全 文 ：·技术与方法·
生物技术通报
B IO TECHNOLO GY　BULL ETIN 2009年第 9期
简单重复序列间扩增分子标记技术及其应用
张玉星 1 　马艳芝 1, 2 　赵国芳 1, 3
(1 河北农业大学园艺学院 ,保定 071001; 2 唐山师范学院生命科学系 ,唐山 063000; 3 北京金泰恒业有限责任公司富地分公司 ,北京 100031)
　　摘 　要 : 　简单重复序列间扩增 ( ISSR)技术是在 PCR基础上发展起来的一种新型的分子标记技术 ,因其标记通常为显性
标记 ,呈孟德尔遗传 ,且在进行 PCR反应时 ,稳定性和多态性均很好 ,而成为是非常理想的分子标记技术。将从 ISSR分子标
记技术的原理及其在绘制 DNA指纹图谱、遗传多样性分析、种质鉴定等领域的应用进行综述。
关键词 : 　 ISSR　指纹图谱 　遗传多样性 　种质鉴定
Study of Inter2simple Sequence Repeat and Application
Zhang Yuxing1 　Ma Yanzhi1, 2 　Zhao Guofang1, 3
(1 College of Horticulture, Agricultural University of Hebei, B aoding 071001; 2 Departm ent of L ife Science, Tang Shan Teacher’s College,
Tangshan 063000; 3 B eijing Golden Tide Co. L td Fudi B ranch, B eijing 100031)
　　Abs trac t: 　 Inter2simp le sequence repeat ( ISSR) markers is a new kind of DNA markers based on the polymerase chain reaction
( PCR). Because ISSR technique p rovides a quick, reliable and highly informative system, it has been app lied in many aspects of ge2
nome research. It summarized the app lications in establishment of DNA fingerp rinting pool, genetic polymorphism s and genetic rela2
tionship , and the studies of cultivar identification.
Key wo rds: 　 ISSR　Fingerp rinting pool　Genetic polymorphism s　Cultivar identification
收稿日期 : 2009204230
基金项目 :河北省自然科学基金 (303240)
作者简介 :张玉星 (19612) ,男 ,河北沧州人 ,教授 ,博士 ,现从事果树结实生理与分子生物学研究 ; E2mail: jonsonzhyx@yahoo. com. cn
1　 ISSR分子标记技术原理及特点
ISSR ( inter2simp le sequence repeat)技术是一种新
型的分子标记 ,其原理是根据 SSR ( simp le sequence
repeat, SSR)的特点由 Ziekiewicz[ 1 ]于 1994年创建的
一种简单重复区间扩增多态性的分子标记技术。由
于真核生物基因组中普遍存在着有 1～4个碱基组成
的简单重复序列 ,又称之为微卫星 (M icrosatellite) [ 2 ] ,
如 ( GA) n、(AC) n、( GAA ) n 并且进化速度很快 ,同一
类微卫星 DNA可分布在整个基因组的不同位置 ,而
且由于重复次数不同或重复程度的不同而形成每个
座位的多态性 [ 3, 4 ]。
用于 ISSR扩增的引物通常 16～18个碱基序
列 ,由 1～4个碱基组成的串联重复和几个非重复的
锚定碱基组成 ,从而保证了引物与基因组 DNA 的
SSR的 5′或 3′末端结合 ,导致位于反向排列的间隔
不太大的重复间的基因组段进行扩增。由于 SSR
在真核生物中普遍存在且变异相对较快 ,因而锚定
引物的 ISSR2PCR扩增能够检测基因组许多位点的
差异 ,揭示遗传上的差异。
ISSR标记通常为显性标记 [ 5 ] ,呈孟德尔遗传 [ 6 ] ,
且在进行 PCR反应时 ,稳定性和多态性 [ 7 ]均很好。
与其它几种分子标记技术相比 ,有其独特的优越性 ,
因而是非常理想的分子标记技术 ,可用于构建以 PCR
为基础的分子图谱。目前 ISSR已广泛用于绘制 DNA
指纹图谱、遗传多样性分析、品种鉴定等许多领域。
2　 ISSR分子标记技术的应用
211　DNA指纹图谱的建立
ISSR分子标记可以用来构建 DNA 指纹库 ,在
同一物种的各个品种之间存在大量的多态性标记 ,
某一品种具有区别于其它品种的独特的标记即一些
特异性的 DNA片段的组合 ,称为该物种的“指纹 ”。
各个品种的独特的指纹片段构成该物种的 DNA指
2009年第 9期 张玉星等 :简单重复序列间扩增分子标记技术及其应用
纹库。DNA指纹库在作物育种的应用范围十分广
泛。Charters等 [ 7 ]利用 ISSR分析了 20个甘蓝油菜
品种 ,指出 ISSR是一种多态性很高 ,重复性好的指
纹库构建方法。王心宇 [ 8 ]利用 ISSR 标记对小麦
“矮牵牛”系列品种进行了指纹鉴定 ,结果表明 : IS2
SR引物扩增的谱带丰富 ,多态性水平高于 RAPD。
宣继萍等 [ 9 ]利用 ISSR技术构建了苹果品种的指纹
图谱 ,仅用 6个 ISSR引物 ,就有一个引物 ( IS061)即
可将普通富士、长富 2与长富 6相互鉴别开 (长富 2
与长富 6是富士的着色型芽变品种。
212　遗传图谱的构建和基因定位
遗传图谱既是遗传研究的重要内容 ,又是作物
资源、育种及分子克隆等许多应用研究的理论依据
和基础。在农业基础与应用研究领域 ,特别是构建
分子遗传图谱和标记目的性状基因方面取得很大进
展。许多科研工作者已利用 ISSR这一新的分子标
记技术构建遗传图谱的基因定位标记。 Tkojima
等 [ 10 ]利用 ISSR标记技术完善了一粒小麦的遗传图
谱 ,在 Triticum m onococcum 和 T. B oeoticum ssp boeotic2
um 之间检测到 224条 ISSR多态带 ,有 9条标记到
燕麦的染色体遗传图谱上。研究发现 , ISSR标记趋
向于分布于整个染色体组。实验数据支持 ISSR在
真核生物中普遍存在这一观点 ,此实验也是 ISSR标
记技术首次用于植物基因组作图。其中另据报道 ,
W u和 Tanksley等 [ 11 ]也将 ISSR技术应用于水稻遗
传图谱的构建。
目前关于应用 ISSR技术构建遗传图谱和抗性
基因定位的报道较少 ,仅 Ratnaparkhe等 [ 12 ]利用 IS2
SR标记了与抗性基因紧密连锁的抗性基因簇 ,标记
了鹰嘴豆中的抗 Fusarium wilt 4号小种的抗性基
因。而利用 SSR标记构建遗传图谱和标记抗性基
因的报道较多 [ 13～15 ] ,但它需要预先知道基因组的相
关信息 ,然后进行设计引物 ,因此工作较难开展。
ISSR标记不需要预先知道基因组的任何信息 ,避免
了 SSR的缺点 ,因此在遗传图谱的构建和抗性基因
的标记上将有很好的应用前景。
213　亲缘关系和遗传多样性研究
ISSR标记也可以进行亲缘关系鉴定和遗传多
样性的研究。Nagaoka等 [ 16 ]用 100个 ISSR引物对
小麦进行分析 ,共有 33个引物扩增出清晰可辨的多
态带 ,进一步用 SSR、RFLP和 RAPD对二倍体小麦、
四倍体小麦与六倍体小麦进行分析 ,结果基本一致 ,
且更接近 RFLP的结果 ,因而 ISSR用于估测小麦的
基因型是非常可靠的。江树业等 [ 17 ]以光敏核不育
水稻农垦 58S及其原始株农垦 59S核 DNA为模板 ,
进行了 RAPD和 ISSR多态性分析。结果表明 ,在可
扩增的 78个 ISSR引物中 , 7个 ISSR引物的扩增产
物表现出多态性。 Fang等 [ 6 ]分别用 ISSR, RFLP分
子标记技术对柑橘属的 48个三叶桔品种进行了多
态性分析 ,结果 RFLP检出多态性很低 ,而 ISSR检
出 17条多态性带。 Prevost等 [ 18 ]利用 ISSR引物对
34个马铃薯栽培种进行了多态性分析 ,结果证明它
们的多态性可以重复 ,并得到 2个 ISSR可以把 34
个马铃薯栽培种区分开的 ISSR引物。
进一步通过相关分析、聚类分析等数量遗传分析
手段 ,还可以对不同亲缘物种间的分类、遗传距离、系
统发育、亲缘关系等进行研究。种质亲缘关系和种质
资源多样性评价是作物育种研究的重要内容 ,它决定
这些种质在今后育种实践中的有效利用。 Sm ith
等 [ 19 ]利用 ISSR指纹分析区分葡萄座腔菌的种和相
应的渐变态真菌 ,分离的 51个代表 10个不同的葡萄
座腔菌种及相应分类单位 ,包括 2个 RAPD标记组和
一个形态特殊的松枯梢病菌 (Sphaeropsis sapinea )。
利用 ISSR引物分析 ,共产生 171条谱带 ,研究表明 ,
ISSR指纹分析可以作为区分具有相似形态或 ITS序
列的丝状真菌以及分析检测种的复杂度和验证新种
的有效工具。在真菌界 , M ycosphaerella gram inico2
la[ 20 ]、Phytophthora gryptogea[ 21 ]、M ycosphaerella f ijien2
sis等 [ 22 ]也已经进行了 ISSR分析。Gup ta等 [ 23 ]利用
松树、葡萄、马铃薯、鸡、牛、莴皑、鲑及人类 DNA进行
ISSR分析 ,证明 ISSR引物对来自复杂真核生物的基
因组 DNA能够产生多态性扩增 ,这些多态性带是可
遗传的 ,而且可以用作 DNA标记。
何予卿等 [ 24 ]利用 18个 ISSR引物对 37份稻属
种质进行分析并找到 26条在不同种或不同染色体
组型的种之间的一些特别带型。并证明中国栽培稻
起源于普通野生稻。钱韦等 [ 25 ]采用 RAPD和 ISSR
标记探讨了中国疣粒野生稻的遗传多样性。另外 ,
在鹰嘴豆 ,甘薯 [ 26 ] ,柑橘 [ 27 ]、豇豆 [ 28 ]等作物上 ,科
研工作者利用 ISSR分析进行遗传多态性及亲缘关
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生物技术通报 B iotechnology　B u lle tin 2009年第 9期
系分析并得到满意结果 ,与其它分子标记技术相比 ,
显示了其独特的优越性。
214　 ISSR标记技术辅助育种的潜力
利用分子标记辅助育种必须具备以下几个条
件 :绘制饱和的遗传图谱 ,标记间的遗传距离不得超
过 20 cM;要具备与目的基因紧密连锁的经济有效
分子标记 ;具有高效的自动化技术 ,最大限度地减少
损伤的中间环节 [ 29 ]。通过 ISSR分析可筛选出与目
标基因 (性状 )紧密连锁的 DNA片段 ,作为辅助育
种的分子标记。利用分子标记不仅可以定位目标基
因 ,也可利用与目标基因紧密连锁的分子标记追踪
目标基因。应用这些分子标记进行间接选择 ,将得
到事半功倍的效果。目前在作物上已筛选出的目标
基因有镰孢菌抗性基因 [ 30 ] ,水稻抗瘟病基因 [ 31 ]等。
方宣钧等 [ 32 ]用 ISSR标记技术获得了一个与大豆抗
SCN基因紧密连锁的 ISSR标记 ISSR811,在 F2群
体中分离情况符合 1∶3的分离比 , ISSR811与抗性
基因座位的遗传距离为 10. 2 cM。可用于大豆抗
SCN基因座位的分子标记辅助选择。对多年生果
树 ,其育种时间长 ,而且受许多条件的制约 ,而分子
标记辅助育种选择不受环境条件影响 ,分析手段快
速又简便 ,在果树上有很好的应用前景。
3　结语
综上所述 , ISSR2PCR技术是一项很成熟的分子
标记技术 ,无论从实验成本还是从实验过程及结果
上看 ,都有其独特的优越性 ,因此是一种非常好的分
子标记技术。 ISSR标记是据基因组中广泛存在的
微卫星序列设计通用引物对基因组 DNA进行 PCR
扩增 ,引物可以是微卫星基序本身或微卫星基序重
复引物 3′或 5′加上 2～4个锚定碱基。 ISSR标记是
检测中微卫星序列变异 ,由于微卫星序列不具有结
构基因的功能 ,而且重复单元的重复次数的改变对
整个生物体而言是微小的变异 ,所以在生物长期进
化过程中积累了丰富的微卫星变异 ,这就决定 ISSR
标记的较高多态性水平。 ISSR标记在具备较高多
态性水平的情况下 ,可望更好地用于基因定位研究 ,
且已初步显示了其优越性。
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