全 文 ：生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN·研究报告· 2009年第 1期
收稿日期：2008-07-09
基金项目：国家 973 计划项目（2002CB111300）
作者简介：刘慧娟（1977-），女，博士研究生，研究方向：分子生物学；Tel：027-87792271，E-mail：liuhuijuan77@yahoo.com.cn
通讯作者：何光源（1958-），男，教授，博士生导师，研究方向：植物分子生物学；Tel：027-87792271，E-mail：guangyuan.he@bbsrc.ac.uk
八氢番茄红素是合成类胡萝卜素的重要前体，
而类胡萝卜素是维生素 A 重要的前体之一 [1]，类胡
萝卜素在猝灭自由基 [2]、增强人体免疫力 [3]、预防心
血病和防止癌症发生 [4]等人体健康方面都有重要的
作用。 维生素 A 摄入不足会导致夜盲及眼球干燥
等症状，甚至导致失明。 人体自身不能合成类胡萝
卜素，主要依赖饮食中的供应 ，但类胡萝卜素在食
品中的含量不丰富。虽然部分类胡萝卜素已经可以
通过工业化生产合成 ，但是种类有限，市场占有份
额少，仍然无法满足人们的需求，随着类胡萝卜素
合成途径中各种酶的相继被分离鉴定， 运用 DNA
重组技术与遗传工程提高天然食品中的类胡萝卜
素含量成为获得维生素 A 的另一有效途径。 世界
上主要粮食作物的食用部分胚乳组织中类胡萝卜
素含量几乎为零，因此通过遗传工程在食用部分胚
乳组织中合成类胡萝卜素，使之成为新的维生素 A
源具有极其重要的意义。
噬夏孢欧文氏菌（Erwinia uredovora）crtB 基因是
种子特异性表达噬夏孢欧文氏菌 crtB基因的植物
表达载体构建
刘慧娟 郎君 冯志国 何光源
（华中科技大学生命科学与技术学院 分子生物物理教育部重点实验室，武汉 430074）
摘 要： 利用 PCR技术扩增出 tp和 crtB基因，胶回收后分别连接到 pMD18-T载体测序。 tp和 crtB基因经酶切回
收后通过 pBlue-script KS 质粒连在一起构建成 pSK-tp-crtB，通过 BamHⅠ和 SacⅠ酶切，从 pSK-tp-crtB 载体上切下目的
基因片段 tp-crtB，替换 pBI121-napA载体中的 GFP 基因，构建了 tp-crtB 基因在植物种子中特异性表达的载体 pBI121-tp-
crtB。转化至大肠杆菌感受态细胞 DH5α。测序鉴定后将阳性质粒转化农杆菌感受态细胞 EHA105，经菌液和质粒 PCR分
析，获得了真核表达载体 pBI121-tp-crtB，为 crtB基因功能的进一步研究奠定基础。
关键词： crtB基因 根癌农杆菌 遗传转化 植物表达载体
Construction of Plant Expressing Vector Containing crtB Gene
from Erwinia uredovora
Liu Huijuan Lang Jun Feng Zhiguo He Guangyuan
（Key Laboratory of Molecular Biophysics，Ministry of Education，Huazhong University of Science and
Technology HUST，Wuhan 430074）
Abstract： Both crtB and tp gene were amplified by PCR and cloned into pMD18-T vector respectively. The
pMD18-tp and pMD18-crtB were digested and the crtB and tp gene were linked together by the pBlue-script KS
vector. By digestion of pSK-tp-crtB and pBI121，the GFP gene in pBI121 was replaced with tp-crtB gene. The plant
expression vector pBI121-tp-crtB was obtained，which was transformed into the E. coli component DH5α. The
expressing vector was identified by sequencing and then transformed into Agrobacterium tum efaciens EHA105，which
was constructed successfully by PCR identification. Therefore the construction of recombinant pBI121-tp-crtB plant
expression vector provides a basis for the research on functions of crtB gene.
Key words： CrtB gene Agrobacterium tumefaciens Genetic transformation Plant expression vector
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2009年第 1期
编码八氢番茄红素合成酶 [5]。 前人对 crtB 基因的研
究主要集中在对其原核表达纯化方面 [6~8]。 构建了
crtB 基因真核表达载体，并引入油菜的种子特异表
达启动子 napA 和豌豆导肽基因 tp， 为在种子中合
成类胡萝卜素奠定了坚实的基础。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 菌株和质粒 大肠杆菌（Escherichia coli）D
H5α、根癌农杆菌 （Agrobactrium tumefaciens）EHA105
及 pBlue-script KS、 植物表达载体 pBI121-napA 为
本实验室保存。 pMD18-T载体购于大连宝生物公司。
pYPIET4 来自于 Dr. Misawa（Kirin Brewery，Japan）、
pACCRT-EB 来自于 Dr. Sandmann（Germany）
1.1.2 酶与化学试剂 KpnⅠ 、PstⅠ 、NdeⅠ 、Sac
Ⅰ、BamHⅠ限制性内切酶 ，TaqDNA 聚合酶 ，dNTPs
均购于大连宝生物公司，T4 DNA 连接酶购于 NEB，
胶回收试剂盒购于华舜和 OMEGA， 质粒提取试剂
盒购于上海生工 ，DNAMarker 购于 QIAGAN。 引物
设计和测序由北京奥科公司完成。
1.2 方法
1.2.1 引物设计与合成 依据 tp 基因序列设计了
一对克隆引物 ， 其中在下游引物的 5′端引入 Nde
Ⅰ酶切位点。 上游引物 Tp F：ATGGCTTCTATGATAT
CCTCTT；下游引物 Tp R：AAACATATGGCACTTTAC
TCTTCCACCAT。
根据噬夏孢欧文氏菌 crtB 的基因序列，设计了
一对克隆全长 crtB 基因引物， 其中在上游引物的
5′端引入 Nde Ⅰ酶切位点 ， 下游引物的 5′端引入
Sac Ⅰ酶切位点。 上游引物 crtB F：5′-AAACATATG
GCAGTTGGCTCG-3′；下游引物 crtB R：5′-AAAGAG
CTCCTAGAGCGGGCGCTGCCAGA-3′。
1.2.2 tp 和 crtB 基因的克隆 PCR 扩增反应条件：
以质粒 pYPIET4 为摸板 ，94℃预变性 5 min；94℃变
性 30 s、55℃退火 30 s、72℃延伸 30 s，30 个循环 ；
最后 72℃延伸 10 min。 扩增 tp 基因。 以质粒 pAC
CRT-EB 为摸板。 94℃预变性 5 min；94℃变性 30 s、
55℃退火 30 s、72℃延伸 60 s，30 个循环；最后 72℃
延伸 10 min，扩增 crtB 基因。
PCR 产物用凝胶回收试剂盒回收，与 pMD18-T
载体连接。 挑取白色菌落，用质粒提取试剂盒抽提
质粒， 用 KpnⅠ、Pst Ⅰ和 Nde Ⅰ 、SacⅠ 双酶切鉴
定并测序 。 重组质粒分别命名为 pMD18-T-tp 和
pMD18-T -crtB。
1.2.3 tp 和 crtB 基因的连接 pMD18-T-tp 和 pBlue-
script KS 经限制性内切 KpnⅠ和 Pst Ⅰ消化后 ，从
胶中回收 tp 基因 217 bp 和 pBlue-script KS 2 900 bp
片段，经 T4 DNA 连接酶连接，对重组质粒进行酶切
和测序鉴定， 命名为 PSK-tp。 pSK-tp 和 pMD18-T-
crtB 经限制性内切酶 Nde Ⅰ和 SacⅠ消化后， 从胶
中回收 2 057 bp 和 897 bp 片段，经 T4 DNA 连接酶
连接， 对重组质粒进行酶切和测序鉴定 ， 命名为
pSK-tp-crtB。
1.2.4 植物表达载体构建和鉴定质粒 pSK- tp-
crtB 和 pBI121 经限制性内切酶 BamHⅠ和 Sac Ⅰ
消化后 ，从胶中回收 1 100 bp 和 12 kb 片段 ，经 T4
DNA 连接酶连接， 对重组质粒进行酶切和测序鉴
定， 命名为 pBI121- tp-crtB。 重组质粒 pBI121- tp-
crtB 用电击法转化根癌农杆菌 EHA105（Rifr）感受
态细胞，在含有利福平（100 mg/L）和卡那霉素（100
mg/L） 的 YEB 平板上筛选阳性克隆并提取质粒及
用 BamH Ⅰ和 Sac Ⅰ双酶切鉴定，同时进行 PCR 鉴
定。
2 结果与分析
2.1 PCR 扩增 tp、crtB 基因和 pMD18-tp、pMD18-
crtB 重组质粒的构建
以 pYPIET4 质粒为模板，扩增出一条约 180 bp
的亮度很高的特异条带，与预期片断大小相符 （图
1）。以 pACCRT-EB质粒为模板，扩增出一条约 912 bp
的亮度很高的特异条带，与预期片断大小相符 （图
2）。 PCR 产物回收后与 pMD18-T 载体连接构建重
组质粒 pMD18-T-tp 和 pMD18-T-crtB。
2.2 tp 和 crtB 基因的连接
pMD18-T-tp 和 pBlue-script KS 质粒经 KpnⅠ和
Pst Ⅰ双酶切后得到长约 2 900 bp 的 pBlue-script
KS 载体片段和长约 217 bp 的 tp 基因片段（图 3），
胶回收后经 T4 DNA 连接酶连接构建成 PSK-tp 重
组质粒。 pSK-tp 和 pMD18-crtB 质粒经经限制性内
切酶 Nde Ⅰ和 SacⅠ双酶切后得到长约 2 057 bp
的 pSK-tp 载体片段和长约 897 bp 的 crtB 基因片段
（图 4）， 胶回收后经 T4 DNA 连接酶连接构建成
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pSK-tp-crtB 重组质粒。
2.3 植物表达载体构建
pSK-tp-crtB 和 pBI121-GFP 质粒经经限制性内
切酶 BamHⅠ和 Sac Ⅰ双酶切后得到长约 12 000
bp 的 pBI121 载体片段和长约 1 090 bp 的 tp-crtB
基因片段 （图 5），胶回收后经 T4 DNA 连接酶连接
构建成 pBI121-tp-crtB 重组质粒。 农杆菌中重组质
粒提取难度大， 所以采用了菌液 PCR 和质粒 PCR
联合检测的方法（图 6），简易的 PCR 以作为植物表
达载体是否导入农杆菌的依据。
3 讨论
自第一例转基因烟草的出现起，转基因技术取
得了飞速的发展，如今它不再仅仅是传统育种的辅
助手段， 而成为植物生物技术和品种改良的核心。
在众多转化方法当中， 农杆菌介导法以机理明确、
操作简单、费用低廉等独特优点成为植物遗传转化
的首选。
图 1 PCR 扩增 tp 基因结果
M.DNA marker；1.tp 基因
图 2 PCR 扩增 crtB 基因结果
M.DNA marker；1.crtB 基因
图 3 pMD18-tp 和 pBlue-script KS 经限制性内切
KpnⅠ和 Pst Ⅰ消化
M.DNA marker；1.pBlue-script KS；2.pMD18-T-tp
图 4 pSK-tp 和 pMD18-T-crtB 经限制性内切酶
Nde Ⅰ和 SacⅠ消化
M.DNA marker；1.pMD18-T-crtB；2.pSK-tp
图 5 pSK-tp-crtB 和 pBI121-GFP 经限制性内切酶
BamHⅠ和 Sac Ⅰ消化
M.DNA marker；1.pSK-tp-crtB；2.pBI121-GFP
刘慧娟等：种子特异性表达噬夏孢欧文氏菌 crtB基因的植物表达载体构建 93
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2009年第 1期
而增加其遗传稳定性；（4）采用化学，物理或者基因
突变的方法诱变得到其突变菌株。进一步改进和完
善，以期构建出高效、稳定的，能够利用木质纤维素
降解产物生产燃料乙醇的新型工程菌株。
参考文献
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11 RiesenbergD，Schulz V，Knorre WA，et al. Journal of Biotechnology，
1991，20：1727.
!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!
（ 上接第 90页）
因此构建了种子特异性表达噬夏孢欧文氏菌
crtB 基因的植物表达载体 ， 并将其转化到农杆菌
EHA105 中， 为下一步农杆菌侵染植物并在植物种
子中特异性表达八氢番茄红素合成酶蛋白做好了
充分的准备。提高植物种子八氢番茄红素的表达水
平，为在植物种子合成类胡萝卜素奠定了坚实的基
础。
参考文献
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图 6 转化农杆菌菌液及质粒 PCR 鉴定
M.DNA marker；1.pBI121-tp-crtB PCR；2.pBI121-GFP
PCR；3.农杆菌菌液 PCR
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