全 文 ：V o l. 29, N o. 3
pp. 360—363　M ay, 2003
作　物　学　报
A CTA A GRONOM ICA S IN ICA
第 29 卷 第 3 期
2003 年 5 月　360—363 页
丙型肝炎病毒融合抗原基因N S3CE 对番茄的遗传转化Ξ
李轶女　张中林　苏　宁　孙　萌　倪丕冲　沈桂芳
(中国农业科学院生物技术研究所, 北京　100081)
摘　要　丙型肝炎病毒是危害人类健康重要的病源之一, 研制安全、经济、有效和易于推广使用的抗病毒疫苗是预防和
控制HCV 的有效手段。本实验用 PCR 方法克隆了HCV 中能够产生中和性抗体、具有很好免疫原性的非结构N S 3 区基
因片段及核心抗原CE 基因片段, 并在两段基因之间加入连接肽 SPGS 的密码子序列, 构建成融合抗原基因N S 32CE。将
该融合基因连接到载体pB I121 上, 构建植物表达载体pB IN S3CE。通过根癌农杆菌 EHA 105 介导获得转基因番茄。并进
行了 PCR 扩增、Sou thern 杂交及 R T 2PCR 等分子检测, 结果证明外源基因已整合到转基因番茄的基因组中, 并在转录
水平得到表达。
关键词　丙型肝炎病毒; 融合抗原基因; 转基因番茄
中图分类号: S532　　　文献标识码: A
Tran sforma tion of Hepa tit is C V irus Ch im er ic N S3CE Genes in to Toma to
L I Y i2N ü　ZHAN G Zhong2L in　SU N ing　SUN M eng　N I P i2Chong　SH EN Gu i2Fang
(B iotechnology R esearch Institu te, Ch inese A cad emy of A g ricu ltu ral S ciences, B eij ing 100081, Ch ina)
Abstract　H epat it is C virus (HCV ) is one of the mo st w idesp read viral disease infected hum an health. P re2
ven t ion and contro l of hepat it is C by using safe, econom ical and universal vaccinat ion is h igh ly effect ive. A s
the target genes N S 3 and CE w ere ob tained by PCR amp lificat ion. T he 5’ term inal of CE cDNA fragm ent
w as linked up w ith the 3’ term inal of N S 3 cDNA fragm ent by a o ligonucleo t ide linker SPGS to fo rm a
ch im eric gene N S 3CE ( 210kb ). T he ch im eric gene N S 3CE w as recom bined w ith the exp ression vecto r
pB I121, and constructed a p lan t exp ression vecto r2pB IN S3CE. L eaf disk s w ere cu t from sterilized leaves of
‘Zhongshu 5’(L y cop ersicon escu len tum ) , inocu lated w ith A g robacterium tum ef aciens EHA 105 contain ing
N S 3CE. P lan ts w ere regenerated on select ive m edia w ith Kanam ysin. T he p resence of the N S 3CE gene w as
confirm ed by PCR and Southern b lo t in p lan ts surviving sect ions. R T PCR resu lts show ed that N S 3CE gene
has been exp ressed at the transcrip t ion level.
Key words　H epat it is C virus; Ch im eric an t igen gene; T ransgen ic tom ato
　　丙型肝炎病毒(H epat it is C viru s, HCV )是危害
人类健康重要的病源之一。研制安全、经济、有效和易
于推广的抗病毒疫苗是预防和控制 HCV 的有效手
段。自从Choo 等 (1989) [ 1 ]成功地获得了第一个丙型
肝炎病毒的 cDNA 克隆以来, 丙肝的分子生物学研
究得到飞速发展。来自世界各地HCV 分离株全部和
部分基因组序列相继报道, 1990 年日本和美国分别
报告了H CV 基因组全序列[ 2, 3 ] , 中国人H CV 基因组
的一级结构也于 1992 年进行了全序列的测定[ 4 ]。
传统的医用疫苗是灭活病原体疫苗, 减毒活疫
苗等。现代生物技术的飞速发展, 使苗研究领域变得
异常活跃, 转基因植物基因工程疫苗, 以其独具的可
食性特色, 展示了其诱人的研究与开发价值和广阔
的应用前景。目前, 转基因植物疫苗的研究报道主要
集中在少数植物上, 由于烟草含有毒的生物碱, 马铃
薯不适合人类生食, 因此, 开发和利用人类喜欢的、Ξ基金项目: 农业部“948”项目资助 (991020)。
作者简介: 李轶女 (19722) , 女, 硕士, 助理研究员, 研究方向: 生物化学与分子生物学。
Received (收稿日期) : 2002205221, A ccep ted (接受日期) : 2002210215.

图 1　植物表达载体 pB IN S3CE 的结构图
F ig. 1　Schem atic diagram of p lan t transfo rm ation vecto r pB IN S3CE
可生食的植物种如番茄、香蕉等转化体系, 成为研制
人用转基因植物疫苗的一个热点[ 5, 6 ]。本研究采用
PCR 方法克隆了丙型肝炎病毒非结构蛋白N S 3 基
因片段及核心抗原 CE 基因片段, 构建含有融合抗
原基因 N S 32CE 的植物表达载体, 期望获得表达
HCV 抗原基因的转基因番茄。
1　材料与方法
111　菌株和质粒
大肠杆菌 (E scherich ia coli) 菌株DH 5Α、根癌农
杆菌菌株 EHA 105、质粒 pB I121、质粒 pB luescrip t2
SK (M 13)由本实验室保存; 质粒 pGEM 2CE (克隆有
HCV CE 基因)、质粒 pET 2C33c (克隆有HCV N S 3
基因) 由中国科学院上海生物化学研究所吴祥甫教
授惠赠。
112　植物材料
番茄 (L y cop ersicon escu llen tum ) 种子“中蔬 5
号”, 购自中国农业科学院蔬菜花卉研究所。
113　试剂和工具酶
各种限制性内切酶、K lenow 酶、T aq DNA
po lym erase、T 4 DNA ligase、T 4 DNA po lym erase、
探针标记试剂盒 P rim e2a2GeneR L abeling System
等均购自美国 P rom ega 公司; A dvan tage PCR Pu re
K it、DNA 回收试剂盒购自美国 C lon tech 公司;
TR Izo l、R T 2PCR 试剂盒购自美国 GibcoBRL 公司;
同位素[Α232P ]dA T P 购自北京亚辉公司; 硝酸纤维
素膜 H ybond2N 购自美国Am ersham 公司; 其他各
种试剂均为进口或国产分析纯试剂。
114　目的基因的获得
根据已发表的丙型肝炎病毒基因组序列设计如
下引物:
引物 1: 5’2TA TCTA GA CCA T G CCGGCT GCA TA T GC23’
X ba I　K oz ak 序列 (利于真核表达)
引物 2: 5’2A CggatcctgggctGAAA TCGA CT GT23’
B am H É
引物 3: 5’2A CGGA TCCA T GA GCA CGAA TCCT23’
B am H É
引物 4: 5’2TA GA GCTCAA GCT T CAA CT GCCG23’
S ac I H ind Ë
注: 引物由上海生工公司合成, 小写部分为连接
肽 SPGS 的密码子序列。
用引物 3 和 4, 以质粒 pGEM 2GE 为模板, PCR
扩增H CV 基因CE 区; 用引物 1 和 2, 以质粒 pET 2
C33c 为模板, PCR 扩增H CV 基因N S 3 区。PCR 仪
为美国 PE 公司DNA T herm al Cycler480, 采用标
准 PCR 程序。
115　植物表达载体的构建及农杆菌的转化　　参
照 Sam b rook 等分子克隆方法[ 7 ] , 构建植物表达载
体 pB IN S3CE。三亲株杂交法转化根癌农杆菌
EHA 105[ 8 ]。
116　番茄的转化及再生
采用农杆菌介导的叶圆盘法转化番茄并再生植
株[ 9 ]。
117　转基因植株的 PCR 检测
参照文献[10 ]提取番茄基因组DNA , 以其作为
模板, 进行 PCR 扩增。
118　转基因番茄的 Southern 杂交分析
随机引物法制备 Α232 P 标记的 DNA 探针,
Sou thern 杂交分析按照文献[ 7 ]的方法。
119　转基因番茄的 RT-PCR 分析
采用 TR Izo l 提取转基因番茄的总 RNA 为模
板, 利用美国 GibcoBRL 公司的 R T 2PCR 试剂盒及
其产品说明合成 cDNA 的第一链, 再以此合成链为
模板, 进行 PCR 扩增。
2　结果与分析
211　目的基因的获得及表达载体 pB INS3CE 的构建
用引物 3 和 4, 以质粒 pGEM 2CE 为模板, PCR
扩增出H CV 基因CE 区约 113kb 片段, 经B am H I、
S ac I 双酶切后, 插入到pB I121 的B am H I 与S ac I 之
间, 构建成表达载体 pB ICE。用引物 1 和 2, 以质粒
pET 2C33c 为模板, PCR 扩增出 H CV 基因N S 3 区
约 017kb 片段, 经B am H I、X ba I 双酶切后, 将其插
入到 pB ICE 的B am H I与 X ba I 之间, 构建成完整的
融合基因表达载体 pB IN S3CE, 其中N S 3 与 CE 基
因之间以连接肽 SPGS 的密码子相连 (图 1)。
163　3 期 李轶女等: 丙型肝炎病毒融合抗原基因N S 3CE 对番茄的遗传转化

212　转基因番茄的获得及其 PCR 检测
采用冻融法将表达载体转入农杆菌中, 叶盘法
转化番茄子叶或下胚轴, 将其放至含 50m göL 卡那
霉素的分化培养基上, 约 4 周后有绿色愈伤组织长
出, 继代培养 4～ 6 周后, 分化出绿色芽, 而对照组在
附加 50m göL 卡那霉素的选择培养基上即被完全抑
制, 没有明显的愈伤组织和不定芽分化, 4 周后, 颜
色逐渐变黄, 最后死亡。将分化的绿色芽转到含
100m göL 卡那毒素的生根培养基中培养, 提高选择
抗性有效地防止了假阳性的发生。本实验共获得 45
株再生番茄, 以再生番茄基因组DNA 为模板, 用引
物 1, 2、3, 4 和 1, 4, 分别进行 PCR 扩增, 结果 42 株
再生番茄扩增出了相应的特异条带, 其余 3 株以及
对照则无特异条带。扩增出的特异条带大小与预期
相符, 可初步确定外源基因N S 3CE 已转入转基因
番茄基因组DNA 中。 (图 2)
图 2　转基因番茄的 PCR 检测
F ig. 2　PCR analysis of transgenic tom atoes
1. ΚDNA E coR I2H ind IIIM arker; 2, 3. PCR p roducts of to tal
DNA of transgenic tom atoes N o. 122 (N S 3) ; 5, 6. PCR p rod2
ucts of to tal DNA of transgenic tom atoes N o. 122 (CE ) ; 8, 9.
PCR p roducts of to tal DNA of transgenic tom atoes N o. 122
(N S 3CE ) ; 4, 7, 10. CK (untransfo rm ed tom atoes)
213　转基因番茄的 PCR 和基因组酶切 Southern
杂交检测
用 X ba IöH ind III 双酶切质粒 pB IN S3CE, 电泳
回收 210kb 的N S 3CE 基因, 用 [ Α232P ]dA T P 进行
标记。
提取番茄转化子基因组DNA , 分别用H ind III、
X ba IöH ind III 酶切过夜, 凝胶电泳后, 转膜, 以标记
的N S 3CE 基因为探针, 进行 Sou thern 杂交检测,
杂交结果如图 3。PCR 产物杂交后看到的条带大小
与预期结果相同, 分别为 017kb、113kb 和 210kb。转
化子基因组 DNA 经 H ind III 单酶切后可看到
218kb 的杂交条带; 转化子基因组DNA 经 X ba Iö
H ind III 双酶切后可看到 210kb 的外源基因的杂交
条带, 与预期结果相一致。这说明外源基因N S 3CE
已整合到转基因番茄基因组DNA 中。
214　转基因番茄总 RNA 的 RT-PCR 结果
提取转基因番茄的总 RNA , 以反转录合成
图 3　以N S 3CE 为探针的转基因番茄的 Southern 杂交
F ig. 3　Southern b lo tt ing analysis of transgenic
tom atoes p robed w ith N S 3CE
1. ΚDNA E coR I2H ind III M arker; 2. PCR p roducts of trans2
genic tom atoes (N S 3) ; 3. PCR p roducts of transgenic tom atoes
(CE ) ; 4. PCR p roducts of transgenic tom atoes (N S 3CE ) ; 5.
po sit ive contro l; 6. negative contro l; 7. transfo rm ant DNA ö
H ind III; 8. transfo rm ant DNA öX ba I+ H ind III
cDNA 的第一链为模板, 用引物 1, 2、3, 4 和 1, 4, 分
别 PCR 扩增 N S 3 (约 017kb )、CE (约 113kb ) 和
N S 3CE (约 210kb) ; 并用提取的总 RNA 为模板,
PCR 扩增作为对照。电泳结果显示, 对照组均无条
带, 这样就排除了DNA 污染的可能性; R T 2PCR 分
别扩增出与预期结果大小相符的片段, 这说明外源
基因N S 3CE 已经在转基因番茄的转录水平表达
(图 4)。
图 4　转基因番茄总RNA 的RT 2PCR 扩增结果
F ig. 4　RT 2PCR analysis of to tal RNA of transgenic tom atoes
1. ΚDNA E coR I2H ind III M arker; 2, 8. RT 2PCR p roducts of
to tal RNA of transfo rm ant A and B (N S 3) ; 3, 9. RT 2PCR
p roducts of to tal RNA of transfo rm ant A and B (CE ) ; 4, 10.
RT 2PCR p roducts of to tal RNA of transfo rm ant A and B
(N S 3CE ) ; 5, 11. CK, PCR resu lts of to tal RNA of transfo r2
m ant A and B (no N S 3) ; 6, 12: CK, PCR resu lts of to tal RNA
of transfo rm ant A and B (no CE ) ; 7, 13: CK, PCR resu lts of
to tal RNA of transfo rm ant A and B (no N S 3CE ).
3　讨论
利用转基因植物生产疫苗, 预防和控制病毒性
疾病是普遍有效的, 但目的基因的选择是非常重要
的。丙型肝炎病毒基因具有异质性特点, 即不同
HCV 株及同一株 HCV 在不同分离时间其核苷酸
序列具有一定的变异。但在整个基因组中, 有的区段
是比较保守的, 并且免疫原性比较好, 如: C 区和
N S 3 区[ 11 ]。E 区是相对变异较大的区段, 但同时又
是中和性抗原表位的所在[ 12 ] , 而我国两株 (河北株
和上海株) H CV 基因虽有变异, 但总变异率很低,
263 　　　作　　物　　学　　报 29 卷　

E 2 区基因变异稍高[ 13 ] , 所以本研究选择 E 1 区基因
全序列 (0157kb)和 E 2 区中免疫原性较好的 5’端的
一段序列 (012kb) , 作为目的基因。
根据相关资料, 融合基因N S 3CE 表达的重组
蛋白兼具有N S 3 和 CE 抗原的反应活性, 抗 HCV
阳性检出率等于N S 3 和 CE 抗原联合应用的阳性
检出率[ 14 ]。本研究用N S 3CE 融合基因转化番茄, 希
望能得到兼具有N S 3 和CE 抗原活性的重组蛋白。
在两段基因之间加入连接肽 SPGS 的密码子序列,
期望连接肽中脯氨酸的“转角”效应和甘氨酸的无侧
链基团的“柔软”效应, 阻止CE 基因对N S 3 基因的
构型影响, 利于融合蛋白的抗原稳定性, 从而更有利
于融合蛋白的表达[ 15 ]。
应用农杆菌介导的方法进行植物遗传转化, 其
效率的高低与农杆菌菌株的选择有关[ 16 ]。烟草是转
基因研究的模式植物, 对它的遗传性状了解较多, 作
为外源基因表达的受体已有很多报道, 如 H B sA g
基因、L T 2B 基因和 sp aA 基因[ 17 ]等都得到了成功
表达。实验证明烟草作为外源基因表达系统所表达
的重组蛋白能够正确装配, 并具有特定的生物活性,
但烟草含有尼古丁等有害人体健康的生物碱, 这增
加了重组蛋白提纯的难度。为解决这一问题, 生物学
家开始着眼于利用转基因植物来生产, 口服疫苗, 这
样无需经过加工提纯和冷藏保存, 使用方便, 成本较
低, 易被接受。但对于某些必须经热加工方可食用的
植物, 如马铃薯, 在烹调过程中会破坏其中疫苗的有
效成分, 从而降低或破坏免疫效果。本实验把目的基
因转到人类可直接食用的蔬菜——番茄中并得到表
达, 期望人们在食用转基因番茄的同时, 便可获得口
服免疫。
从转基因番茄到口服疫苗还有很长的一个过
程, 有许多问题需要解决, 如: 外源基因的表达量; 口
服过程中的免疫效果; 转基因番茄后代中外源基因
的稳定表达等问题。更由于 H CV 基因的异质性特
点以及它的天然敏感动物只是昂贵的黑猩猩, 所以
研制HCV 口服疫苗有着更大的困难。但是, 随着人
们在植物基因工程领域取得的长足进展, 使我们有
理由相信, 采用转基因植物生产基因工程疫苗的研
究必将为各种廉价疫苗的生产和应用开拓更广阔的
前景。
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