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生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2010 年第 7 期
改良 Trizol法快速提取棉叶片总 RNA
姚宁涛1 祝建波1 邓福军2
(1石河子大学生命科学学院，石河子 832000;2新疆农垦科学院棉花研究所，石河子 832000)
摘 要: 棉叶片组织中存在含量较高的棉酚、多糖等次生代谢物质，使用单纯的 Trizol很难获得高质量的 RNA。首次采
用改良 Trizol法成功从棉叶片中快速的提取了总 RNA，其所提的总 RNA完整性好、纯度高，能进一步满足分子生物学的试验
要求。
关键词: Trizol法 棉花 RNA提取
Fast Extraction of High-quality Total RNA in the Cotton Leaf with
Improved Trizol Method
Yao Ningtao1 Zhu Jianbo1 Deng Fujun2
(1College of Life Sciences Shihezi University，Shihezi 832000;
2The Research Institute of Cotton，Xinjiang Academy of Agricultural and Reclamation Science，Shihezi 832000)
Abstract: The leaves of the cotton contain polyphenol，polysaccharided and other secondary metabolites in great quantity that
making RNA diffcult to extract． The RNA samples of the cotton leaves were isolated by improved Trizol method，and the purity and
quantity of each RNA obtained was evaluated by agarose gel electrophoresis． The total RNA of the color cotton leaves extracted by
this method showed clear bands，which means the quality and purity of the RNA could meet the demands of molecular biology experi-
ment．
Key words: Trizol method Cotton RNA extraction
收稿日期:2010-02-03
基金项目:兵团科技攻关项目(2006GG03) ，兵团博士基金项目(2009JC01) ，转基因生物新品种培育重专项课题(2008ZX08011-002)
作者简介:姚宁涛，男，硕士研究生，研究方向:植物基因工程;E-mail:yaoningtao2007@ 126． com
通讯作者:邓福军，男，研究员，硕士生导师，主要从事棉花栽培育种研究;E-mail:dengf． j@ soho． com
棉花(Gossypium spp．)属锦葵科棉属，是我国的
主要经济作物之一，在国有经济中占有重要的地位。
提取完整性好、纯度高的高质量棉叶片总 RNA，是
开展棉花分子生物学方面研究的前提和基础。由于
棉花叶片组织中含有较高的棉酚、多糖等次生代谢
物质［1］，使得采用普通方法很难提取高质量的棉花
叶片总 RNA。当前，国内外的许多学者针对棉花的
RNA提取方法进行了改进，如:高离子强度、高 pH
值提取法、热 CTAB 法、异硫氢酸胍法、CTAB / 酸酚
法、热酚法和热硼酸法等［2，3］;但是这些方法有的提
取步骤比较繁琐、有的提取周期比较长;而单纯的
Trizol试剂盒法虽然提取时间短，但是提取的棉花叶
片总 RNA质量难以保证，不能满足分子生物学试验
的要求。本研究在 Trizol 试剂盒法的基础上结合
SDS法，提出一套完整可行的提取棉花叶片总 RNA
的快速简便可行的方法。
1 材料与方法
1. 1 材料
新疆农垦科学院棉花研究所垦棕 5 号和垦绿 1
号生长 10 d的棉花叶片，所用玻璃器皿，不锈钢药
品勺等均需 180℃烘烤 6 h 以上，所用的枪头、离心
管经 0. 1%的 DEPC 水浸泡 16 h 以上，然后 120℃，
灭菌 60 min，避免 RNase 的污染。
1. 2 Trizol法提取棉花叶片 RNA
Trizol法提取详细过程见其说明书。
1. 3 改良 Trizol法提取棉花叶片 RNA
1. 3. 1 提取液配制 10% SDS(W/V) ，10% PVP
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2010 年第 7 期
(W/V) ，蛋白酶 K(20 mg /mL)、二硫苏糖醇(DTT)
(10 mmol /L) ，其它试剂有氯仿∶ 异丙醇(24 ∶ 1) ;无
水乙醇;5 mol /L醋酸钾(pH5. 2)、Trizol。
1. 3. 2 提取过程 ① 称取 100 mg 的棉花幼嫩叶
片，迅速放入液氮研磨呈粉末状，转入 2 mL 无
Rnase离心管内，加入 1 mL 的 Trizol 试剂、1 mL 蛋
白酶 K、5 μL 二硫苏糖醇(DTT)和 20 μL SDS 及
20 μL PVP-40，42℃温浴并震荡 20 min。② 加入等
体积的氯仿 ∶ 异丙醇(24 ∶ 1)混匀，4 ℃，12 000 r /
min 离心 15 min。③吸上清装入新的离心管里，加
入 1 / 5 体积的 3 mol /L醋酸钾混匀后，－ 20℃静置
15 min［4］。④ 4℃，12 000 r /min离心 10 min将上清
液转入一个新的无 RNase 1. 5 mL 离心管中，加入
2. 5 体积的无水乙醇，－ 80℃静置 1 － 2 h。⑤ 4℃，
12 000 r /min 离心 15 min 弃上清液，用 70%的乙醇
洗涤。⑥4℃，12 000 r /min 离心 10 min 弃上清，抽
真空干燥后加入 20 μL 1% DEPC 水，－ 80℃保存
备用。
1. 4 总 RNA的质量检测
1. 4. 1 电泳检测 取 5 μL 提取的棉花叶片总
RNA溶液于 1%的普通琼脂糖凝胶进行电泳，EB 染
色后于紫外灯下观察 RNA的完整性(图 1)。
图 1 彩色棉叶片总 RNA 1%琼脂糖凝胶电泳结果
1. 4. 2 核蛋白仪的测定 取 1 μL 提取的棉花
叶片总 RNA 溶液在核蛋白分析仪上测定其
OD260 /OD280的值及其产量，估算 RNA 的纯度(表
1)。
1. 4. 3 RT-PCR检测 反转录反应参照 M-MLV 反
转录酶使用说明进行。PCR 扩增棉花 pH 基因，引
物根据目的基因序列设计引物。
上游引物:5-TTCGCCAAGCATCTTATTC-3
下游引物:5-AACCCTTTCCATTTCTCTACA-3
反应程序:95℃预变性 4 min;95℃变性 45 s，
47℃退火 47 s，72℃延伸 1 min 45 s，32 个循环;72℃
延伸 10 min，4℃保存。
表 1 不同方法提取的棉叶片总 RNA纯度与产量比较
垦绿 1 垦棕 5 号
OD260 /
OD280
产量
(μg /g)
OD260 /
OD280
产量
(μg /g)
Trizol法 2. 43 56. 02 2. 63 60. 053
改良 Trizol法 1. 89 435. 21 1. 97 541. 06
2 结果
2. 1 RNA的质量分析
RNA的质量检测最常用的方法就是琼脂糖凝
胶电泳和使用核酸蛋白仪测定其 OD260 /OD280的比
值。如果在琼脂糖凝胶电泳图中可以看到比较完整
的 28S rRNA 和 18S rRNA 条带，且 28S rRNA 条带
的亮度约是 18S rRNA条带亮度的 2 倍，则说明所提
取的总 RNA 质量较高。通常 OD260 /OD280值在 1. 8
－ 2. 0 之间，则说明所提取的 RNA 纯度比较高;当
比值小于 1. 7 时，说明样品中存在蛋白质或酚类等
其他有机物的污染;当比值大于 2. 2 时，说明 RNA
已经被水解成单核酸。本研究分别取垦棕垦棕 5 号
和垦绿 1 号生长 25 d的棉花叶片各 100 mg，分别提
取其总 RNA，从图 1-A可以看出，用单纯的 Trizol法
提取的棉花叶片总 RNA降解严重，电泳条带模糊不
清，说明 RNA 质量很差;而用改良 Trizol 法提取的
棉花叶片总 RNA，从电泳图 1-B 中可以看到它的
28S rRNA、18S rRNA 和 5. 8S rRNA 3 条带整齐、清
晰，很少发生降解，说明所提取的 RNA的质量较高。
从表 1 可知用改良 Trizol法提取的垦棕 5 号和垦绿
1 号棉花叶片 RNA 的浓度在 OD260 /OD280的比值分
别为 1. 97 和 1. 89，均在 1. 8 － 2. 0 的范围内，这说明
改良的方法提取的 RNA质量较高，多糖、蛋白、酚类
物质较少，很少发生降解;而且它的产量也明显高于
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2010 年第 7 期 姚宁涛等:改良 Trizol法快速提取棉叶片总 RNA
Trizol法，这也表明改良 Trizol 法在提取棉花叶片
RNA提取方面优于 Trizol法。
2. 2 RT-PCR检测结果
对用改良 Trizol 法提取棉花叶片的总 RNA 反
转录后，PCR 扩增棉花 pH 基因获得大约 1 200 bp
的特异的目的条带(图 2) ，与所需的目的基因片段
大小一致，条带清晰明亮，说明提取的 RNA 能用于
后期的分子生物学试验。
M. TianGen Marker III;1．垦绿 1 号 pH基因 PCR 扩增产
物;2．垦棕 5 号 pH基因 PCR扩增产物
图 2 彩色棉叶片总 RNA的 RT-PCR反应
产物 1%琼脂糖凝胶电泳结果
3 讨论
Trizol试剂法是当前提取各类细胞总 RNA较为
常用的方法，对于提取低酚低糖类植物总 RNA的提
取效果较好，但是使用单纯的 Trizol 试剂不能有效
地抑制棉花叶片组织中棉酚及多糖类物质的氧化，
也不能充分的去除棉酚、多糖及其他盐类物质，严重
的影响 RNA的质量［5］。
目前，对于酚类物质的去除一般采用如 Li +，
Ca2 +等沉淀、离心、苯酚 /氯仿抽提等方法去除酚类
物质，但它只能去除未被氧化的酚类物质［6］。本试
验采用二硫苏糖醇(DTT)有效抑制酚类物质的氧
化，同时还加入聚乙烯吡咯烷酮(PVP-40)使其与酚
类化合物形成鳌合物，使之不能成为多酚氧化酶的
底物而抑制酚类物质的氧化，从而达到有效去除酚
类物质，提高 RNA 的纯度的目的［7，8］。在多糖的去
除步骤中采用醋酸钾(5 mol /L)和低浓度的乙醇来
沉淀多糖［9］，这不仅可以去除多糖，而且还可以彻
底去除色素类物质。同时在 Trizol 提取液中加入蛋
白质变性剂 SDS和蛋白酶 K降解蛋白杂质，再用氯
仿∶异戊醇(24∶ 1)抽提除去残存的蛋白质。最后用
无水乙醇选择性的沉淀 RNA，达到去除其他杂质的
目的。本试验提取棉花叶片总 RNA的方法，与其他
一些方法相比具有高效、快速的特点，能够进一步满
足分子生物学的试验要求，同时，为棉花叶片 RNA
提取方法的改良优化提供一种借鉴。
参 考 文 献
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