:lihuahli@ 163． com
通过基因工程技术改变基因构成的动植物和微
生物生产的转基因食品正在不断扩大其在传统食品
市场中的份额，逐渐走上人们的餐桌，进入人们的食
物链。而在众多转基因食品中，食用油所占比重较
大，其原料之一大豆占全球转基因作物总种植面积
的 63%［1］。这些转基因大豆出油率高，制油成本
低，经济效益显著，发展迅速［2，3］。转基因大豆经过
工艺处理而来的大豆油，其中所含有的转基因成分
DNA非常少，因此需要一种灵敏度和稳定性高的
PCR方法来对其进行检测［4，5］。
近年来，荧光 PCR在转基因产品检测中应用比
较广泛［6］，主要有两种方法，一是目的基因与非特
异性染料结合，二是荧光探针标记。对于染料结合
法，荧光定量 PCR 最常用的 DNA 结合染料是 SYBR
Green，当它与双链 DNA结合时会发出很强的荧光，
而不与双链结合的只发出微弱荧光。因此，荧光
PCR反应出现的双链 DNA 的数量与反应发出的荧
光信号强度成正比，可以根据荧光信号强度检测出
PCR体系生成的双链 DNA数量，从而快速确定产品
中转基因的成分组成［7］。本试验通过应用 SYBR
Green实时荧光 PCR 技术对转基因大豆油进行检
测，旨在针对 DNA 含量低的食用油建立一种灵敏、
简便、快速和高通量的外源基因定性检测方法。
1 材料与方法
1. 1 材料、试剂与仪器
转基因大豆标准物质(国内、进口) ，非转基因
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2011 年第 8 期
大豆粉标准物质购自国家标准品中心;进口转基因
大豆油、国产转基因大豆油、国产非转基因大豆油市
购;Power SYBR Green PCR Master Mix 购自 ABI 公
司;SYBR Premix Ex Taq 酶、rTaq 酶、dNTPs、10 ×
PCR buffer 购自 TaKaRa 公司;CTAB、石油醚、异丙
醇、乙酸钠、三氯甲烷、异戊醇、乙醇等为进口或国产
分析纯;荧光 PCR 仪 Roche LightCycler 4. 0;根据
NCBI上查得的基因序列，使用 Primer primer 5. 0 引
物设计软件设计引物，由宝生物(工程)大连有限公
司合成，引物序列见表 1。
表 1 实时荧光 PCR试验所用引物
基因名称 引物序列(5→3)
扩增片段
长度(bp)
lectin
GCCCTCTACTCCACCCCCATCC
GCCCATCTGCAAGCCTTTTTTGTG
118
35S启动子
GCTCCTACAAATGCCATCA
GATAGTGGGATTGTGCGTCA
195
NoS终止子
GAATCCTGTTGCCGGTCTTG
TTATCCTAGTTGCGCGCA
180
cp4 epsps
TGATGTGATATCTCCACTGACG
TGTATCCCTTGAGCCATGTTGT
172
1. 2 方法
1. 2. 1 大豆油 DNA 提取 参考 CTAB 法提取
DNA［8 － 10］，进一步优化得到以下大豆油 DNA 提取
方法:(1)取 20 mL 样品，加入 20 mL 正己烷，20 －
25℃于磁力搅拌器上搅拌 3 h; (2)加入 40 mL TE
缓冲液，继续在 20 － 25℃于磁力搅拌器上搅拌过夜
(约 15 h) ，然后 4℃，12 000 r /min，离心 20 min，小
心去除油相;(3)加入等体积的 CTAB 提取缓冲液，
混匀，20 － 25℃静置 1 h，12 000 r /min，离心20 min，
取上清液;(4)加入与上清液等体积的异丙醇和上
清液 1 /10 体积的 3 mol /L 乙酸钠，混匀，20 － 25℃
静置 6 h，12 000 r /min，离心 20 min，弃上清液，留沉
淀;(5)加入 1 mL TE缓冲液溶解沉淀，加入等体积
的体积比为 24∶ 1的三氯甲烷:异戊醇，缓慢颠倒摇匀
5 min，12 000 r /min，离心 10 min，取上清液;(6)加入
1 /10体积的 3 mol /L乙酸钠和等体积的 4℃预冷的异
丙醇，缓慢混匀，4℃ 静置过夜(15 h); (7)4℃
14 000 r /min离心 15 min，弃上清液;(8)用400 μL 4℃
预冷的 70%乙醇洗沉淀，除去残留的乙醇，干燥沉
淀，得到 DNA沉淀;(9)加入 25 － 35 μL灭菌的去离
子水，溶解 DNA沉淀。
1. 2. 2 定性 PCR 以大豆内源参照基因 lectin 做
定性 PCR 来检测大豆油中 DNA 提取的质量［11］。
反应在 50 μL 体系中进行，lectin 引物序列见表 1，
其中 DNA 模板 2 μL，10 × PCR buffer 5 μL，dNTPs
0. 2 μmol /L，rTaq 酶 1 U，上下游引物各 0． 4 μmol /L，
无菌水补齐至 50 μL。PCR 扩增程序:95℃预变性
2 min;95℃变性 20 s，60℃退火 25 s，72℃延伸 35 s，
35 个循环;72℃延伸 10 min。
1. 2. 3 实时荧光 PCR 以进口转基因豆油、国产转
基因豆油、国产非转基因豆油及 3 个标准品分别提
取的 DNA 为模板，使用荧光 PCR 同时检测其内源
参照基因 lectin 及外源基 因 cp4 epsps、35S、
NoS［12 － 15］。PCR 反应体系为 20 μL，其中 SYBR
Green PCR Master Mix 10 μL，SYBR Premix Ex Taq
酶 1 U，上下游引物(参照表 1)各 0． 4 μmol /L，模板
DNA 2 μL，无菌水补齐至 20 μL。空白对照以无菌
水代替模板 DNA。每个反应做两个重复，PCR 扩增
程序:95℃预变性 15 min;95℃变性 10 s，59℃退火
25 s，72℃延伸 25 s，共 50 个循环。
1. 2. 4 熔解曲线反应程序 荧光 PCR 循环结束后
进行熔解曲线分析，温度从 60℃升至 95℃。先在
60℃保温 2 min，后以 0. 4℃ /s 的速率升温直到
95℃，在这个过程中进行连续采集荧光信号。
2 结果与分析
2. 1 样品 DNA的提取
提取到质量较好的基因组 DNA 是进行转基因
成分定性及定量 PCR 扩增检测的基础。大豆内源
参照基因(lectin)在细胞中的表达量或在基因组中
的拷贝数是恒定的，不受外界影响，lectin 基因数量
的多少可作为大豆基因组多少的参照［9］。通过对
lectin基因的扩增，可以判断所提取的 DNA 可否用
于荧光 PCR扩增，从而避免结果出现假阴性。
用 1. 2. 1 方法提取的豆油总 DNA，其 OD260 /280
= 1. 6 － 2. 0，完全符合实时荧光 PCR 的要求而且明
显优于不用正己烷和苯酚 －氯仿抽提的 DNA模板。
相反，未经反复沉淀和溶解的 DNA，OD260 /280=
0. 8 － 1. 0不能满足实时荧光 PCR的要求。
401
2011 年第 8 期 王华等:SYBR Green实时荧光 PCR高通量检测转基因大豆油
本试验根据 lectin 基因的特异性引物，1%琼脂
糖电泳结果(图 1)显示，进口转基因大豆油、国内转
基因大豆油、进口转基因大豆标品、国产转基因大豆
标品及非转基因大豆(阴性对照)均扩增出了特异
性强的大小为 118 bp 的片段，结果表明所提取的
DNA质量符合后续实时荧光 PCR 扩增需要。
1．非转基因大豆标品;2．国内非转基因大豆油;3．进口转
基因大豆标品;4．进口转基因大豆油;5．国产转基因大豆
标品;6．国产转基因大豆油;M． DL2000 DNA Marker
图 1 lectin基因定性 PCR扩增结果
2. 2 SYBR Green PCR检测结果
在荧光 PCR 扩增的初期，反应动力学表现为一
个稳定的线性递增过程［9］。在荧光 PCR扩增过程
中，Ct值表示每个反应管内的荧光信号(Rn)达到设
定的阈值时所经历的循环数，其与模板 DNA的起始
拷贝数的对数值存在一定的线性关系，其值越小，模
板的起始拷贝数越多;反之，模板的起始拷贝数
越少。
从材料中所选用的 3 个样品来看，所含基因除
了内源基因 lectin以外，主要的外源基因有 35S、NoS
和 cp4 epsps 3 个基因进行检测，这 3 个外源基因几
乎涵盖了目前所有的商品化转基因大豆油，也就是
说，针对上述 3 个外源基因进行检测，就可以判断待
检样品是否为转基因大豆油。图 2 是标准品及转基
因大豆油及非转基因豆油的筛选图，该图是食用大
豆油中内源基因与外源基因荧光 PCR扩增的结果，
其中阳性样品的扩增曲线均为“S”形，阴性样品非
转基因大豆标准品及空白对照的扩增曲线为水
平线。
从图 2 和表 2 可以看出，国产转基因大豆油中
含有 35S 和 NoS 基因;进口转基因大豆油中含有
cp4 epsps，35S 和 NoS 基因。从上述扩增结果可以
非常直观地判定待检样品是否为阳性样品，若为阴
性则不会检测到上述 3 个外源基因中的任何一个。
图 2 lectin、cp4 epsps、35S、NoS基因 SYBR Green PCR检测
501
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2011 年第 8 期
表 2 SYBR Green Ct值
样品
基因
国产转
基因
大豆油
国产转
基因
大豆标品
进口
转基因
大豆油
进口
转基因
大豆标品
国产非
转基因
大豆油
非转
基因
标品
NTG
(空白
对照)
lectin 22. 45 21. 61 22. 17 21. 65 22. 64 21. 83 —
cp4 epsps — — 34． 87 22. 08 — — —
35S 29． 88 22. 55 28． 87 22. 38 — — —
NoS 29． 62 22. 46 29. 01 22. 33 — — —
“—”指样品扩增曲线均为水平线
实时荧光 PCR反应的特异性利用自行建立的荧
光 PCR 反应体系进行实时检测，经过 50 个循环，在
实时荧光 PCR反应结束后进行熔解曲线分析。结果
显示，进口转基因大豆油中存在外源 cp4 epsps基因，
Tm =(73. 73 ±0. 08)℃;国产和进口转基因大豆油中
均含有外源基因 35S Tm =(83. 73 ± 0. 12)℃、NoS Tm
=(80． 60 ± 0. 24)℃，大豆内源基因 lectin，国产转基
因大豆标品和进口转基因大豆标品具有特异的熔解
曲线峰，Tm =(76. 92 ± 0. 13)℃(图 3，表 3) ，以上体
系中阴性对照及空白对照是一条无特异峰的曲线，
特异性扩增在熔解曲线中可以明显区别于非特异性
扩增。
图 3 内源基因与外源基因熔解曲线
表 3 实时荧光 PCR Tm值对照表
样品
基因
国产转
基因
大豆油
国产转
基因
大豆标品
进口
转基因
大豆油
进口
转基因
大豆标品
国产非
转基因
大豆油
非转
基因
标品
NTG
(空白
对照)
lectin 77. 05 76. 78 76. 97 76. 90 76. 85 76. 94 —
cp4 epsps — — 73. 81 73. 66 — — —
35S 83. 90 83. 82 83. 98 83. 76 — — —
NoS 80. 63 80. 84 80. 44 80. 48 — — —
“—”指样品无 Tm温度
3 讨论
本试验以 SYBR Green荧光 PCR定性检测食用
大豆油中的转基因成分，方法快速、准确。由于大豆
油属于高度深加工产品，其主要成分是脂类物质，水
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2011 年第 8 期 王华等:SYBR Green实时荧光 PCR高通量检测转基因大豆油
溶性 DNA 含量极低，此外由于大豆油在加工过程
中，高温高压作用使得 DNA 断裂为小片段，这也加
大了大豆油在提取过程中的难度。本试验采用改良
的 CTAB 法提取大豆油中的 DNA，通过采用充分
乳化、反复沉淀来富集小片段 DNA、延长醇沉淀
时间等方法提高提取率。通过大豆特异的内源
基因 lectin 的扩增，确认大豆油中 DNA 是否提取
成功，从而可以进一步说明所提取的 DNA 是否
可以用于后续荧光 PCR 反应，以排除假阴性结果
的产生。
SYBR Green实时荧光定量 PCR 方法中引物设
计是影响试验结果的重要因素，荧光定量检测引物
设计不仅应遵循引物设计一般原则，还应选择高度
特异性序列，选择具有最小二级结构的扩增片段。
试验通过对熔解曲线分析，证明所选择的几对引物
特异性强，符合 PCR 检测的特异性要求。由于大豆
油中 DNA含量较少且 DNA 片段不完整，因此选择
的引物扩增片段较小，结果所检测样品的待测基因
均能得到有效扩增。随着高通量快速检测在食品安
全领域中的应用越来越广泛，本试验采取在同一试
验中进行待测基因的扩增反应，引物具有相近的 Tm
值(≈68℃) ，避免了由于试验操作和环境因素所造成
的误差。本试验通过科学的引物设计，采用 SYBR
Green实时荧光 PCR 检测转基因大豆油中的转基因
成分，具有较好的特异性，而且可以达到高通量检测
的优点，能够满足转基因大豆油的快速、准确、高通量
定性检测要求。
参 考 文 献
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(责任编辑 马鑫)
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