全 文 ：综述与专论
生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2010年第 3期
微生物甲醛脱氢酶的研究进展
张婧 年洪娟 陈丽梅
(昆明理工大学生命科学与技术学院 生物工程技术研究中心,昆明 650224 )
摘 要: 甲醛脱氢酶 ( FADH )属于中等锌链醇脱氢酶家族中的一员,存在于绝大多数原核生物以及所有的真核生物中,
是微生物中主要用于甲醛解毒的酶。近年来一些研究确定甲醛脱氢酶还具有 S亚硝基谷胱甘肽还原酶 ( GSNOR)的活性,用
于调节内源性 NO的动态平衡。对微生物甲醛脱氢酶的结构, 生理生化特性,基因克隆以及在环保上的应用方面进行综述。
关键词: 微生物 甲醛脱氢酶 甲醛解毒 S亚硝基谷胱甘肽还原酶 NO调节
Research Advances on Formaldehyde Dehydrogenase
from M icroorganism s
Zhang Jing N ian Hong juan Chen L im ei
(Biotechno logy Research Center, Co llege of Lif e Science and T echno logy, K unm ing University of Science and T echnology, Kunming 650224)
Abstrac:t Fo rma ldehyde dehydrogenase ( FADH ) is am em be r of the zincconta in ingm ed ium cha in alcoho l dehydrogenase fam ily
and has been found in all eukaryo tes and m ost prokaryotes, acting as am a in enzyme for form a ldehyde de tox ifica tion in m icroo rganism s.
Recently, several researches estab lished that FADH exh ibited Snitrog lutath ione reductase ( GSNOR) activ ity to regu la te theNO homeo
stasis. This paper rev iew ed the resea rch prog resses in FADH structure, physio log ica l and biochem ical features, gene c lon ing and environ
m ent application.
Key words: M icroorgan ism Fo rm aldehyde dehydrogenase Form a ldehyde detox ification Sn itrog lutathione reductase
NO regulation
收稿日期: 20091130
基金项目:国家自然科学基金 ( 30970263) ,教育部留学回国人员科研启动基金 ( 200555) ,云南省中青年学术与技术带头人培养费 ( 2004PY015) ,
昆明理工大学人才培养费
作者简介:张婧,女,硕士,研究方向:植物代谢基因工程; Em ai:l zhangj ing0313@ 163. com
通讯作者:陈丽梅,教授, Em ai:l chen lim eikm@ 126. com
甲醛是一种能与蛋白质、核酸和脂类产生非特
异性反应的活泼化合物, 对所有的生物来说都具有
很高的毒性 [ 1]。甲醛的来源非常广泛, 为了防止甲
醛对生物体的致死及突变作用,生物体已经建立了
多种修复机制使之能在含有甲醛的环境中更好的生
存,其中甲醛氧化途径是微生物中广泛存在的一条
解毒途径 [ 2 ]。作用于这条途径的关键酶甲醛脱氢
酶 ( formaldehyde dehydrogenase, FADH, EC 1. 2. 1. 1)
是中等锌链醇脱氢酶家族中的一员, 存在于绝大多
数原核以及所有的真核生物中 [ 3] , 对于微生物的甲
醛解毒具有重要作用。近年来,越来越多的研究显
示 FADH不仅用于甲醛的解毒, 同时也与 NO代谢
具有某些联系,显示出 S亚硝基谷胱甘肽还原酶活
性 [ 4]。对微生物 FADH的结构、生理生化特性、基
因克隆以及在环保上的应用等方面的研究进展进行
综述。
1 甲醛脱氢酶的生理作用
1. 1 甲醛的解毒作用
FADH 在微生物中的一个主要作用是甲醛解
毒, 甲醛氧化途径是甲醛转化中广泛存在的酶促系
统。大部分 FADH 通常需要 NAD+ 和谷胱甘肽
( GSH )参与甲醛的氧化。恶臭假单胞菌中的甲醛
脱氢酶 ( PFADH )是目前发现的惟一一个不需要
GSH 参与即可以氧化甲醛的酶 [ 5]。NAD+ 和 GSH
依赖型 FADH 对甲醛解毒的主要过程分为以下 4
步: ( 1)在特异性甲醛运载体的作用下甲醛从胞外
2010年第 3期 张婧等:微生物甲醛脱氢酶的研究进展
运至胞内,接着与 GSH自发缩合形成 S羟甲基谷胱
甘肽 (HMGSH ); ( 2) HMGSH 在 FADH的作用下氧
化形成 S甲酰谷胱甘肽, 同时伴随着 NAD + 到
NADH的转换; ( 3) S甲酰谷胱甘肽在 S甲酰谷胱
甘肽水解酶 ( FGH )的作用下重新产生 GSH并形成
一分子甲酸; ( 4)甲酸在甲酸脱氢酶的作用下转化
为 CO2,同时伴随着一分子 NADH的形成 [ 6]。
1. 2 调节内源性 NO的动态平衡
NO在生物体内是一个涉及到许多功能的信号
分子, NO衍生的活性氮物质 ( RNS )很容易与主要
的胞内抗氧化物 GSH形成 S亚硝基谷胱甘肽 ( GS
NO )
[ 7]。GSNO生物转化是 NO代谢的主要分支,内
源的 GSNO在 NO动态平衡调节过程中是一个重要
的作用因子 [ 4]。过去 10年的一些研究已经确定
GSH依赖型 FADH 在微生物体内除了甲醛解毒之
外,还作为一个 S亚硝基谷胱甘肽还原酶 ( GSNOR)
用于内源性 NO动态平衡的调节 [ 8, 9]。GSHFADH
对 GSNO的还原机制主要分为以下步骤: 甲醛和
GSH自发形成 HMGSH, 在 GSHFADH的作用下氧
化生成 S甲酰谷胱甘肽, 这一过程伴随着 NAD+和
NADH的转换。然而 NADH并不立即与酶分离,而
是直接用于 GSNO的还原, 将 GSNO还原成中间产
物半缩硫醛 ( GSNHOH ), 在胞内氧化还原环境下
GSNHOH又被 GSH 捕获形成谷胱甘肽二硫化物
( GSSG)和羟胺 ( NH2OH ) [ 8]。
2 甲醛脱氢酶的生化特性和动力学反应
机制
2. 1 底物偏好性
很多研究都表明,不同生物来源的 GSHFADH
对长链醇如 n辛醇、GSH 加合物如 HMGSH、GSNO
等大型底物都显示出较高的活性, 而对于一些小分
子醇则只有很低或者没有活性 [ 10]。已有研究报道,
大肠杆菌的 GSH FADH 对于 HMGSH 的 Km 值为
94 mM
[ 11]
,酶活 60U /mg,等电点为 4. 4[ 12]。来源于
酿酒酵母和真菌牛樟芝的 FADH对 HMGSH 的 Km
值分别为 0. 02 mM和 1. 20 mM,而它们对 GSNO的
Km值则分别为 0. 15mM和 0. 28 mM [ 9, 13 ]。
2. 2 稳定性
来自汉逊酵母的 FADH有较好的热稳定性,相
比之下毕赤酵母 FADH的热稳定性较差, 酶活性的
最适温度为 30 [ 14]。 2009年, Huang等 [ 9]研究表
明大肠杆菌表达的真菌牛樟芝 FADH在 50 处理 5
m in后仍保留 60%的活性,在碱性 pH 7. 8- 11. 2之
间都是稳定的, 对 SDS敏感, 但对胰蛋白酶以及胰
凝乳蛋白酶都具有一定的抗性。
2. 3 动力学反应机制
FADH的反应遵循一个随机乒乓动力学机制,
在随机乒乓动力学作用过程中会产生一个还原性和
氧化性的初期复合体。反应过程中辅酶的结合使得
酶的催化结构域对辅酶 结合结构域有一个 10度的
旋转,活性位点变得更加狭窄,使酶在结合小分子底
物中达到一个最佳的位置 [ 10]。
3 甲醛脱氢酶的结构
SDSPAGE分析发现 FADH的亚基分子量大小
都在 40 kD左右, 凝胶过滤层析显示出存在有二聚
体和四聚体两种情况。研究发现大肠杆菌以及球形
红细菌中的甲醛脱氢酶通常为二聚体蛋白, 而恶臭
假单胞菌、脱氮副球菌、酵母菌以及硫磺矿硫化叶菌
则为四聚体形式 [ 3, 12, 15- 17]。GSH 依赖型 FADH 无
论是二聚体还是四聚体其单体结构基本相似, 而
GSH非依赖型 FADH则有着不同的结构。
3. 1 谷胱甘肽 依赖型甲醛脱氢酶
谷胱甘肽依赖型的 FADH通常与 NAD+组成一
个双元复合体,蛋白质由两个不对称亚基组成,每个
亚基都包含两个共价结合锌原子。每个不对称亚基
又分为两个亚单位,这两个亚单位都显示出一个半
开放的催化结构。X射线晶体学显示 FADH 蛋白
折叠构象与 class!型醇脱氢酶相似, 辅酶结合在中
央裂缝,裂缝将蛋白亚基分为两个结构域:辅酶结构
域以及催化结构域;辅酶结构域由残基 178- 323号
组成,催化结构域则为 3 - 177以及 324- 374号残
基。研究显示由 G lu68残基引起的催化锌原子之间
相互作用为酶蛋白的催化锌原子提供了一个催化微
环境,而 H is47残基则可能起着质子传递中的一个
接触部位以及结合 NAD (H )中腺苷酸的功能 [ 18]。
3. 2 谷胱甘肽 非依赖型甲醛脱氢酶
Ito等纯化得到了不依赖谷胱甘肽的 FADH
( PFADH ),活化形式的 PFADH是由一个相同亚基
组成的同型四聚体, 每个亚基由 398个氨基酸残基
组成,其相对分子量大约为 42 kD。X射线晶体衍
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生物技术通报 B iotechnology Bulletin 2010年第 3期
射发现, PFADH亚基由两部分组成, 一个结构域与
底物结合,另一个结构域则与辅因子结合。催化结
构域是由 231个氨基酸残基即 1- 170和 338- 398
组成, 多肽链两个末端 ( N端 Ser1和 C端 A la398)呈
无规则结构状态。其核心主要是由 折叠组成, 5
个 螺旋分布在 折叠结构外围的分子表面。结
构分析证实每个亚基都含有两个与催化结构域配基
牢固结合的锌离子, 辅因子结合结构域由氨基酸残
基 171- 337组成 [ 19]。
4 甲醛脱氢酶的基因克隆和表达调控
4. 1 FADH的基因克隆
目前为止,已有很多微生物的 FADH 基因被克
隆出来。Shen等 [ 14 ]从巴斯德毕赤酵母 (P ichia pas
toris)中克隆了 GSH 依赖型 FADH基因 FLD1, 该基
因包含一个带有酵母近 5∀端拼接信号的小内含子,
推测编码产物是一个大约 40 kD的蛋白,由 379个
氨基酸组成。其序列与正烷烃同化酵母 (Cand ida
maltosa)的 FLD蛋白序列具有 71%的相似性, 与人
类和其他高等真核生物的 III型醇脱氢酶具有 61%
- 65% 的相似性。汉逊酵母 (H ansenula po lymor
pha )中的 FLD基因与 P. pastoris的不同之处是不含
有内含子,推测其产物是一个由 380个氨基酸组成
的 41 kD蛋白 [ 20]。 Lee等 [ 21 ]从博伊丁假丝酵母
(Cand ida bo id in ii )基因组文库中克隆了 FADH基因
FLD1,基因长 1 263 bp,包含一个 123 bp的内含子,
外显子编码一个 380个氨基酸的基因产物, 推测的
氨基酸序列与其他来源的 FLDs序列具有高度相似
性。K idd等 [ 22] 从流感嗜血杆菌 (H aemophilus inf
uenzae )中克隆了具有 FADH和 GSNO还原酶活性
的编码基因 adhC, 它以 adhCestD操纵子形式存在。
此外, 红假单胞菌中的 GSH FADH编码基因 adhI已
经作为操纵子 adhIcycI( cycI为细胞色素 c2编码基
因 )的一部分被鉴定, 基因片段长 1 128 bp, 编码一
个由 376个氨基酸组成的 42 kD大小同型二聚
体 [ 3]。 Ito等 [ 23 ]根据纯化到的不依赖谷胱甘肽的
PFADH的 N 端氨基酸序列设计引物, 从恶臭假单
胞菌中扩增到 485 bp片段作为探针,从基因组文库
中筛选得到 1 197 bp的甲醛脱氢酶编码基因, 转化
大肠杆菌 E. coli DH5后发现其甲醛脱氢酶活性要
比 P. putida增加了 50倍。
4. 2 FADH基因的表达调控
FADH编码基因的转录能被甲醛代谢过程中积
累的中间物以及途径中产生还原力带来的信号分子
激活。研究发现, 大肠杆菌和流感嗜血杆菌在甲醛
浓度为 0. 6- 20 ppm 时能诱导 FADH酶活性的产
生 [ 11] ; 同时在革兰氏阴性菌脱氮副球菌中也发现,
当其生长底物为一碳化合物时能诱导 FADH 酶活
性的产生, 而底物为甲醇、甲酸时则不能 [ 3] , 说明
FADH是可诱导的。
W illiam等 [ 11]通过对大肠杆菌 GSHFADH进行
利福平 (抑制 RNA的合成 )和氯霉素 (抑制蛋白合
成 )处理发现它们都能抑制 FADH 的产生, 说明这
个酶是转录水平调控的。Baber等 [ 24 ]对红假单胞菌
中的 GSHFADH编码基因 adhI转录激活信号进行
鉴定发现, 光合应答调控子 PrrA以及反式作用因
子 spd7的突变都会增强其基因的表达, 此外, 启动
子上游 55 bp序列对甲醛, P rrA以及 spd7引起的激
活是必须的。
5 甲醛脱氢酶的应用
5. 1 甲醛浓度的检测
随着生活水平的提高和环保意识的增强, 人们
越来越关注甲醛在环境中的存在。国内外建立许多
检测空气中甲醛含量的方法,如分光光度计法、气相
层析、高效液相层析和极谱法等, 但对甲醛的酶法检
测研究却很少。利用甲醛脱氢酶的催化特性进行甲
醛的酶法检测,不仅费用低而且操作简单,适合于工
作场合的日常使用。例如, V ianello等 [ 25]把甲醛脱
氢酶偶合在场效应晶体管上, 通过离子场效应敏感
晶体管检测空气中甲醛的含量, 其检测限可以达到
0. 1 g /mL,远低于职业接触的临界值。
5. 2 CO 2的循环再利用
CO2的固定和再利用一直是人们关注和亟待解
决的问题,由于甲醇是人类重要的化工原料和洁净燃
料,因此将 CO 2转化为甲醇是一条具有重要研究价值
和应用前景的途径。CO2转化为甲醇的酶催化过程
中需要有甲醛脱氢酶以及另外两个关键酶 (甲酸脱氢
酶、乙醇脱氢酶 )的参与。姜忠义等 [ 26]利用溶胶凝
胶对这 3个酶进行包埋共固定化,以 NADH为电子供
体,在低温低压下将 CO2转化为甲醇, 结果表明在
37 , pH7. 0的条件下,甲醇的收率可达到 92. 4%。
52
2010年第 3期 张婧等:微生物甲醛脱氢酶的研究进展
6 结论和展望
甲醛脱氢酶存在于绝大多数原核和所有的真核
生物中,不同来源的甲醛脱氢酶显示出高度的序列
相似性,甲醛脱氢酶的保守存在表明了其在生物体
中的重要作用。甲醛脱氢酶作用的甲醛氧化途径是
生物体中广泛存在的解毒系统。现如今甲醛是室内
空气污染的主要成份之一, 用物理吸附法及化学药
剂消除法治理甲醛污染存在效果不明显或是产生新
的室内空气污染等,而用酶法来治理室内甲醛污染,
具有经济、环保、不产生二次污染等优点。高温菌微
生物来源的甲醛脱氢酶稳定性较好,适合工业化生产
和应用, 但由于微生物体内该酶的表达水平通常较
低,难以纯化,将其基因转入基因工程菌中, 则可实现
大量表达,纯化后固定到某种合适基质上, 可成为一
种较有应用前景的治理室内甲醛污染的环保产品。
参 考 文 献
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