全 文 ：第26卷 第2期 作　物　学　报 V o l. 26, N o. 2
2000 年3月 A CTA A GRONOM ICA S IN ICA M ar. , 2000
丙肝病毒融合抗原基因导入烟草叶绿体及转化株同质化的研
究
山　松1　张中林1, X 　吴祥甫2　沈桂芳1,XX
(1中国农业科学院生物技术研究中心, 北京, 100081; 2 中国科学院上海生物化学研究所, 上海, 200031)
提　要　植物生物反应器的研究已成为当前基因工程领域的一个新生长点。本实验用 PCR 方法, 从丙
型肝炎病毒 cDNA 文库中克隆了非结构N S3区基因片段及核心抗原C 区基因片段, 并在两段基因间加
入连接肽 SPGS 的密码子序列, 构建成融合抗原基因N S32C。将该融合基因转入烟草叶绿体转化及表
达载体中, 通过基因枪转化法得到转基因植株。对N S32C 融合基因转化植株进行 PCR 及 Sou thern 杂
交试验分析, 证明外源基因已整合到烟草叶绿体基因组中; 对转化植株的 Sou thern 杂交试验还表明,
通过不断地分化筛选培养, 可以提高转化植株的同质化水平。
关键词　丙型肝炎病毒; 融合抗原基因; 烟草; 叶绿体表达体系; 同质化
A Ch im er ic An tigen Gene of Hepa tit is C V irus wa s In troduced in to
Chloropla st of Tobacco & the Study of Tran sgen ic Plan t Hom ogen iza -
t ion
SHAN Song1　ZHAN G Zhong2L in1　W U X iang2Fu2　SH EN Gu i2Fang1
(1 B iotechnology R esearch Cen ter, Ch inese A cad emy of A g ricu ltu ra l S ciences, B eij ing , 100081; 2 S hang ha i Institu te of B io2
chem istry , Ch inese A cad emy of S ciences, S hang ha i, 200031)
Abstract　Spect inom ycin2resistan t ca lli and shoo ts w ere ob ta ined from tobacco leaves bom 2
barded w ith pSS3 DNA w h ich con ta in s the N S32C ch im eric an t igen gene of hepat it is C viru s.
Fu rther m o lecu lar screen ing on the tran sfo rm ed tobacco p lan ts such as Sou thern b lo t and
PCR am p lifying w ere perfo rm ed, w h ich ind ica ted tha t fo reign gene had been in tegra ted in to
the ch lo rop last genom e. A nd Sou thern b lo t a lso show ed tha t the hom ogen iza t ion degree w ill
increase after repea ted ly selected on spect inom ycin m edium. A ll of the above resu lts show ed
tha t stab le tobacco ch lo rop last genet ic t ran sfo rm at ion system had been estab lished, w h ich
p rovided a new w ay fo r p lan t engineering.
Key words　H epat it is C viru s; Ch im eric an t igen gene; Ch lo rop last exp ression system ; B i2
o list ic t ran sfo rm at ion; Hom ogen iza t ion
由于成本低廉、安全性好、使用方便等诸多有利因素[ 1 ] , 植物生物反应器日益受到越来
越多分子生物学家的关注。把现代医学分子生物学与现代农业生物技术相结合, 创造出新一
代的具有医用价值及保健功能的农作物已成为国内外科学家研究的热点。目前在转基因植物
中已成功表达了人抗体蛋白、人生长激素、白细胞介素- 2、干扰素、人血清蛋白、人血红蛋
白、胰岛素、人表皮生长因子、不耐热肠毒素 (L T )、乙肝表面抗原等多种具有药用价值的蛋
X
XX 通讯联系人
收稿日期: 1998211230, 接收日期: 1999206218
浙江大学生物科学与技术系博士研究生

白基因。本实验利用植物中特有的细胞器叶绿体作为转化受体, 将人类丙型肝炎病毒的融合
抗原基因转入其中, 以期获得有医用价值的蛋白产物。实验中进一步完善了烟草叶绿体遗传
转化体系, 为解决叶绿体基因工程中最关键的同质化问题进行了探索和研究。这个实验结果
在国内尚属首次报道。
1　材料与方法
1. 1　材料
1. 1. 1　菌株和质粒　　大肠杆菌 (E scherich ia coli) 菌株DH 5A、质粒 pB luescrip tSK (M 13)、
pTRV、pSS1为本室保存, 质粒 pTRV 上克隆有烟草叶绿体同源片段 trnK2p sbA 2trnH 基因
(长3. 2 kb) , 质粒 pSS1上克隆有 aadA 基因表达盒及多克隆位点; 质粒 pH F 由中国科学院上
海生物化学研究所吴祥甫研究员惠赠。质粒 pH F 上克隆有HCV cDNA 基因组。
1. 1. 2　植物材料　　大烟草 (N icotiana tabacum )中国农科院烟草所提供。
1. 1. 3　工具酶及分子生物学试剂　　各种限制性内切酶、K lenow 酶、T 4DNA ligase、
T 4DNA po lym erase、T aq DNA po lym erase、Sou thern 杂交试剂盒等均购自美国 P rom ega 公
司, DNA 回收试剂盒购自 C lon tech 公司, 其它各种试剂均为进口或国产分析纯试剂, 同位
素A232 P2dA T P购自北京亚辉生物工程公司。
1. 1. 4　引物合成　　根据丙肝基因组序列设计如下引物:
引物1: 5′—GGGAA GCT TA T GGCTCTA GA GCCGGCT GCA TA T
　　　　 　　　　　　H ind¸
引物2: 5′—T TA CA GA TCTAA GCT GAAA TCGA CT GT
　　　 　　　　　　　　Bgl˚
引物3: 5′—CCGGGA TCCGucuccggguucuA T GA GCA CGAA TCCTAAA C
　　　　　　　　　　Bam H É
引物4: 5′—CTA GTCGA CTA T TA GGCT GA CGCGGGCA CGGT
　　　　　 　　　　　SalÉ
注: 引物由美国Cybersyn 公司合成, 小写部分为连接肽 SPGS 的密码子序列。
1. 2　方法
1. 2. 1　质粒提取、DNA 片段克隆、重组质粒鉴定等均参照 Sam b rook 等分子克隆方法[ 2 ]
1. 2. 2　DNA 片段回收采用C lon tech 公司回收试剂盒, 并按其说明书进行操作
1. 2. 3　基因枪转化参照邹竹荣等方法[ 3 ]
1. 2. 4　转基因植株的同质化　　转化后的叶片在选择分化培养基上长出绿芽, 继成小苗后,
又将其叶片切割, 再置于选择分化培养基上分化培养。重复此过程不断筛选以提高其同质化
程度。
1. 2. 5　转基因植株的分子检测
1. 2. 5. 1　烟草叶绿体DNA 的提取参照 J ian2w ei L iu [ 4 ]的方法并加以改进。
1. 2. 5. 2　PCR 扩增: PCR 试剂盒购自美国 P E 公司, 使用 P E 480PCR 仪, 采用标准 PCR
程序, 以烟草叶绿体DNA 为模板, 用上述引物进行扩增, 电泳观察。
1. 2. 5. 3　随机引物法制备 A232P 标记的DNA 探针。尼龙膜为Am ersham 公司产品, 参照其
产品使用指南对烟草叶绿体DNA 进行 Sou thern 杂交。
441　　　　　　　　　　　　　　　　　作　　物 　　学　　报　　　　　　　　 　　　　　　　　26卷

2　结果与分析
2. 1　烟草叶绿体转化载体 pSS3的构建
2. 1. 1　丙肝病毒N S32C 区融合基因的构建　　用引物1和2, 以质粒 pH F 为模板 PCR 扩增
出丙肝基因N S3区0. 7 kb 片段, 经H ind¸ 酶切, 插入到 pU C119的H ind¸ 、P st É (补平) 位
点, 构建成测序载体 pU C2N S3, 测定其序列; 用引物3和4, 以质粒 pH F 为模板 PCR 扩增出
丙肝基因C 区0. 6 kb 片段, 经 SalÉ 、B am H É 双酶切, 插入到 pU C119的相同位点, 构建成
测序载体 pU C2C, 测定其序列。选取序列正确的 pU C2N S3、pU C2C 质粒克隆, 将 pU C2C 质
粒用Bam H I、SalÉ 双酶切后插入 pU C2N S3的B g l˚ 、S a l É 位点, 构建成丙肝融合基因质粒
pN S32C。pN S32C 质粒中间有连接肽 SPGS 的密码子序列。
2. 1. 2　烟草叶绿体转化载体 pSS3的构建　　质粒 pN S32C 经 H ind ¸ 、S a l É 双酶切切下
N S32C 结构基因部分插入质粒 pSS1上的H ind¸ 、S a lÉ 位点, 构建成质粒 pSS2。质粒 pSS2经
B am H I 酶切切下 aadA 基因表达盒和N S32C 基因表达盒插入质粒pTRV 上的Bgl˚ 位点, 构
建成完整的丙肝N S32C 融合基因烟草叶绿体转化及表达载体 pSS3。pSS3包含有烟草叶绿体
基因组同源片段 trnH 2p sbA (2. 2 kb) 和 trnK (1. 0 kb) 及 aadA 基因表达盒、N S32C 融合基因
表达盒, 如图1所示。
图1　烟草叶绿体转化载体 pSS3结构图
F ig. 1　Construction diagram of p lasm id pSS3 fo r tobacco p lastid transfo rm ation
2. 2　基因枪转化烟草叶绿体及转化植株的筛选和再生　　用包裹有 pSS3质粒的金粉子弹轰
击烟草无菌苗叶片, 把轰击后的叶片于M S 培养基培养1周后切成0. 5 cm ×0. 5 cm 大的小块,
放于M S 选择分化培养基 (Spc 500 m g ö L、62BA 1. 5 m g ö L、IAA 0. 15 m g ö L )中, 约两周后小
叶块逐渐失绿变白, 并且膨大至原来的3～ 4倍。继续生长1～ 2个月 (其间不断更换选择分化
培养基, 以维持选择压) 后, 有些叶块边缘长出绿色小芽, 待小芽稍大后切下, 转入新的M S
选择培养基中继续生长, 约1～ 2周后小芽长成幼苗, 把幼苗转入M S 选择生根培养基 (Spc
500 m g ö L ) 中使其生根, 后经过炼苗移入温室盆载。该质粒共打15枪, 最终得3株幼苗, 转化
率为0. 2株ö 枪。
2. 3　转基因植株的同质化　　本实验中得到的3个转化子在抗性培养基上筛选培养, 其中1
号绿色均匀、长势良好, 2号、3号在生长的不同阶段会分化出白芽, 可能外源基因的整合和
表达还不稳定。为了探索提高转化子同质化水平的方法, 本实验利用1号转化子进行多代分
化筛选培养 其中基因枪转化后分化出的原始苗称为A , A 的叶片切割后在分化培养基上
长出的第二次分化苗称为B , B 的叶片切割后在分化培养基上长出的第三次分化苗称为 C。
用 Sou thern 杂交试验可观察不同代转化苗同质化水平的差异。
2. 4　转基因烟草的 PCR 检测　　取10 g 转基因烟草幼苗叶片, 提取叶绿体DNA , 用引物1
和引物4对叶绿体DNA 进行 PCR 检测。以质粒 pSS3为阳性对照, 结果如图2所示, 3个转化
子均可见到1. 3 kb 的基因片段, 此片断的长度与N S32C 基因的阳性对照一致, 而野生型对照
5412期　　　　　山　松等: 丙肝病毒融合抗原基因导入烟草叶绿体及转化株同质化的研究　　　　　　　

则无, 可初步确定外源基因已导入叶绿体中。
2. 5　转基因植株的 Southern 杂交试验
2. 5. 1　以N S32C 基因片段为探针的 Sou thern 杂交试验　　用 H ind ¸ 、S a l É 双酶切质粒
pSS3, 回收1. 3 kb 的N S32C 基因片段作模板标记探针, 叶绿体DNA 同样经H ind¸ 、S a l É
双酶切后转移做杂交反应。分化苗A、B、C 均可看到1. 3 kb 的杂交条带 (图3) , 而野生型烟
草对照则无此条带, 说明外源基因已转入烟草叶绿体中。由于上样前DNA 已被定量, 我们
还可以发现随着A、B、C 不断筛选, N S32C 基因的相对含量也在不断提高。
图2　转化子的 PCR 检测
F ig. 2　PCR analysis of transfo rm ed p lan ts
1: Spp IDNA ö EcoR IM arker; 2: p lasm id pSS3;
3: CK (untransfo rm ed p lan t) ;
4～ 6: tobacco p lastid transfo rm ed p lan ts N o. 1～ 3
图3　以N S32C 为探针的 Southern 杂交试验
F ig. 3　Southern b lo tt ing of transfo rm ed
p lan ts p robed w ith N S32C gene
1: p lasm id pSS3; 2: CK (untransfo rm ed p lan t) ;
3～ 5: tobacco p lastid transfo rm ed p lan ts N o. A～C
2. 5. 2　以同源片段 trnK 为探针的 Sou thern 杂交试验　　以1. 0 kb 的同源片段 trnK 基因为
探针进行杂交, 被检测的烟草叶绿体DNA 经B am H I、N si I 双酶切, 野生型烟草应杂交出1. 7
kb 的条带 (图4A ) , 完全同质化的转化子DNA 应杂交出4. 8 kb 的条带 (图4 B )。
图4　烟草叶绿体DNA 酶切 Southern 示意图
F ig. 4　Schem atic diagram of ch lo rop last DNA from tobacco
Sou thern 杂交结果见图5。从图中可以看出, 1号转化子的不同批分化后代A、B、C 均含
有大量未被重组的野生型基因1. 7 kb 条带。其中B、C 可能由于酶切不完全在相邻位置还有
一条带。A、C 均可见4. 8 kb 的重组型条带, 在B 中隐约可见。C 中重组型条带的含量明显高
于A 和B , 结合前面 Sou thern 实验N S32C 基因的相对含量呈A、B、C 递增分布的结果, 可
以认为在抗性培养基上反复分化筛选, 能逐步提高转化子中外源基因的同质化程度。
641　　　　　　　　　　　　　　　　　作　　物 　　学　　报　　　　　　　　 　　　　　　　　26卷

图5　以 trnK 为探针的 Southern 杂交试验
F ig. 5　Southern b lo tt ing of transfo rm ed
p lan ts p robed w ith trnK gene
1: CK (untransfo rm ed p lan t) ; 2～ 4: tobacco p lastid
transfo rm ed p lan ts N o. C～A ; 5: p lasm id pSS3
3　讨论
烟草叶绿体作为外源基因的表达体系, 用来表
达一些动物来源的蛋白, 在国内外都是一个新领
域。由于该转化技术具有表达量高、性状稳定快、
分子操作容易、安全性好等特点[ 5 ] , 为此本实验尝
试将丙肝病毒融合抗原蛋白基因转入烟草叶绿体
中, 为将来能在各种绿色蔬菜的叶绿体 (如黄瓜、青
菜、牧草等) 中表达抗原蛋白, 进而制成人、禽畜等
的口服疫苗及检测试剂打下基础。
本实验通过 PCR 方法, 获得 HCV 2N S3 (0. 7
kb) 和 HCV 2C (0. 6 kb) 两个抗原基因片段, 并构建
了融合基因N S32C 的烟草叶绿体表达载体, 应用本实验室建立的烟草叶绿体转化体系, 获得
了转基因烟草。本实验中测得的转化效率为0. 2株ö 枪, 小于M aliga 实验室的1株ö 枪[ 6 ] , 分析
其原因可能是由两方面的差异造成的。其一, M aliga 所用转化质粒 pZS197的同源片段长度
分别为1. 55 kb 和1. 29 kb, 两者都大于1 kb 且长度较为接近, 用作同源重组非常合适; 而本
实验中质粒 pSS3的同源片段长度分别是2. 2 kb 和1. 0 kb, 两者的长度相差一倍以上, 且1. 0
kb 的同源片段比最佳长度可能要短些[ 7 ]。其二,M aliga 所用转化质粒 pZS197为7. 1 kb, 而本
实验的转化载体质粒较大, 约9. 5 kb, 操作过程中容易断裂而破坏目的基因, 导致转化频率下
降。
同质化问题一直是困扰叶绿体基因工程的首要问题, 尤其在高等植物中。由于高等植物
细胞内含有多个叶绿体, 每个叶绿体又含有多个叶绿体基因组, 所以当某个细胞的叶绿体被
转化后, 如果外源基因不能在叶绿体基因组内通过重组占明显优势直至完全同质化, 这种转
化将很少有应用价值。因为在培养中这种叶绿体基因组嵌合体植株后代会发生分离, 造成外
源基因丢失。本实验通过转化子在抗性培养基上反复筛选, 能较明显地看到转化子同质化程
度的提高。由于时间的限制, 本实验中转化子的分化筛选只进行了两次, (A →B , B→C, 共
约40天左右) , 同质化程度还很低。如果能不断在分化培养基上筛选, 预计半年到一年时间同
质化程度将达到很高甚至完全同质化。与此相比, 核转化植株可能要花费3～ 5年或更长时间
才能使外源基因稳定遗传。关于转化植株中外源基因的表达情况, 将于今后实验进行进一步
分析。
参　考　文　献
1　范国昌, 山松, 沈桂芳等. 遗传, 1998, 20 (1) : 42～ 44
2　Sam brook J , F ritsch E F, M aniatis T. Cold S p ring H arbor P ress. N ew Yo rk, U SA , 1989
3　邹竹荣, 张中林, 沈桂芳等. 作物学报, 1998, 24 (4) : 410～ 415
4　J ian2w ei L iu. P lan t M olecu lar B iology R ep orter, 1993, 11 (1) : 48～ 53
5　任延国, 邹竹荣, 沈桂芳等. 农业生物技术学报, 1997, 5 (1) : 47～ 53
6　M aliga P. T ibtech , 1993, 11: 101～ 107
7　E rick son J M. In: O rt D R , Yocum C F eds. O xy g en ic P hotosy n thesis: T he L ig h t R eactions, 1997, 589～ 619
7412期　　　　　山　松等: 丙肝病毒融合抗原基因导入烟草叶绿体及转化株同质化的研究