全 文 ：生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN·综述与专论· 2008年第5期
收稿日期:2008-04-08
基金项目:云南省自然科学基金资助项目(2007C038M);云南省国际合作项目(2006GH07)
作者简介:房恩贞(1983-),女,硕士,研究方向:分子病毒学;Tel:0871-3802271,E-mail:fangenzhen2002@yahoo.com.cn
通讯作者:夏雪山,Tel:0871-3802271,E-mail:oliverxia2000@yahoo.com.cn)
丙型肝炎病毒(HepatitisCvirus,HCV)为单股
正链 RNA病毒,是引起输血后非甲非乙型肝炎的
主要病原体。目前全世界约有 1.7~2.0亿 HCV感染
者,约占全球总人口的 3%,每年新增感染者约为
350万人。在我国,HCV自然感染率为 2.5%~4.9%,
感染总人数超过 5000万人,属 HCV的中高度感
染区。HCV一经感染即高度慢性化,约有 85%以上
的急性感染者由于不能有效地清除病毒而发展为
慢性,其中 20%的 HCV慢性感染者进一步发展为
肝硬化,另有 1%~5%的慢性感染者最终发展为肝
细胞癌[1]。由于缺乏高效稳定的 HCV体外培养体系
和实验动物模型等关键试验手段,使得针对 HCV
特异性药物的研制和疫苗的开发等相关工作进
展缓慢。到目前为止,尚无可以治愈丙型肝炎药
物和预防性疫苗问世。因此,丙型肝炎已成为继
艾滋病之后的又一大严重危害人类健康的传染
病。
1 HCV基因变异和免疫逃逸
1.1 HCV变异
HCVRNA编码的 RNA聚合酶缺乏 3-5核酸
外切酶校正功能,致使其基因组发生突变的频率较
高,从而更容易逃避机体的免疫识别或者抑制宿主
的免疫反应,表现出比率极高的病毒持续性感染。
根据 HCV基因组 5NCR、C、NS5B区的核苷酸序列
的同源性,可将 HCV分为 6个主要基因型,每个型
又可分为若干亚型,不同基因型的全基因组序列差
异达 30%以上,氨基酸序列差异可达 25%~30%[2]。
病毒变异小于 5%的突变株集合称为准种,HCV准
丙型肝炎病毒基因突变与免疫逃逸
房恩贞 夏雪山
(昆明理工大学生命科学与技术学院,昆明 650224)
摘 要: 免疫逃逸(Immuneevasion)是指病原体逃避机体免疫监控的现象。在宿主和病毒的长期共同进化过程
中,病毒形成了各种逃逸机制以逃避宿主的免疫监控,其中病毒基因变异是最主要机制。丙型肝炎病毒(HepatitisC
virus,HCV)在感染个体中表现出极高的基因异质性,能有效地逃逸机体免疫识别和破坏宿主免疫应答的能力,HCV还可
侵袭免疫细胞来抑制机体的免疫功能,而建立HCV持续性感染。了解HCV病毒突变与免疫逃逸机制将会为预防和控制
丙型肝炎提供依据。
关键词: 丙型肝炎病毒 基因变异 免疫逃逸 抗原决定位点
GeneMutationofHepatitisCVirusandImmuneEscape
FangEnzhen XiaXueshan
(ColegeofLifeScienceandTechnology,KunmingUniversityofScienceandTechnology,Kunming650224)
Abstract: Immuneevasionmeansthatpathogenevadesbodyimmunesurveilance.Virusgenemutationisakind
ofimmuneescape,bywhichviruscanescapeimmuneresponsefrom hostsincethelongterm co-evolutionofhostand
virus.HepatitisC virus(HCV)showshighgeneticheterogeneityinvivo,sothatitcanescapeimmunerecognitionand
undermineimmuneresponsefrom host.Also,HCVcanestablishpersistentinfectionbyinvadingimmunecelstoinhibit
bodyimmunefunction.Therefore,itiscrucialtounderstandthemechanism ofgenemutationandimmuneescape,thus
beingabletopreventandcontrolHCVinfection.
Keywords: HepatitisCvirusVariation Immuneescape Epitope
生物技术通报Biotechnology Buletin 2008年第5期
种特性实质上是其进化的一种生存优势,病毒最大
限度地“制造”自己的变异序列,这些序列中可能包
括了潜在有用的变异体,如能逃避 CTL攻击和诱
导免疫耐受的突变体。当宿主环境改变后,病毒可
以作出快速的反应,从而保证其在宿主体内的生
存。准种的进化依赖着选择压力(如抗病毒药物和
免疫应答引起的压力)、变异导致的复制适应性以
及是否有未感染的肝细胞为具有更强适应性的变
异株提供复制空间。基因的高变异性导致病毒在患
者体内以多个高度相关的病毒变异体存在,并呈递
出众多不同的抗原位点,尤其中和抗体和效应性 T
细胞抗原表位的改变,致使机体免疫识别能力减
弱,最终导致 HCV逃避宿主免疫反应,造成 HCV
的持续感染。
近两年来,随着以重组病毒载体为基础的
HCV假病毒模型和 HCV细胞培养体系的建立,以
及组织相容性抗原-肽四聚体流式细胞技术和噬菌
体肽库技术的成功运用,HCV抗原表位变异和相
关免疫逃逸机制已成为研究热点。
1.2 体液免疫逃逸
HCV包膜糖蛋白对于宿主产生体液免疫反应
很重要,因为宿主首先接触的就是包膜蛋白,宿主
的保护性免疫常依赖于针对病毒表面的抗体,该抗
体能阻断病毒和敏感性细胞结合,并通过加强细胞
免疫清除病毒。HCV感染时,E2蛋白能诱导机体产
生中和抗体,重要靶位点是其 N-末端的约 27个残
基高变区-HVR1[3]。HVR1含有数个线形表位和一个
部分构象限制性表位,其高度变异性产生相当多的
次要克隆是 HCV对宿主免疫系统设下的“假目标”
(decoy),诱导宿主产生大量的抗变异包膜蛋白抗
体,并使 “优势”克隆易于逃脱中和作用。此外,
HVR1还可能通过模拟免疫球蛋白 IgG可变区的结
构,伪装成宿主自身抗原,而达到逃避体液免疫识
别的目的[4]。但是,缺失 HVR1的重组 HCV病毒同
样具有感染性,并且仍然可以在黑猩猩模型上造成
持续性感染,只是其毒力明显减弱,且子代病毒在
继发传染中再不能建立慢性感染[5]。这些结果连同
针对自然 HCV感染产生的抗体反应动力学研究不
难发现,HVR1在 HCV包膜蛋白介导的病毒侵入过
程中发挥了重要作用,但并非是必须的,即在 El/
E2蛋白上可能还存在其他的中和表位,尤其是与
宿主细胞受体结合的部位,需要进一步试验研究证
明。
最近 Myriam[6]等研究来自 17个 HCV感染者的
391条 E2序列发现,在 E2包膜糖蛋白区除了
HVR1和 HVR2,还存在另一个高变区,命名为
HVR3(残基 431~466)。遗传距离分析,该区可分为
3个子域:HVR3a,HVR3b,HVR3c,这 3个区域是
E2结构上靠近的簇,在连接 HCV表面受体发挥潜
在作用。通过对该区进一步研究,HVR3区抗原部
分主要在 HVR3a(残基 431~449)。大部分 HVR3,包
括 HVR3a的 C-末端暴露于 E2蛋白的表面,能够
被抗体靠近识别。同义和非同义核苷酸替换确定
HVR3区同样受宿主免疫选择压力,而且对 HVR3a
的选择压力大小仅次于 HVR1,但是 HVR3b几乎不
受宿主的选择压力。由此提示人们,对于体液免疫
逃逸的中和位点的研究不应该只局限于 HVR1和
HVR2,HVR3也同样具有重要的生物学功能,而对
其保守性中和表位及免疫特异性研究将是接下来
的研究热潮。
1.3 细胞免疫逃逸
细胞毒性 T细胞 (CTL)通过杀伤胞内寄生病
原体(病毒、某些包内寄生菌等)的宿主细胞,发挥
彻底清除和控制病毒的慢性感染作用。CTL多为
CD8+T细胞,可识别 MHC-I类分子递呈的抗原表
位;约 10%的 CTL为 CD4+T细胞,可识别 MHC-Ⅱ
类分子递呈的抗原表位。当这些 T淋巴细胞表位在
免疫系统或药物等选择压力作用下产生变异的时
候,新的肽段或者不能与宿主 MHC分子结合,或者
结合了也不被 T淋巴细胞识别,病毒突变株就可能
逃避 CTL的作用。
HCVC区、E区、NS2和 NS3都含有 CTL抗原表
位,这些蛋白的CTL位点均呈现出较强的变异性[7]。
在自限性 HCV急性感染个体中,T细胞抗原表位
没有变异,能够诱导机体产生持续而强烈的针对此
表位的特异性 CTL效应;而在持续病毒血症的个体
中发现 60%的抗原决定位点发生了替换[8],虽然也
可以检测到针对这些抗原表位的细胞毒淋巴细胞,
但其特异性的 CTL效应作用较小,并不能有效清除
感染细胞。在慢性 HCV感染的黑猩猩也发现了相
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似情况,由于其 NS3区的 1个 CTL表位中 1个氨
基酸 D突变为 E而导致 CTL不能杀伤表达突变 T
细胞表位的靶细胞[9]。病毒至少有 2种机制逃避细
胞免疫监控,一些通过 CTL表位变异达到逃避特
异性 CTL细胞识别;另一些变异株则能与 MHC-I
类分子结合,形成 T细胞受体(CTR)拮抗剂,抑制
特异性 CTL细胞反应[10]。然而,所有这些特异性
HLA-A2限制性的 CTL细胞与众多变异病毒存在
相对单一性,它们具有相同的 T细胞受体(CTR)。
在 2例 12年的丙型肝炎患者中同样发现了位于
NS4区的 CTL表位中氨基酸残基的改变[11]。CTL识
别抗原位点的突变使病毒株能暂时避开 CTL作
用,繁殖优势株的存在和有限的特异性 T细胞库,
造成了 HCV感染的慢性化。
HCVCTL抗原表位研究方法的发展较大促进
了 CTL免疫逃逸机制的研究。用重组牛痘病毒
(rVV)和合成肽的新型筛选方法建立的 HCV特异
性 CTL反应,确定了 HCV特异性 CTL抗原决定位
点,并以此确定病毒蛋白需要被蛋白酶降解成合适
的小肽,最佳长度是 8-mer后才能被分离的 CTL很
好的识别[12]。降解过程依赖于病毒蛋白特异的氨基
酸序列,如果侧翼基因发生突变,导致抗原无法正
确的加工,也可能致使抗原表位无法识别,这在
Ulrike等[13]对 NS3区域(AA1073-1081)研究中得以
验证。他们发现在该表位侧翼区(AA1082)单个氨
基酸替换改变了蛋白酶体特异切割位点,导致病毒
蛋白不能被蛋白酶降解成被 MHC-I类分子呈递的
正确小肽,从而影响了 CTL的识别,实现免疫逃
逸。
鉴于 HCV感染的最初 CTL反应是多克隆、多
特异性的,单个位点的改变只能一定程度上引起逃
逸突变。因此,这些表位突变在 HCV持续感染发生
与发展中的作用较为复杂,确切的逃逸机制仍有待
进一步研究。
2 HCV病毒蛋白对机体免疫细胞功能的影响
HCV感染后宿主免疫压力下,病毒中和抗体
识别抗原表位和 CTL抗原表位变异并不能完全解
释 HCV慢性化率为何如此之高。HCV还可侵袭免
疫细胞来抑制机体的免疫功能,这可能也是 HCV
感染宿主持续性的另一主要原因。
2.1 B细胞的免疫损伤
HCVE2包膜蛋白与 B细胞膜 CD81分了结
合,致使 CD8l与膜上相关的 CD19、CR2、MHCⅡ类
分子等形成复合物,降低抗体产所需的抗原阈,使
B细胞反性增高,导致产生冷球蛋白的优势 B细胞
克隆形成,生成大量具有 Rf活性的 IgM,这被认为
是 HCV感染致混合型冷球蛋白血症 (mixedcryo-
globulinemia,MC)的可能发病机制[14]。在 MC确诊数
年后部分患者可能发展至 B细胞淋巴瘤。B细胞受
体作为可溶性免疫球蛋白可与 HCV-E2外膜糖蛋
白紧密结合,HCV抗原所诱导产生的多克隆 B细
胞淋巴组织增生是肿瘤发生的初始阶段,随着时间
的推移将导致细胞分化、肿瘤形成。
2.2 NK细胞功能的损伤
自然杀伤细胞(NK)是参与免疫监视和早期抗
感染的重要效应细胞,同时也是一类重要的免疫调
节细胞。而 E2与 CD81分子的结合可抑制 NK细胞
的活性,如细胞因子的产生、细胞毒作用、细胞的增
殖与分化等;可阻断 NK细胞介导的非 MHC限制
性细胞毒作用;可导致 NK细胞干扰素-γ的产生减
少,导致干扰素-γ早期的抑制作用降低,从而改变
宿主的防御功能和先天免疫功能[15]。
2.3 树突状细胞功能的损伤
树突状细胞(dendriticcels,DC)一方面作为体
内一种功能强大的专职抗原呈递细胞(APC),是机
体免疫应答的启动者;另一方面可以分泌多种细胞
因子(如 IL-1、IL-6、IL-8、IL-12、TNF-"、IFN-" 及 CM-
CSF等),调节免疫细胞分化、发育、活化及移行等,
间接发挥清除病毒、抑制复制的功能。慢性丙型肝
炎患者存在的单核细胞衍生树突细胞的成熟缺陷,
是HCV特异性CD8+T细胞缺少的原因之一[16]。HCV
感染者外周血骨髓源性 DC、浆细胞源性 DC及 DC
前体均比正常人群有显著下降,且前两者刺激 CD4+
T细胞的作用降低,分泌 IL-12p70和 IFN-" 的水
平也减少。同时该 DC细胞刺激 Th1反应的功能降
低,但初始化了更多分泌 IL-10的细胞。HCV不但
可以直接作用于 DC细胞,还可以通过干扰 DC分
化的多个环节,使患者体内 DC数量下降,成熟受
限,功能发生障碍,从而影响机体免疫应答水平,造
成持续性感染。
房恩贞等:丙型肝炎病毒基因突变与免疫逃逸
(下转第59页)
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2008年第5期
(上接第47页)
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3 结语
HCV一旦突破机体的天然防御屏障导致感
染,机体即可产生相应的免疫反应,但几乎针对免
疫应答的每一步骤,HCV病毒都发展了相应的免
疫逃逸机制以确保自身的存活,这种病毒突变是
HCV慢性感染化、药物治疗不反应和疫苗研究困
难重重的根本原因。建立在已经成熟的实验技术的
基础上,包括对 HCV基因型测定技术及 HCV多样
性分析技术等,利用理想动物模型和体外细胞培养
体系的逐渐成熟,深入研究不同选择压力下变异引
起的免疫逃逸机制,明确免疫逃逸和 HCV病程的
相关性,最终建立有效控制 HCV感染的措施。
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