全 文 ：生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN·研究报告· 2008年第5期
收稿日期:2008-03-10
基金项目:国家948项目基金(2006-G37),2007年农业公益性行业科研专项(nyhyzx07-019),国家高技术研究发展计划863课题(SQ2007AA
10XK140067)
作者简介:郭晋隆(1977-),男,硕士,研究方向:植物分子生物学;E-mail:jl.guo@163.com
通讯作者:陈由强,研究生导师
随着后基因组时代的兴起,蛋白质组学(proteomics)研究成为功能基因组学研究的重要方法与内容,其
3大核心技术分别为双向电泳技术、质谱技术和生物信息学。高分辨率的双向电泳 (twodimensional
electrophoresis,2-DE)技术作为蛋白质组研究的起始与关键技术,包括了第一向等电聚焦(isoelectrofocusing,
IEF)与第二向 SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE),二者分别基于蛋白质等电点和分子质量的不同,从
而达到在二维空间上先后将蛋白质分离的目的。自 OFarel于 1975年建立起双向电泳技术以来,该技术
有了长足的发展,其分辨率和重复性得到了很大提高[1,2]。
甘蔗作为一种重要的经济作物,目前国内外克隆了一些功能基因,开展的蛋白质组学相关研究还很
少。由于甘蔗叶片含有酚、醌及色素等一些次生代谢产物,严重影响了叶片总蛋白的提取、2-D及凝胶染色
等等后续的蛋白质组学分析。采用 IPG等电聚焦为第一向,SDS-PAGE为第二向,建立起了适用于甘蔗叶
片的总蛋白提取与双向电泳分离技术,对甘蔗蛋白质组学研究具有一定的参考价值。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
1.1.1 实验材料 甘蔗品种福农 95-1702,取正一叶,采于国家糖料改良中心福州甘蔗分中心基地。
甘蔗叶片总蛋白提取及双向电泳条件的改进
郭晋隆 1 叶冰莹 1,2 黄庆煌 2 陈由强 1,2 陈如凯 1
(1福建农林大学农业部甘蔗生理生态与遗传改良重点开放实验室,福州 350002;2福建师范大学生物工程学院,福州 350007)
摘 要: 针对甘蔗叶片中含有大量酚类和色素等干扰物质的现象,通过对甘蔗叶片蛋白样品制备、上样量和电泳
条件等方面做了必要改进,建立了一套适用于甘蔗叶片蛋白质组分析的双向电泳(2-DE)方法。
关键词: 甘蔗 蛋白质组 双向电泳
ImprovementofExtractionMethodandTwo-dimensional
ElectrophoresisConditionsforProteomeStudyof
SugarcaneLeaves
GuoJinlong1 YeBingying1,2 HuangQinghuang2 ChenYouqiang1 ChenRukai1
(1KeyLabofEco-physiology&GeneticsImprovementforSugarcane,MinistryofAgriculture,FujianAgricultureand
ForestryUniversity,Fuzhou350002;2BioengineeringColege,FujianNormalUniversity,Fuzhou350007)
Abstract: A2-DE(two-dimensionalelectrophoresis)protocolsuitedfortheseparationofproteinsfrom sugarcane
leaveswasestablished.Proteinsamplepreparation,loadingofsamplesandgelelectrophoresisweremodifiedandimproved
tominimizetheinterferencemarkedlyby1eafpigmentsandothernon-proteinsubstances,thusresultinginsatisfactory
separation.
Keywords: Sugarcane Proteome Two-dimensionalelectrophoresis
2008年第5期
1.1.2 试剂和仪器 IPG缓冲液、CHAPS、IPG覆盖液、IPG干胶条(ImmobilineDryStrip,pH3～10,24cm)等购
自 AmershaPharmacia公司,尿素、甘氨酸、丙烯酰胺、甲叉双丙烯酰胺、过硫酸铵、碘乙酰胺、TrisBase、SDS、
TEMED、DTT均为进口试剂,其余试剂为国产分析纯,所有溶液均用 Miliporewater配制。EtanIPGphor、附
件和 EtanDALTsix、附件及循环水浴等购自 AmershaPharmacia公司。
1.2 总蛋白的制备(三氯乙酸/丙酮沉淀法[3])
取甘蔗叶片 1.5g,按其鲜重的 10%加入水不溶性 PVP,研成粉状后,再加入 10倍体积的-20℃预冷丙酮
(含体积分数为 10%TCA和体积分数为 0.07%的 β-巯基乙醇)。涡旋后静置于-20℃,沉降蛋白过夜;随后在
4℃、30000g离心 20min,弃上清液。重悬沉淀于含 0.07%β-巯基乙醇的等体积冰预冷丙酮溶液里 (1~2
次);离心(4℃,30000g,20min)后真空干燥沉淀,放入-20℃冰箱备用。
1.3 蛋白质含量测定
采用 Ramagli改进的 Bradford法,以蛋白质裂解液为空白,1mg/mlBAS标准蛋白(标准蛋白溶液用蛋白
质裂解液配制)为标准,按参考文献[4]操作,在紫外-可见分光光度计上于 λ=595nm测定用三氯乙酸/丙酮
沉淀法所获得甘蔗蛋白质样品的含量。
1.4 双向电泳(2-DE)试验
1.4.1 水化加样及等电聚焦 取-20℃冻存粉末 25mg,加入 250#l裂解液(8mol/L尿素,4%CHAPS,40mmol/
LTris-base,65mmol/LDTT),超声波裂解 30min(温度控制在 20℃~37℃)后离心(4℃、30000g、20min)取上清
夜,再加入水化缓冲液 (8mol/L尿素,2%CHAPS,
18mmol/LDTT,0.5%IPGbufer,0.002%溴酚蓝),至
终体积为 450#l;选用 24cmIPG胶条(pH3～10),上
样量分别为 900#g与 1300#g;IPG干胶条胶面朝下
放入水化液,覆盖一层矿物油防止等电聚焦时尿素
析出、蛋白氧化及产生冷凝水,置于 EtanIPGphor等
电聚焦仪,重泡胀和等电聚焦在 20℃条件下自动进
行,每根胶条限流 50#A。等电聚焦电泳参数见表 1。
1.4.2 胶条的平衡 将胶条胶面向上置于含 DTT的平衡缓冲液中平衡 15min,然后再置于含碘乙酰胺的
平衡缓冲液中平衡 15~20min,取出后放在湿润的定性滤纸上,以吸去表面多余的液体。
1.4.3 SDS-PAGE 采用 EtanDALTsix(购于 AmershaPharmacia公司)垂直电泳系统,胶的浓度为 12.5%,
(26cm×20cm×1mm),将平衡后的胶条放置于已聚合的聚丙稀酰胺凝胶胶面上,用 6%琼脂糖封顶液封闭排
除气泡。进行第二向 SDS-PAGE电泳,电流 20mA/strip,直至溴酚蓝前沿距离玻璃板下缘 0.5cm时停止电
泳。
1.4.4 考马斯亮蓝染色[5] 电泳后的凝胶立即放入固定液(40%甲醇,10%乙酸)中,至少 30min,可过夜;充
分固定后用 Miliporewater水洗 5min2次;换置考马斯亮蓝染液(10%硫酸铵、10%磷酸、20%甲醇、0.06%考
马斯亮蓝 G250)染色,至少 2h;用脱色液(25%乙醇,8%乙酸)脱去底色或者直接用 Miliporewater脱色,直
到蛋白点清晰为止。
1.4.5 二维凝胶电泳分析 脱色后的双向电泳凝胶用扫描仪 ImageScanner扫描并数字化,再用图像分析
软件 melanie3对数字化的图谱进行分析。
2 结果与讨论
2.1 样品制备
样品制备是双向电泳技术成功的关键(Blackstock和 Weir1999;Rabiloud1996)。三氯乙酸/丙酮沉淀法
是目前最常用的一种方法。甘蔗富含酚和醌类物质以及色素等物质,这些物质对蛋白质 IEF干扰很大,三
表 1 等电聚焦电泳参数
郭晋隆等:甘蔗叶片总蛋白提取及双向电泳条件的改进 113
生物技术通报Biotechnology Buletin 2008年第5期
氯乙酸/丙酮沉淀法虽然可除去色素等物质,但不能有效去除酚和醌类物质,且会导致一些膜蛋白和疏水
性蛋白的丢失。若采用传统脱盐和透析又费时、费力。本试验在传统三氯乙酸/丙酮沉淀法的基础上,采用
高度 Tris和液氮低温抑制蛋白酶的活性,同时直接在在匀浆研磨时加入 10%PVP来吸附酚和醌类物质,方
法简单易行。此外,还可以适量增加裂解液中 CHAPS和硫脲的含量,以增加蛋白质的溶解度[6,7]。
本试验采用 Brad-ford法对提取的蛋白进行定量,用牛血清白蛋白(BSA)制作标准曲线,蛋白浓度在
5!g/!l至 50!g/!l范围内,r=0.9395。采用三氯乙酸/丙酮沉淀法提取蛋白质,在 λ=595nm时,检测出甘蔗蛋
白平均浓度为 6.5!g/!l,其浓度较高,满足双向电泳及后续试验的需要。从电泳结果看,采用该方法各组分
的分离基本没有拖尾现象,横向扩散也很轻微,大小蛋白质组分斑点均清晰可见,分离效果比较理想(图1)。
2.2 蛋白质染色及上样量
蛋白质染色方法主要考马斯亮蓝染色法、金属离子染色法和荧光染料染色法等。考马斯亮蓝与质谱分
析的兼容性好,但灵敏度较低。银染法是金属离子染色法的代表,其灵敏度较高但与的质谱分析的兼容性
差。荧光染料灵敏度高但高昂的价格制约了它在蛋白质组研究中的应用。本试验采用考马斯亮蓝染色法,
通过适当增加蛋白质的上样量来提高低丰度蛋白的检测。适宜于考马斯亮蓝染色法的蛋白上样量在 1mg
左右,上样量过高导致染色时背景掩盖低丰度蛋白质斑点,且上样量越大盐离子浓度也越大,它将直接影
响到等电聚焦的效果。当蛋白上样量为 1300!g蛋白质/IPG胶条(图 2)时效果最佳,经分析约 800个点,而
且各点的分离比较清晰,可以满足 2-DE及后续的质谱分析的需要。
图 1 甘蔗蛋白质 2-DE图谱(上样量 900!g) 图 2 甘蔗蛋白质 2-DE图谱(上样量 1300!g)
2.3 其它
良好的重复性才能最大的保证从蛋白质二维图像中还原到可靠生物学信息。从取材、样品制备、蛋白
定量、IEF、SDS-PAGE、染色、脱色到图像分析,任何一个环节都有可能导致某些蛋白斑点的不匹配。为了尽
可能提高重复性,各个环节的实验条件应尽量一致。
取材上应该选择植物发育程度一致的部位;蛋白质样品的制备步骤要简单、迅速,制作完毕后即用或
分装保存在-20℃。
提高样品中的蛋白浓度从而增加泡涨液(水化缓冲液)的用量,能够使样品得到充分泡涨,第一向电泳
的聚焦效果好。但样品蛋白浓度也不能过高,以不析出结晶为宜,否则亦会影响等电聚焦效果。
保持电泳条件恒定。温度的差异会造成蛋白质斑点的拖尾扩散和染色不均匀或有较深的染色背景。实
验聚焦时 IPGphor保持在 20℃条件下,第二向电泳的温控系统调节温度为 18℃;电泳时间不同也会引起蛋
白斑点迁移,第二向电泳时上槽缓冲液现配现用,下槽缓冲液仅重复 3～4次使用。
参考 文献
1 杨何义,应万涛,钱小红.自然科学进展,2002,12(1):13~17. (下转第125页)
114
2008年第5期
(上接第114页)
!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!
2 OFarelPH.JBiolChem,1975,250:4007～4021.
3 钱小红,贺福初.蛋白质组学:理论与方法[M].北京:科学出版社,2003,52.
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7 朱丽华.植物生理学通讯,1992,28(3):217～2l9.
3 讨论
在小麦品质改良方面,除了以栽培小麦为研究材料之外,以近缘野生物种为研究材料,开发新的种质
资源,已经引起了研究者们的极大兴趣[11]。作为小麦的野生物种,山羊草属除了拥有小麦 D基因组的供体-
粗山羊草之外,还包括 C、M、S、U等基因组,是一个丰富的品质改良基因资源库。可以通过基因工程手段
对这些野生物种进行相关品质基因加以利用以改善小麦品质。
avenin-like基因是近年来在小麦中发现的类似于燕麦储藏蛋白 Avenin的一类新型的蛋白,其高含量
的半胱氨酸残基可能形成分子内二硫键,同时还可能会同其它储藏蛋白分子如高分子量麦谷蛋白亚基
(HMW-GS)、低分子量麦谷蛋白亚基(LMW-GS)以及醇溶蛋白(Gliadin)形成分子间二硫键。从而影响面粉
的加工品质。故 avenin-like基因可以作为改良小麦加工品质的重要候选基因。通过构建胚乳特异性表达载
体,实现 Avenin-like蛋白的过量表达。这将有助于改良小麦的加工品质。
目前还未见在 S基因组中克隆 avenin-like基因的报道。本研究以拟斯卑尔脱山羊草为研究对象,克隆
得到一个新型 avenin-like基因。序列分析表明可能属于一类新的储藏蛋白,因为和其它的储藏蛋白有如下
类似点:首先,它们都含有 N末端信号肽序列,而且序列一致性很高。其次,它们的脯氨酸(P)和谷氨酰氨
(Q)残基的含量都非常高,同时含有保守的“Cys-Cys”结构。第三,avenin-like基因只在发育的胚乳中特异性
表达。第四,avenin-like基因也属于多基因家族。
Southernblot结果显示 avenin-like基因属于多基因家族,这与以前报道的其它储藏蛋白基因很相似[12]。
说明可以通过构建基因文库或者其它手段克隆得到更多的 avenin-like基因家族的其它成员。而且,avenin-
like基因也有可能在其它的小麦近源物种基因组中存在,这些都有待更加深入的研究。
参考 文献
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