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研究报告

生物技术通报
BIOTECHNOLOGY
BULLETIN 2010年第 11期
杂草稻 nrDNA ITS序列的测序分析
刘志文 1, 2
王英 1
陈温福2
( 1大连工业大学生物工程学院,大连 116034; 2沈阳农业大学水稻研究所,沈阳 110161)


摘
要:
杂草稻 nrDNA ITS序列的直接测序和克隆测序比较结果表明直接测序和克隆测序均能得到准确的杂草稻 nrD

NA ITS序列。尽管直接测序方便和经济, 但它的峰图差, 有叠峰出现。杂草稻的 ITS序列在 587- 589 bp之间, 其中 ITS1长度
为 193- 194 bp, ITS2的长度为 230- 232 bp, 而 5
8S均为 164 bp。与已公布的部分稻属的 ITS进行多重比较,该序列蕴含了
大量的系统学信息, 可在分子水平为杂草稻的发生机理提供证据。
关键词:
杂草稻 ITS序列
直接测序
克隆测序
系统学
Study on the Sequencing ofW eedy R ice Nuclear rDNA ITS
L iu Zhiwen
1, 2
W ang Y ing
1
ChenW enfu
2
(
1
College of B ioegineering, D alian P oly technic University, Dalian 116034;
2
Rice Institute of Shenyang Agricultural University, Shenyang 110161)


Abstrac:t
In this study, thew eedy rice nuc lear rDNA ITS sequences were compared using direct sequenc ing and clone sequenc ing
m ethods, respec tive ly, by both o f w hich, exac t ITS sequences we re obta ined. The direct sequenc ing was conven ient and low
cost, but
could appear overlap ap ices. The length of the ITS fragm ents w as 587 589 bp, including ITS1 193 194 bp, ITS2 230 232 bp, 5
8S 164
bp. The ITS data comb ined w ith partialOry za species in GenBank w ere analyzed by C lustW show ed that, the sequence conta ined m any
phy logenetic in fo rm ation and w ould prov ide direct mo lecu la r ev idence to clar ify thew eedy rice o rig in and evo lution.
Key words:
W eedy rice ITS D irect sequenc ing C lone sequenc ing Phy logene tics
收稿日期: 2010
04
20
基金项目:第 43批中国博士后科学基金项目 ( 20080431156 ) ,辽宁省教育厅项目 ( 2009S011 )
作者简介:刘志文,男,副教授,博士,主要从事作物分子生物学研究; E
m ai:l alzw@ d lpu. edu. cn
近年来随着大量的栽培稻改良品种的育成和
大面积推广, 已开始造成栽培稻的基因源大量流
失和遗传基础越来越狭窄。而与栽培稻有较近的
亲缘关系的一年生杂草稻 ( w eedy rice)由于经过长
期的自然选择,拥有复杂的遗传基础,存在着多种
多样的有益基因。因此, 它们可作为增加栽培稻
的遗传多样性和改良品种的优良种质资源加以研
究和利用, 正不断地受到水稻育种家们的重视。
为了更好的了解和利用它们, 首先有必要弄清楚
其产生的机理。在这一方面, 国内外的许多学者
对其进行了大量的研究并提出了许多推测, 但目
前尚无一致可信的结论, 特别是缺乏分子水平上
的直接证据 [ 1 - 4 ]。
近年来,分子标记技术特别是基因序列分析已被
广泛应用于植物系统关系的研究, 其中, 核 rDNA
( nrDNA )的内转录间隔区 ( internal transcribed spacer,
ITS)被 5
8S rDNA分隔成两段, 分别是于 18S和
5
8S之间的 ITS1以及 5
8S和 26S之间的 ITS2的
非编码区,尽管它的长度不大 ( 600 bp左右 ) , 但它
具有进化速率较快、稳定性好、测序方便和可以提
供较丰富的信息位点等特点, 已成为研究植物系
统发育及分子进化的有效工具和重要标记 [ 5- 7]。
在 DNA的序列测序分析中, 一般可采用 PCR
扩增产物直接测序或克隆测序两种方法进行, 前者
较后者更简单方便和廉价, 但具体哪种方法更合适
和能获得准确的系统学结果,尚有争论,不过近年来
发表的相关文章多数是直接测序结果 [ 8, 9]。本试验
旨在比较分析两种方法获得的杂草稻 ITS序列的特
点和差异,以期为杂草稻的起源与进化提供分子水
平上的直接证据。
生物技术通报 B iotechnology
Bulletin 2010年第 11期
1
材料与方法
1
1
杂草稻材料和 DNA的抽提
收集生长于中国不同省份 (辽宁、吉林、黑龙
江、江苏和湖北 )的水稻田间的杂草稻 10份, 分别
编号为WR1- 10, 播种于温室营养钵中, 24
育苗
20 d。取新鲜幼嫩的叶片, 采用小量 CTAB法提取
和纯化 DNA。
1
2
ITS引物设计和扩增程序
根据网上水稻 rRNA基因序列设计杂草稻 ITS
序列扩增采用双引物,分别设计为 ITS1: 5

GGAAG

TAAAAGTCGTAACAAGG
3
; ITS4: 5

TCCTCCGCT

TATTGATATGCTTAA
3
。设计扩增的目的片段大
小约为 700 bp。引物序列由北京华大基因公司
合成。
PCR反应体系: 20
L反应体积含 1
L模板
DNA, 0
125 mmo l/L dNTPs, 0
5
mol/L正反向引
物, 1U Taq酶, 2
0
L 10
Taq PCR buffer。
扩增程序: 95
预变性 3 m in, 95
45 s, 57

60 s, 72
60 s,循环 38次,最后在 72
保温20 m in,
4
保存。扩增仪 GeneAmp PCR System 9700,产物
在 UVP凝胶成像系统下观察拍照。
1
3
PCR产物的直接测序
取两个 20
L的相同 ITS的 PCR产物混合,其
中 5
L检测用,其余 35
L未经纯化, 直接送样至
北京华大基因公司用于测序反应。其中的测序引物
选择为扩增引物之一的 ITS1。
1
4
ITS目的片段的克隆测序
将经 PCR扩增得到的 ITS片段按照天根公司
的凝胶回收试剂盒 ( DP209
02)说明方法进行回收
和纯化。回收所得的 PCR产物与 pGM
T载体 (天
根公司 )连接, 转化导入由大肠杆菌 DH5
所制的
感受态细胞中,首先采用蓝白斑筛选法获得单克隆,
再分别应用菌落 PCR和质粒提取检测的方法确定
阳性克隆。最后将质粒送至北京华大基因公司进行
单向测序,测序引物为 M13+。
1
5
数据序列分析
测序结果主要在网上 ( http: / /www. ncb.i n lm.
nih. gov /b last /B las.t cg i)、( http: / /www. eb.i ac. uk /
Too ls/clusta lw / ) 和 ( http: / /emboss. b io informat ics.
nl/ cg i
bin / emboss/ revseq)进行比对和比较分析。
2
结果与分析
2
1
直接测序和克隆测序结果
首先对 1份WR1进行两次单向一个反应的直接
测序,两次结果完全一样, 因此其余的 9份就只进行
一次单向测序。测序公司所提供的直接测序长度均
大约在 700 bp左右, 并且 10份序列结果均能够准确
地分析到另一条扩增引物 ITS4的反向互补序列。
测序公司所提供的克隆测序结果表明, 10份材
料的结果均在 900 bp左右 (包含较多的载体序列 ),
较直接测序的大。克隆序列两端含有准确的引物序
列, 大小在 699- 701 bp之间, 与预期的大小完全
一致。
将二者的结果分别提交到网上进行比较分析表
明, 它们与网上已发表的水稻的 ITS结果相似性均
在 99%以上,表明两种方法均能得到准确的 ITS序
列结果。
2
2
两种结果的比较分析
分别比较每份材料的两种测序结果表明, 每份
材料大约有 650 bp左右的结果基本是一致的,相似
性在 99
54% - 100%之间, 而且差异主要是分布序
列的两端,这主要是测序公司的原因引起的,因序列
的前 10- 40 bp和 700 bp后均不太准, 仅能作参考。
除去两端的部分序列后, 两种测序方法所得结果完
全一致。
但对测序峰图进行比较发现,克隆测序较直接测
序的峰图清楚, 效果好,没有叠峰的出现。而直接测
序的图上则出现了 2- 4处 (如WR3的第 405和 419
位 )明显的叠峰 (图 1),但并没影响结果的判读。
2
3
杂草稻的 ITS系统学分析
杂草稻的 ITS1、5
8S和 ITS2的序列范围参考
GenBank上的水稻 rDNA序列确定。分析表明 10
份杂草稻的 ITS全长为 587- 589 bp, 对位后长度为
589 bp, 其中 ITS1长度为 193- 194 bp, G + C含量
为 72
16% - 72
68%, ITS2的长度比 ITS1大, 为
230- 232 bp, G + C含量为 75
86% - 76
52%。而
5
8S均为 164 bp, 十分保守, G + C含量为 59
15%
( 97 bp) ,较非编码区低。 10条序列中的两两序列
间的序列相似性在 99
66% - 100%, 表明杂草稻的
核糖体基因高度保守,也说明其种内遗传结构相对
稳定。
88
2010年第 11期


刘志文等:杂草稻 nrDNA ITS序列的测序分析
随机选择一份杂草稻WR2( 588 bp, AA基因组 )和网
上已公布的稻属籼亚种 (O. sativa ind ica group, AA,
图 1
直接测序的部分峰图结果
DQ355270
1)、粳亚种 (O. sativa Japon ica group, AA,
EF221613
1)、普通野生稻 ( O
ruf ipogon, AA, EU219
856
1)、尼瓦拉野生稻 ( O. nivara, AA, AY74936
2
1)、巴蒂野生稻 ( O
barthii, AA, AY749366
1)和
药用野生稻 ( O
off icinalis, CC, AF479063
1)各 1份
共 7份进行 C lustW 分析表明, ITS序列共有 58个
变异位点,占序列总长的 9
83%,其中 ITS1、5
8S和
ITS2分别有 25个、2个和 31个, 分别占变异位点总
数的比例为 43
10%、4
35%和 53
45%。序列变异
主要发生在 ITS的间隔区, 而 5
8S序列变异小, 十
分保守 (图 2)。这预示着稻属的 ITS的非编码区中
有着大量的系统学信息, 该序列将可为杂草稻的起
源进化提供分子水平的证据。
图 2
部分稻属的 ITS的 C lustW分析结果
3
讨论
在 DNA的序列分析过程中是选择克隆测序还
是直接测序方面,王建波等 [ 10]曾作了一个较好的分
析。值得注意的是, 克隆测序一般是无法检测到碱
基的黏合性的,以致难以确定物种的形成是否与杂
交有关 [ 11- 13 ]。本研究中也发现了杂草稻的直接测
序过程中存在有叠峰的现象,但并未影响结果的判
读,是否说明杂草稻是有关的近缘种杂交形成的,有
待进一步的深入分析和研究。
在 ITS的直接测序过程中, 有不少研究者们采
用了重新设计测序引物、将 ITS1和 ITS2分别测序
或双向测序等方法进行研究以保证结果的准确
性 [ 14- 16 ]。本研究表明,杂草稻的 ITS序列用扩增引
物之一进行一次单向测序反应也能获得准确的序列
结果,而且与克隆的序列结果完全一致。因此对直
接测序方法可以适当地简化, 在保证能够获得高质
和高纯的 PCR产物前提下, 只需 1次单向反应即
可, 既经济又方便。
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生物技术通报 B iotechnology
Bulletin 2010年第 11期
参 考 文 献
[ 1] Londo JP, S ch aal BA. O rigin s and popu lation genetics of w eedy red
rice in the USA. M olecu lar E cology, 2007, 16( 21 ) : 4253
4267.
[ 2] Cao Q J, L iB, Song ZP, et a.l Im pact ofw eedy rice popu lat ions on the
grow th and yield of d irect
seed ed and t ransplan ted rice. W eed B iolo

gy andM anagem ent, 2007, 7 ( 2) : 97
104.
[ 3] Kenn ethMO, Ana LC, Jia YL. E volut ionary genom ics of w eedy rice
in the USA. Journal of In tegrative P lan t B iology, 2007, 49 ( 6 ) :
811
816.
[ 4] W en J, L ing J, ZhangWW, et a.l M app ing QTL for seed dorm ancy in
w eedy rice. A cta Agronom ica S in ica, 2008, 34 ( 5) : 737
742.
[ 5] Q iXH, ZhangM F, Yang JH. M olecu lar phylogeny ofCh in ese vegeta

b le mu stard ( Brassica jun cea ) b ased on the intern al tran scribed
spacers ( ITS ) of nuclear ribosom al DNA. Gen et ic Resou rces and
C rop Evolu tion, 2007, 54( 8 ) : 1709
1716.
[ 6] 王晓丽,凡星,张春,等.用 n rDNA ITS序列探讨小麦族含 StH 基
因组物种的系统发育.草业学报, 2009: 18( 6 ): 82
90.
[ 7 ] 朱颖,董玉芝,昝少平,陈虹.基于 ITS序列探讨忍冬属的系统发
育关系.西北植物学报, 2010( 2) : 250
254.
[ 8] 钱锦,孙毅,段永红.普通小麦 rDNA的 ITS区及其基因组起源.
作物学报, 2009, 35( 6) : 1021
1029.
[ 9] Resetn ik I, L iber Z, Satovic Z. Mo lecular phylogeny and system at ics
of the L ilium ca rniolicum group ( L iliaceae) based on nuclear ITS
sequences. P lant System atic and Evolu tion, 2007, 265( 1
2) : 45
58.
[ 10] 王建波,张文驹,陈家宽.核 rDNA的 ITS序列在被子植物系统
与进化研究中的应用.植物分类学报, 1999, 37 ( 4) : 407
416.
[ 11] Kobayash i N, M izuta D, Nakatsuka A. A ttain ing in ter
subgen eric
hybrid s in fragrant azalea b reed ing and the inheritan ce of organelle
DNA. E uphyt ica, 2008, 159( 1) : 67
72.
[ 12] 袁长春,黎培新,王燕芳,施苏华.用核糖体 ITS区序列验证自
然杂交种M econopsis
cookie G. T aylor.遗传学报, 2004, 31 ( 9 ):
901
907.
[ 13] 侯鑫,刘俊娥, 赵一之,赵利清.基于 ITS序列和 trnL
F序列探
讨小叶锦鸡儿、中间锦鸡儿和柠条锦鸡儿的种间关系.植物分
类学报, 2006, 44 ( 2) : 126
134.
[ 14]唐绍清,钟扬,施苏华,张宏达. C am e llia n itid issima与 C. petelotii
之间的关系研究


来自 nrDNA ITS的证据. 武汉植物学研
究, 2001, 19 ( 6) : 449
452.
[ 15] R oalsonEH, Friar EA. Phylogenet ic relat ionsh ips and b iogeograph ic
p atterns in North Am erican m em bers of Carex section Acrocy stis
(Cyperaceae ) u sing n rDNA ITS and ETS sequen ce data. P lan t Sys

tem at ic and Evolut ion, 2004, 243( 3
4) : 175
187.
[ 16] 车建,唐琳,刘彦,等. ITS序列鉴定西红花与其易混中药材.中
国中药杂志, 2007, 32 ( 8) : 668
672.
(上接第 71页 )


b ioch ip for samp le preparat ion, polym erase chain react ion am p lifica

t ion, and DNA m icroarray detection. A nal Ch em, 2004, 76 ( 7 ):
1824
1831.
[ 12 ] W h itesidesGM. The origins and the fu tu re ofm icrof lu id ics. Natu re,
2006, 442: 368
373.
[ 13] Tabu ch iM, Baba Y. Self
con tained on
ch ip cell cu lture and pretreat

m ent system. J P roteom e Res, 2004, 3 ( 4) : 871
877.
[ 14 ] M unce NR, L i J, H erm an PR, L ilge L. M icrofab ricated system for
parallel single
cell cap illary electroph ores is. Anal Ch em, 2004, 76
( 17 ): 4983
4989.
[ 15] H u iWC, Y obasL, Sam perVD, et a.l M icrof lu id ic sys tem s for extrac

t ing nucleic acids for DNA andRNA analys is. Sen sors andA ctuators
A, 2007, 133 ( 2 ) : 335
339.
[ 16 ] HB L ,i Bash ir R. D ielectroph oret ic separat ion and m an ipu lation of
live and heat
treated cell ofL istera on m icrofab ricated devices w ith
in terd igitated electrodes. Sen sors and A ctuators B, 2002, 86 ( 2
3 ):
215
221.
[ 17 ] A raiF, Ich ikaw a A, Ogaw aM, et a.l H igh
speed separat ion system of
random ly suspended s ingle living cel ls by laser trap and d ielectro

phores is. E letrophoresis, 2001, 22( 2 ) : 283
288.
[ 18] W uHK, Wheeler A, Zare RN. Chem ical cytom etry on a p icoliter
scale
integratedm icroflu id ic chip. PNAS, 2004, 101( 35) : 12809
12813.
[ 19] SunY, Y in XF. Novelmu lt i
depthm icroflu id ic ch ip for single cell a

nalys is. Journ al ofC hrom atography A, 2006, 1117( 2 ): 228
233.
[ 20 ] H ellm ichW, Pelargu sC, Leffh alm K, et a.l S ingle cel lm an ipu lat ion,
analytics, and lab el
free protein detection inm icroflu idic devices for
system s nanob iology. E lectrophoresis, 2005, 26 ( 19) : 3689
3696.
[ 21] H ellm ichW, GreifD, PelargusC, et a.l Imp roved nat ive UV laser in

duced fluorescence d etect ion for single cell an alysis in po ly( d im eth

ylsiloxane) m icrofluidic devices. Jou rnal of Ch rom atography A,
2006, 1130 ( 2) : 195
200.
[ 22] Chen X, C uiDF, L iu CC, et a.l C on tinucous flow m icroflu id ic device
for cell separation, cel l lys is andDNA purificat ion. Analytica Ch im i

ca A cta, 2007, 584 ( 2) : 237
243.
[ 23 ] B lazejRG, Kum aresan P, et a.l M icrofabricated b iop rocessor for inte

grated nan oliter
sca le Sanger DNA sequencing. P roce Natl Acad S ci
USA, 2006, 103 ( 19) : 7240
7245.
[ 24 ] Ye N, Q in J, et a.l C ell
based high conten t screen ing us ing an inte

gratedm icrofluidic dev ice. Lab C h ip, 2007, 7: 1696
1704.
[ 25 ] M a B, Zhang G, et a.l C haracterizat ion of d rug m etabol ites and cyto

tox icity assay s imu ltaneously us ing an in tegrated m icrof lu id ic de

vice. Lab Ch ip, 2009, 9( 2 ) : 232
238.
90